Методическая статья

Выражение флуоресцентные синтез белков в мышиных костного мозга-производные дендритные клетки и макрофаги

10.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58081

⸱

30 октября 2018 г.

 ,  ,  , 
1Laboratory of Leukocyte Signalling, Institute of Molecular Genetics of the ASCR, 2Faculty of Science, Charles University, 3Department of Biophysical Chemistry, J. Heyrovsky Institute of Physical Chemistry ASCR

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье мы предоставляем подробный протокол для выражения флуоресцентные синтез белков в мышиных костного мозга, полученных дендритные клетки и макрофаги. Метод основан на трансдукции костного прародителями с ретровирусной конструкции следуют дифференцировку в макрофаги и дендритные клетки в пробирке.

Аннотация

Дендритные клетки и макрофаги являются важнейшим клетки, которые образуют первую линию обороны против патогенов. Они также играют важную роль в инициировании адаптивного иммунного ответа. Экспериментальная работа с этими клетками является довольно сложной задачей. Их численность в органах и тканях является относительно низким. В результате они не могут быть изолированы в больших количествах. Они также являются трудно transfect с cDNA конструкции. В мышиных модели в пробирке дифференциации от предшественники костного присутствии M-CSF для макрофаги или ГМ-КСФ для дендритных клеток можно частично преодолеть эти проблемы. Таким образом можно получить большое количество этих клеток от очень мало животных. Кроме того предшественники костного мозга может преобразованы с ретровирусной векторы нося cDNA конструкции ранних этапах выращивания до их дифференцировку в костного мозга, полученных дендритные клетки и макрофаги. Таким образом ретровиральных трансдукции следуют дифференциации в пробирке может использоваться выразить различные конструкции cDNA в эти клетки. Способность выразить внематочная белки существенно расширяет спектр экспериментов, которые могут быть выполнены на эти клетки, включая живой клетки изображения флуоресцентных белков, тандем очищения для interactome анализа, анализа структуры функция, мониторинг клеточных функций с биодатчики и многие другие. В этой статье мы описываем подробный протокол для антиретровирусного лечения трансдукции мышиных костного мозга, полученных дендритные клетки и макрофаги с векторами, кодирующих белки дневно тегами. На примере двух белков адаптер, OPAL1 и PSTPIP2, мы демонстрируем свое практическое применение в проточной цитометрии и микроскопии. Мы также обсудить преимущества и недостатки этого подхода.

Введение

Миелоидных клеток являются неотъемлемой частью наших защитных механизмов против патогенов. Они способны быстро ликвидировать микробы, а также умирающие клетки. Кроме того они участвуют также в регулировании развития тканей и ремонта и в поддержании гомеостаза1,2,3. Все миелоидных клеток отличить от общих миелоидного предшественники костного мозга. В значительной степени контролируется цитокинов и их различные комбинации4является их дифференциация во многих морфологически и функционально различных подмножеств. Наиболее интенсивно изучали подмножеств миелоидных клеток включают нейтрофильных гранулоцитов, макрофаги и дендритные клетки. Дефекты в любой из этих групп населения приводят к потенциально угрожающих жизни последствий и причиной тяжелой дисфункции иммунной системы в организме человека и мышей1,2,3,5, 6.

В отличие от нейтрофильных гранулоцитов дендритные клетки и макрофаги-резидентов клетки тканей и их обилие в иммунных органов является относительно низким. В результате изоляция и очищение первичных дендритные клетки и макрофаги для экспериментов требующих большое количество этих клеток является дорогостоящей и зачастую невозможно. Для решения этой проблемы, были разработаны протоколы для получения большого количества однородных макрофаги и дендритные клетки в пробирке. Эти подходы основаны на дифференциацию клеток костного мозга мышиных присутствии цитокинов: макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF) для макрофагов и гранулоцитарно макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) или Flt3 лигандом для дендритные клетки7,8,9,10,,1112. Клетки, созданный этим методом часто описаны в литературе, как костного производные макрофагов (BMDMs) и костного мозга, полученных дендритных клеток (BMDCs). Они имеют больше физиологические свойства общего первичного макрофаги или дендритные клетки чем с соответствующими клеточных линий. Другим большим преимуществом является возможность получения эти формы клетки генетически измененных мышей13. Сравнительные исследования между одичал тип клеток и клеток, полученных из генетически измененных мышей часто имеют решающее значение для раскрытия новых функций генов или протеинов интереса.

