Чтобы расширить возможности лабораторий во всем мире для оценки отбора пациентов с раком легких для лечения с pembrolizumab, на основе надежных и воспроизводимых, мы разработали assay который использует 22 c 3 антитела концентрата на широко доступны Иммуногистохимическая autostainer, для цитологии и биопсии образцов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
С помощью 22 c 3 антитела анти PD-L1 сосредоточиться на биопсию и цитологических мазков из больных раком легкого немелкоклеточного
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Монотерапия Pembrolizumab был утвержден на первой и второй линии лечения больных с PD-L1-выражая расширенный non-немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ). Тестирование для PD-L1 выражение с диагностики assay PD-L1 иммуногистохимия (IHC) 22 c 3 компаньон, который дает опухоль доля Оценка (TPS), была проверена на опухолевой ткани. Мы разработали оптимизированные лаборатории разработали тест (LDT), использующий 22 c 3 антитела (Ab) концентрат на широко доступны ИХС autostainer для цитологии и биопсии образцов. PD-L1 TPS оценивалась с 120 парных целом опухолевой ткани секций и биопсия и с 70 паре образцы биопсии и цитологии (бронхиальной Моет, n = 40; плеврального излияния, n = 30). Ab 22 c 3, на основе концентрата LDT показал высокий уровень согласованности между биопсии (~ 100%) и цитологии образцов (~ 95%), по сравнению с PD-L1 IHC выражение определено с помощью пробирного 22 c 3 компаньон PD-L1 IHC на обоих TPS сократить пунктов (≥1%, ≥50%). Оптимизированный LDT, представленные здесь, используя 22 c 3 Ab концентрат для определения выражения PD-L1 в обоих опухолевой ткани и цитологии образцов, будет расширяться лабораторий во всем мире возможность оценить отбора больных НМРЛ для лечения с Монотерапия pembrolizumab на основе надежных и воспроизводимых.
Введение
Последние клинические исследования продемонстрировали эффективность pembrolizumab, гуманизированные моноклональные IgG4 Каппа isotype антитела которое блокирует взаимодействие между запрограммированной смерти клетки 1 (PD-1) и ее лигандов, PD-L1 и PD-L2, в лечении больных с Расширенные НМРЛ1,2,3,4.
В настоящее время pembrolizumab одобрен для лечения НМРЛ PD-L1-выражая в обоих лечения наивно пациентов с выражением PD-L1 TPS ≥50% и не рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) или Анапластическая лимфомы киназы (ALK) геномных опухоли аберраций3 и для ранее лечение пациентов с TPS PD-L1 ≥1%1.
PD-L1 белка выражение определяется IHC широко используется как assay интеллектуального биомаркеров для терапии анти PD-1/PD-L1. В клинических испытаниях pembrolizumab TPS PD-L1, полученные с формалином Исправлена парафин врезанных образцов ткани (FFPE) было определено с помощью анализа компаньон PD-L1 IHC 22 c 35. Этот assay был одобрен в США продуктов питания и медикаментов (FDA) и был CE помечен в Европе для определения опухоли PD-L1 TPS5.
Дополнительные глобальные параметры через учреждения для надежных и качественных оценок PD-L1 TPS с LDTs, которые используют концентрат 22 c 3 антитела необходимы для поддержки клинических решений относительно отбора пациентов для pembrolizumab лечение. Большое количество лабораторий патологии не имеют доступа к Компаньон диагностическое PD-L1 IHC 22 c 3 assay. Таким образом важно развитие надежных и последовательных LDTs совместим с дополнительными, широко доступны ИХС autostainer платформ.
Кроме того существует необходимость в создании LDTs с использованием цитологии образцов, которые являются только образец типа часто доступны от больных НМРЛ. PD-L1 IHC 22 c 3 компаньон пробирного проверяется для резекции, биопсия иглы ядро и бронхоскопии только если бронхоскопии дает 100 опухолевых клеток. Хотя выше типы пример часто получаются, цитологических мазков более легко собираются и являются наиболее широко доступен образец типа в некоторых учреждений6,7. Однако есть в настоящее время нет проверенных диагностических пробирного для оценки выражения PD-L1 в цитологических мазков; надежный LDTs совместим с цитологических мазков облегчило бы высокое качество тестирования PD-L1.
Кроме того при установлении клинические проверки LDT, ИГХ должны выполняться в подобным образом соответствующий клинически проверенных коммерческих тест8. Например чтобы получить тот же самый сигнал в серийный разделы, такие как антитела титрования, предварительной задержки, время инкубации и усиление систем9должны быть проверены несколько важных шагов.
Мы недавно разработали оптимизированные LDT, использующий 22 c 3 антитела концентрат для оценки выражения PD-L1 биопсий опухоли и цитологии образцы10,11. Мы нашли высоким согласования с LDT против «золотой стандарт» PD-L1 IHC 22 c 3 пробирного10,11. Этот клинически проверенных протокол будет поддерживать надежный, высококачественный PD-L1, тестирование в регионах во всем мире.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры были утверждены Комитетом по местным этики (человека Комитет по этике исследований, центр больничного университетский de Nice/Tumorothèque BB-0033-00025).
Примечание: Этот протокол специально приспособлен для использования 22 c 3 антитела сосредоточиться на коммерчески доступных автоматизированных IHC Стайнер (упоминаемый как autostainer здесь, смотрите Таблицу материалов) для биопсии опухоли и цитологических мазков.