Анализ локализация внутриклеточных белков в живых клетках требует муфта флуоресцентные метки к протеину интереса в естественных условиях. Чаще всего это достигается путем выражения генетически закодированный фьюжн конструкция состоит из анализируемых белков, сочетании (часто через короткий компоновщика) к флуоресцентный белок (например., Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП))14,15 , 16. выражение дневно тегами белков в дендритные клетки и макрофаги является сложной задачей. Эти клетки обычно трудно transfect трансфекции стандартных процедур и эффективности, как правило, очень низкая. Кроме того transfection является временным, он генерирует клеточного стресса и достигнутые интенсивность флуоресценции не может быть достаточным для микроскопии17. Для того, чтобы получить разумную долю этих клеток с достаточным уровнем экспрессии трансген, инфекции прогениторных клеток костного мозга с антиретровирусной векторов и их последующее дифференцировку в BMDMs или BMDCs стал весьма эффективным подход. Это позволило для анализа белков миелоидного происхождения в их родной среде сотовой, так в стабильном состоянии, или в ходе процессов, которые являются критическими для иммунного ответа как фагоцитоз, иммунологические синапса формирования или миграции. Здесь мы описываем протокол, который обеспечивает стабильное выражение дневно тегами протеинов интереса в мышиных костного мозга, полученных макрофаги и дендритные клетки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все методы, описанные здесь были утверждены Комитетом экспертов по благосостоянию экспериментальных животных Института молекулярной генетики и Академии наук Чешской Республики.

1. Реагент подготовка

  1. Подготовьте аммония хлорид калия (ACK) буфера. Добавить 4.145 g NH4Cl и 0,5 г KHCO3 500 мл ddH2O, а затем 100 мкл 0,5 М Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) и фильтр стерилизации.
  2. Готовят раствор polyethylenimine (PEI). Добавить 0,1 г Пей до 90 мл ddH2O. Помешивая, добавьте 1 M HCl каплям до тех пор, пока pH ниже, чем 2.0. Перемешать до 3 ч до растворения Пей, а затем настроить pH 7.2 с 1 M NaOH. Отрегулируйте громкость до 100 мл с ddH2O и фильтра стерилизации. Сделайте 1-2 мл аликвоты и хранить при температуре от-20 ° C.
    Примечание: После оттаивания, пей может храниться при температуре 4 ° C на срок до 2 недель, но не должны быть вновь заморожены.
  3. Подготовьте supernatants культуры клеток, содержащих M-КСФ или ГМ-КСФ. Эти supernatants можно сделать заранее и хранить в-80 ° C. Чтобы сделать эти supernatants, растут cytokine продуцирующих клеток (J558 ячейки для ГМ-КСФ 18 ) или CMG 14-12 M-CSF 19в 10 см Петри в среде Дульбекко изменение орла (DMEM) с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) до слияния. Затем перенесите все ячейки 200 мл СМИ в колбу T150 тканевой культуры и культуры для дополнительных 4 дней на 5% CO237 ° C. Собирайте супернатант и фильтр над 0.2 мкм фильтром стерилизации. Сделать аликвоты и хранить их на-80 ° C.
  4. Подготовка 100 мл среды культуры клеток: DMEM дополнена 10% тепла инактивированных FBS и клеточной supernatants культуры из клетки секретирующие ГМ-КСФ (для дифференциации BMDC) или M-CSF (для дифференциации BMDM).
    Примечание: Количество цитокинов в этих supernatants может варьироваться и рабочие концентрации должен быть определен эмпирически. Как правило используется супернатант 2-3% от клеточных линий производства GM-CSF (рекомендуемая начальная концентрация составляет 2%) или супернатант 5 – 10% от CMG 14 – 12 клетки, вырабатывающие M-CSF (рекомендуемая начальная концентрация составляет 10%). Кроме того, очищенный коммерчески доступных M-CSF в 10 нг/мл и ГМ-КСФ в 20 нг/мл может использоваться с результаты практически идентичен cytokine содержащих supernatants, т.е., без каких-либо воздействие на темпы дифференциации, инфекции эффективность и внутриклеточных локализация EGFP-тегами конструкций. Антибиотики, включая пенициллин G (100 МЕ/мл), стрептомицин (100 мкг/мл) и гентамицин (40 мкг/мл), параметр может использоваться для клеточной культуры на любом этапе протокола, если не указано иное.

2. производство Retrovirus

Предостережение: Хотя ретровиральных векторов относительно безопасны по сравнению с другими видами вирусных векторов, они по-прежнему представляют потенциальную угрозу безопасности. Таким образом важно работать с особой тщательностью и соответствующие средства защиты и придерживаться всех правил безопасности и юридические требования для работы с вирусных частиц.

  1. Пластина одну ячейку подвеска платины-Эко (Plat-E) упаковка клеток в 10 см Петри и культивировать в 15 мл DMEM, содержащие 10% FBS до 50-60% притока (24 ч). Клетки должны расти в монослое и не должны формировать сгустки в культуре.
  2. Пипетка 20 мкг ретровирусной конструкции (например., конструкция, выражая дневно тегами протеина интереса в векторе pMSCV) и 10 мкг pCL Эко упаковка вектор20 в 1 мл DMEM (без сыворотки и антибиотики) и аккуратно перемешать.
  3. Для второй трубки мкл 75 PEI в 1 мл DMEM (без сыворотки и антибиотиков). Инкубировать 5 мин при комнатной температуре (RT), а затем смешать содержимое обеих трубок и проинкубируйте дополнительные 10 мин на RT.
    Примечание: Добавление pCL-Эко является необязательным. Это кодирование для вирусного рецептора ecotropic и может увеличить титр вируса.
  4. Тщательно заменить средство на клетки Plat-E 8 мл свежего DMEMsupplemented с 2% FBS. Предварительно теплой средой до 37 ° C перед использованием. Не использовать антибиотики в течение трансфекции, так как антибиотиков может снизить эффективность трансфекции.
  5. Тщательно добавить (в каплях) смесь, подготовленный в шаге 2.3 на клетки Plat-E и инкубировать в течение 4 ч при 37 ° C.
  6. После инкубации, Обмен средство на клетки Plat-E для 10 мл подогретым DMEM, содержащие 10% FBS и культивировать клетки для 24 ч при 37 ° C. Во время этой инкубации клетки Plat-E будет производить вирус в средствах массовой информации.
  7. После 24 часов собирать носитель, содержащий ретровирусные частицы из платины эко клеток с помощью пипетки 5 мл и перенести его на 15 мл пластиковых пробирок (= «супернатанта 1», содержащие ecotropic ретровирусные частицы).
  8. Чтобы избежать заражения клеток Plat-E в Вирусный supernatants, спина собранные вирус в 1250 × g 5 мин при 4 ° C. Для достижения наилучших результатов вирус следует использовать немедленно для инфекции.
    Примечание: Аликвоты вируса также может храниться при температуре-80 ° C для последующего использования. Однако это приведет к определенные сокращения в электромеханической эффективности. Избегайте повторяющихся замораживания/оттаивания вируса, так как это приводит к деградации вирус.
  9. Добавить 10 мл подогретым DMEM с 10% FBS-Plat-Е клетки и культивировать для другой 24 ч при 37 ° C.
  10. Повторите шаги 2.7. и 2,8. для получения «супернатанта 2».

3. мышиных костного изоляция клетки

  1. Пожертвуйте мыши с помощью шейки матки вывих или другого утвержденного метода. Спрей мыши с 70% этиловом спирте.
  2. С помощью пинцета и ножницы, удалите кожи, а также часть мышц из задних ног. Осторожно выбить вертлужной впадины от тазобедренного сустава не нарушая бедренной кости. Вырежьте лапы в голеностопного сустава. Спрей кости (бедра, подключенных к голени) с 70% этанола и удалите остальные мышцы с помощью бумажным полотенцем.
  3. Место кости в чашке Петри 5 см, содержащие стерильные фосфатный буфер (PBS) с 2% FBS (PBS-FBS).  Если подготовка более костей, держите Петри на льду до обработки.
  4. Для обеспечения стерильности культивирования, выполните все следующие действия в культуре ткани капюшоном.
  5. Отделите бедренной кости от голени не нарушая концы костей (согнуть в колене, совместные и тщательно вырезать ножницами).
  6. Процесс по одной кости. Отрезать очень небольшая часть эпифизов (примерно 1 – 2 мм) с ножницами удерживая кости в пинцетом.
  7. Используйте иглой 30 G и 2 или 5 мл шприц заполнены с PBS-FBS очистить клетки костного мозга от обоих концов кости в пластиковых пробирок 15мл. Перемещение иглы внутри кости во время промывки для того, чтобы удалить все клетки. Если игла получает забиты, измените его.
    Примечание: Кости следует повернуть от красного до белого во время промывки. Это показывает, что большинство клеток были удалены из кости. Используйте примерно 2-3 мл PBS-FBS на кости.
  8. Центрифуга клетки на 500 g x 5 мин при 4 ° C.
  9. Отменить супернатант и лизируют красных кровяных клеток, resuspending гранулы 2,5 мл буфера ACK для 2-3 мин при комнатной температуре. Во время lysis фильтр клеток костного мозга через стрейнер ячейки 100 мкм в трубу centrifug свежий 15 мл. Восстановите тонус, добавив 12 мл PBS-FBS.
    Примечание: Не превышать 5 мин гипотонический лизис с ACK буфер, чтобы избежать смерти клетки.
  10. Центрифуга сразу на 500 g x 5 мин при 4 ° C.

4. костного дифференцировки клеток в костном производные макрофаги

  1. Ресуспензируйте Пелле клеток костного мозга в DMEM, дополненная 10% FBS и антибиотики (см. Примечание после шаг 1.4. антибиотик концентрации) и подсчитать количество ячеек. Для дифференциации в BM производных макрофагов, пластина 5 – 10 x 106 клеток костного мозга в 10 см не культуры ткани лечение (бактериальный) Петри с 10 мл заранее подготовленные СМИ DMEM сыворотки и M-CSF шаг 1.4.
    Примечание: Выход из клеток костного мозга составляет примерно 4 x 107 неделю 6 – 8-старый C57BL/6J мыши.
  2. Инкубации клеток в инкубатор культуры клеток для 3 дней на 5% CO2, 37 ° C.
    Примечание: В течение первых 2 дней, клетки не выглядят очень важно, как большое количество apoptotic клеток в настоящее время (клетки способны дифференцироваться в миелоидных клеток и неизлечимо дифференцированных клеток).
  3. После 3 дней культуры клеток костного мозга начинает выглядеть жизненно важные и формируются кластеры деления клетки. Уже можно наблюдать первые адэрентных клеток. На данный момент дополнение клетки с свежими цитокина СМИ.
  4. Добавить 10 мл подогретым DMEM СМИ с сывороткой и M-CSF (от шаг 1.4) на каждые 10 см Петри и вернуть его в инкубатор культуры клеток. Существует не нужно удалять старые средства массовой информации во время этого шага.
    Примечание: полностью костного макрофаги продифференцированы после 5-7 дней в культуре. День 6 – 8, где большинство клеток являются приверженцем и Петри блюдо полностью покрыта лучшее время для сбора урожая.
  5. На 5 день учитывать Петри капот культуры клеток и раздвиньте блюдо до тех пор, пока средства массовой информации почти достигает края блюдо. Осторожно извлеките 15 мл СМИ от поверхности ближе к краю, и клетки имеют тенденцию оставаться в середине блюдо. Добавьте такой же объем подогретым СМИ с M-CSF и поместите блюдо обратно в инкубаторе.
    Примечание: Если СМИ будет придыханием медленно и осторожно, почти не клетки теряются. Однако, это также возможно центрифуга без наддува СМИ и добавить клетки обратно к культуре, чтобы убедиться, что не приверженца (т.е., неполно дифференцированных) клетки теряются.
  6. Для экспериментов используются только адэрентных клеток (макрофаги). Урожая клеток, на день 6 или 7, удалите все средства массовой информации и плавающей клетки. Вымойте блюдо с подогретым PBS без сыворотки.
  7. Добавьте 5 мл 0,02% ЭДТА в PBS и Инкубируйте 3 – 5 мин при 37 ° C в инкубатор культуры ткани.
  8. С помощью пипетки 5 мл, удалить ячейки из блюдо эфир PBS-ЭДТА и поместите их в 50 мл пластиковых пробирок с 25 мл ФСБ. При необходимости объединения более блюда.
  9. Центрифуга сразу на 500 g x 5 мин при 4 ° C.
  10. Ресуспензируйте Пелле макрофагов в среде DMEM СМИ и подсчитать количество ячеек. Проверьте выражение макрофагов поверхности дифференциация маркеров (CD11b и F4/80), проточной цитометрии.
  11. Для экспериментов требующих клеток в суспензии, например., поток цитометрии эксперименты, ПЦР или Западный анализ помаркой, напрямую использовать макрофаги. Для экспериментов с приверженцами макрофагов плиты клетки культуры ткани пластины по экспериментальной установки.
  12. Клетки уже полностью продифференцированы. Держите их в средствах массовой информации подходит для предполагаемого эксперимент или в оригинальной рост и дифференцировку СМИ с M-CSF.
    Примечание: Для работы с приверженцами макрофагов, передачи их в новую пластины по крайней мере 6 h перед использованием (идеально на ночь), чтобы разрешить для полного прилегания к новой поверхности. Малая часть плавучих клетки могут быть удалены до эксперимента.

5. костного дифференцировки клеток в костном производные дендритные клетки

  1. Следуйте протокол для BMDMs с конкретных коррективов для BMDCs описано ниже 5.2-5.4.
  2. Ресуспензируйте полученные гранулы клеток костного мозга в DMEMsupplemented с 10% FBS и антибиотики и подсчитать количество ячеек (на следующий шаг 4.1 протокола макрофагов). Для дифференциации в дендритные клетки пластина 1 – 1,5 x 107 клеток костного мозга в 10 см не культуры ткани обрабатываются (бактериальный) Петри в 10 мл заранее подготовленные СМИ DMEM сыворотки и ГМ-КСФ (шаг 1.4.).
  3. Выполните те же шаги выращивания как BMDM протокол (шаги 4.3 – 4.5. макрофагов протокола). Использование DMEM СМИ с сывороткой и ГМ-КСФ вместо M-CSF. Поскольку для BMDCs длиннее время культивирования (обычно 10-12 дней), добавить 1-2 дополнительных кормлений в 3 дня интервалы (путем удаления супернатант и добавления новых СМИ культивирования, как описано в шаге 4.5.).
  4. Эта часть протокола является практически совпадает с соответствующей частью протокола макрофагов (шаги 4.6-4.12. макрофагов протокола). Для экспериментов используйте только адэрентных клеток. День 10-12, собрать клетки, используя ЭДТА рассчитывать и пластины их на новую поверхность. Проверка выражения поверхности дифференциация маркеров дендритных клеток (CD11c +, CD11b + F4/80-) подачей cytometry.

6. производство BMDMs и BMDCs, выражая EGFP-тегами протеин интереса

  1. Ресуспензируйте Пелле клеток костного мозга, полученных в шаге 3.10. в среде DMEM дополнена 10% FBS и антибиотики и подсчитать количество ячеек. Для инфекции, используйте 2 – 5 х 106 клеток БМ на хорошо культуры ткани 6-хорошо лечить пластины.
  2. Пластина клеток в 1 мл подготовленный DMEM СМИ за хорошо, дополнены с M-CSF для дифференциации в BMDMs или ГМ-КСФ для дифференциации BMDCs. Держите клетки для 4-6 ч в инкубатор культуры ткани с 5% CO2 при 37 ° C.
  3. Добавьте 2 мл свеже собранных вируса («супернатанта 1») с Полибрен (12 мкг/мл, конечная концентрация 8 мкг/мл после добавления в клетки).
    Примечание: Замороженные Алиготе супернатант содержащий вирус может также использоваться, но эффективность будет ниже.
  4. Центрифуга пластину на 1250 g x 90 мин при 30 ° C (с медленного ускорения и замедления). Затем Проинкубируйте 4 ч с 5% CO2 при 37 ° C.
  5. Дополнительно: Замените 2 мл средства массовой информации культуры свежие среднего содержащие соответствующих цитокинов (M-КСФ или ГМ-КСФ) и культуры с 5% CO2 при 37 ° C. На второй день удалите 2 мл культуры средств массовой информации и повторить весь инфекции (шаг 6.3 – 6,4) с 2 мл свеже собранных вируса («супернатанта 2»).
    Примечание: Этот шаг может увеличить эффективность инфекции. Улучшение после второй инфекции зависит от типа и целевых белков и в наш опыт может варьироваться от 30% увеличение эффективности для улучшения не на всех.
  6. Сбор не сторонник клетки, передать пластиковых пробирок 15мл и спина на 500 g x 5 мин (4 ° C). Выбросите супернатант.
  7. Ресуспензируйте Пелле клеток в 10 мл средства массовой информации культуры с M-КСФ или ГМ-КСФ, место клетки в Петри 10 см обработанной ткани культуры и культуры при 37 ° C, 5% CO2. Оптимальное количество ячеек для 10 см блюдо составляет 5 – 10 x 106 для БМ производные макрофагов и 10 – 15 х 106 для БМ производные дендритных клеток.
    Примечание: Небольшие блюда или пластины может использоваться, но номера ячейки должны быть скорректированы соответствующим образом.
  8. Следовать макрофаги и дендритные клетки выращивания и дифференциации протокол описано в шаге 4 и 5.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Сигнальный адаптер белки, обычно маленькие белки без каких-либо ферментативную активность. Они обладают различные взаимодействия доменов или мотивы, которые посредником связывание с другими белками вовлечены в сигнальной трансдукции, включая тирозин киназ, фосфатаз и убиквитин ligases21. Для демонстрации функциональности этого протокола были выбраны адаптеры миелоидных клеток PSTPIP2 и OPAL1. PSTPIP2 это хорошо характеризуется белок, участвующий в регуляции воспали...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Выражение протеина интереса к клеткам-мишеням является ключевым шагом во многих видах биологических исследований. Трудно transfect стандартных transfection и антиретровирусным трансдукции методы дифференцированной макрофаги и дендритные клетки. Обход трансфекции этих дифференцированных клеток с ретровирусной трансдукции предшественники костного мозга, следуют дифференциации, когда они уже несут требуемой конструкции, является важным шагом, позволяя выражение внематочная cDNAs в этих типы клеток. Примером успешного исполь...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана на Чешской науки фонд (GACR) (проект № 16-07425S), Карлова университета гранта Агентства (ГАУК) (номер 923116 проекта) и институционального финансирования от Института молекулярной генетики, Академия наук Чешской Республики Республика (РВО 68378050).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DMEMThermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США15028
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США10270Для подпитки среды
KHCO3Lachema, Brno, Czech RepublicN/A
NH4ClSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, США)A9434
ПенициллинBB Pharma AS, Прага, Чешская РеспубликаН/ДПЕНИЦИЛИН G 1,0 DRASELNÁ SOL' BIOTIKA
СтрептомицинСигма-Олдрич (Merck, Kenilworth, NJ, США)S9137Стрептомицина сульфат в порошке соли
GentamicinDr. Kulich Pharma, Hradec Krá lové, Чешская РеспубликаН/Д
Полиэтиленимин, линейный, MW 25,000Polyscience, Уоррингтон, Пенсильвания, США23966
ПолибренSigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, США)H9268
EDTASigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, США)E5134
PBSПодготовлено на собственном предприятии медиа-центром IMG ASCR, Прага, Чешская РеспубликаN/A
APC антитело к мыши/человеку к CD11b, клон M1/70BioLegend (Сан-Диего, Калифорния, США)101212анализ проточной цитометрии
PE антитело против мыши F4/80, клон BM8BioLegend (Сан-Диего, Калифорния, США)123110анализ проточной цитометрии
APC против мыши CD11c Антитело, клон N418BioLegend (Сан-Диего, Калифорния, США)117310анализ проточной цитометрии
M-CSFPeproTech (Роки-Хилл, Нью-Джерси, США)315-02
GM-CSFPeproTech (Роки-Хилл, Нью-Джерси, США)315-03
Hoechst 33258Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, СШАH1398на 1-2 & микро; г/мл
Использование анализа проточной цитометрии

Ссылки

  1. Moghaddam, A. S., et al. Macrophage plasticity, polarization and function in health and disease. Journal of Cellular Physiology. , (2018).
  2. Qian, C., Cao, X. Dendritic cells in the regulation of immunity and inflammation. Seminars in Immunology. 35, 3-11 (2018).
  3. Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).
  4. Kondo, M. Lymphoid and myeloid lineage commitment in multipotent hematopoietic progenitors. Immunological Reviews. 238 (1), 37-46 (2010).
  5. Andrews, T., Sullivan, K. E. Infections in patients with inherited defects in phagocytic function. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 597-621 (2003).
  6. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  7. Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).
  8. Scheicher, C., et al. Recombinant GM-CSF induces in vitro differentiation of dendritic cells from mouse bone marrow. Advances in Experimental Medicine and Biology. 329, 269-273 (1993).
  9. Stanley, E. R. The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1. Methods in Enzymology. , 564-587 (1985).
  10. Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb prot5080 (2008).
  11. Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
  12. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
  13. Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88 (4), 858-871 (2009).
  14. Remington, S. J. Green fluorescent protein: a perspective. Protein Science. 20 (9), 1509-1519 (2011).
  15. Hoffman, R. M. Strategies for In Vivo Imaging Using Fluorescent Proteins. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (9), 2571-2580 (2017).
  16. Telford, W. G., Hawley, T., Subach, F., Verkhusha, V., Hawley, R. G. Flow cytometry of fluorescent proteins. Methods. 57 (3), 318-330 (2012).
  17. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. , 123-143 (2009).
  18. Zal, T., Volkmann, A., Stockinger, B. Mechanisms of tolerance induction in major histocompatibility complex class II-restricted T cells specific for a blood-borne self-antigen. Journal of Experimental Medicine. 180 (6), 2089-2099 (1994).
  19. Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. Identification and Characterization of the New Osteoclast Progenitor with Macrophage Phenotypes Being Able to Differentiate into Mature Osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).
  20. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  21. Janssen, E., Zhang, W. Adaptor proteins in lymphocyte activation. Current Opinion in Immunology. 15 (3), 269-276 (2003).
  22. Ferguson, P. J., Laxer, R. M. New discoveries in CRMO: IL-1beta, the neutrophil, and the microbiome implicated in disease pathogenesis in Pstpip2-deficient mice. Seminars in Immunopathology. 37 (4), 407-412 (2015).
  23. Holleman, A., et al. Expression of the outcome predictor in acute leukemia 1 (OPAL1) gene is not an independent prognostic factor in patients treated according to COALL or St Jude protocols. Blood. 108 (6), 1984-1990 (1984).
  24. Zjablovskaja, P., Danek, P., Kardosova, M., Alberich-Jorda, M. Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), (2018).
  25. Kralova, J., et al. The Transmembrane Adaptor Protein SCIMP Facilitates Sustained Dectin-1 Signaling in Dendritic Cells. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16530-16540 (2016).
  26. Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51960(2014).
  27. Bowles, R., Patil, S., Pincas, H., Sealfon, S. C. Optimized protocol for efficient transfection of dendritic cells without cell maturation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2766(2011).
  28. Siegert, I., et al. Electroporation of siRNA into mouse bone marrow-derived macrophages and dendritic cells. Methods in Molecular Biology. 1121, 111-119 (2014).
  29. Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
  30. Jin, L., Zeng, X., Liu, M., Deng, Y., He, N. Current progress in gene delivery technology based on chemical methods and nano-carriers. Theranostics. 4 (3), 240-255 (2014).
  31. Muruve, D. A., et al. The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response. Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).
  32. Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses. Journal of Virology. 69 (4), 2004-2015 (1995).
  33. Tallone, T., et al. A mouse model for adenovirus gene delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (14), 7910-7915 (2001).
  34. Milone, M. C., O'Doherty, U. Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia. , (2018).
  35. McTaggart, S., Al-Rubeai, M. Retroviral vectors for human gene delivery. Biotechnology Advances. 20 (1), 1-31 (2002).
  36. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Platinum Eco packagingM CSFGM CSF

Похожие статьи