1. Подготовка образцов ткани опухоли
- Исправьте опухолевой ткани в нейтральных буферизации формалина 10% (NBF) в кассету.
Примечание: Как правило опухолевой ткани от опухоли легких проксимальной получается бронхоскопии, пульмонолог, или пульмонолога, выполняются умеренный седативный эффект. Для периферического поражения и заболевания легких, диффузный указывается биопсии трансбронхиальную или иглы. Эти процедуры обычно делается в хирургии комнате или в отделении интенсивной терапии. - Вставить кассету в парафин.
Примечание: Фиксация может быть достиган перфузии или погружения, сразу после вскрытия и обычно требуется 8-10 ч. Фиксаторные объем должен быть выше, чем объем образца x 15 – 20. Чтобы исправить биопсия тканей для более чем 10 h, не рекомендуется, поскольку overfixation может вызвать маскировки антигена. Фиксация скорость составляет около 1 мм/ч при комнатной температуре. - Проникновения образца фиксированной ткани с воском в ткани процессора (см. Таблицу материалы).
Примечание: Обезвоживания осуществляется в три ванны алкоголя с увеличением концентрации 70%, 85% и 90%. Вода удаляется наконец три ванны окончательный абсолютного алкоголя. Очистка выполняется в три бани толуола и проникновение воск горячий воск бани (44-60 ° C). - Внедрить ткани внутри формы заполнены с расплавленным парафином (см. Таблицу материалы) и ждать затвердевания.
- В разделе парафин врезанных тканей при толщине 3 мкм на микротома.
- Передача, парафин ленты к положительно заряженному Микроскоп стекла слайд (см. Таблицу материалы).
- Сухие слайд за 1 ч при 37 ° C.
Примечание: Хранить в разделах ткани на 2-8 ° C (предпочтительно) или при комнатной температуре до 25 ° C для сохранения антигенностью и пятна в пределах 15 d секционирование.
2. Подготовка цитологических мазков
-
Собирать бронхиальной мойки в консервант раствор (см. таблицу материалы).
Примечание: Для этого используется техника стандартные бронхоскопии.- Промывание распределение бронха для выборки. Соберите мыть в чистую емкость. Этикетке контейнера с пациентом первый и фамилия, Дата рождения и образец источника.
- Передача бронхиальной стирок 50 мл Конические трубки и добавить 2 g DL-Дитиотреитол порошок (см. Таблицу материалы), вихревой трубки для 30 минут и затем центрифуги на 250 x g 5 мин при комнатной температуре.
- Удалить супернатант и добавить 10 мл раствора Муколитические (см. Таблицу материала).
- Shake образца для 20 минут на средней скорости (уровень 9) и центрифуги на 250 x g 5 мин при комнатной температуре.
- Удалить супернатант и депозитные ячейки Пелле в коллекции пробирки, содержащие 10% NBF.
- Добавьте 4 капли реагента подготовки ячейки блока (см. Таблицу материалы) клетки Пелле.
- Перенесите ячейки Пелле кассету, исправить это в 10% NBF и парафин вставлять его ячейку блока подготовки и секционирование (см. шаги 1.1-1.7).
3. PD-L1 пятнать Assay
- Перейдите на autostainer и на компьютере.
- Дважды щелкните на значке autostainer и выберите пользователя.
- Нажмите на «Создать ярлык» , а затем на «Протокол».
- Дважды щелкните протокол 22 c 3.
Примечание: Протокол впервые установлена на компьютере autostainer, нажав на «создать протокол». Полный протокол предоставляется в качестве дополнительных файлов 1. - Введите ID пациента на этикетке и нажмите на «Печать».
- Вставить метку на слайде.
- Откройте слайд, нажав на кнопку ящик, который был выбран.
- Место помечены слайд на термальная пусковая площадка с этикеткой вверх и внутрь.
- Закройте ящик слайда.
- Снимите крышки из автоматов и загрузить реагентов на реагенты стойки.
- Открыть капот ситечко и место стойки на карусель реагентов, убедившись, что они подходят и держать в положении.
- Закройте капот.
- На программное обеспечение нажмите на инструмент, который будет использоваться и нажмите на «Запуск».
- В конце процедуры IHC промойте слайд в течение нескольких секунд с водопроводной водой и одной каплей моющего раствора.
- Увлажняет слайд с одной ванной 100% этанола и второй ванной этанола 95% в течение нескольких секунд.
- Место слайда в coverslipping машину для автоматической загрузки coverslip.
4. толкование пятнать PD-L1
Примечание: Квалифицированный врач-патологоанатом должен выполнить толкование результатов испытания IHC PD-L1.
- Оцените качество окрашивания PD-L1, анализируя положительной и отрицательной контроля до осмотра пациента образца.
Примечание: Результаты, полученные на пациента образца, считаются недействительными, если окрашивание элементов управления не является приемлемым. - Подтвердите наличие минимум 100 жизнеспособных опухолевых клеток под микроскопом.
Примечание: Отчет, когда пациента образец имеет меньше чем 100 опухолевых клеток. - На низкий масштаб 4 X оцените все районы хорошо сохранились позитивные и негативные опухоли.
Примечание: При низком увеличении, частичное мембраны пятнать или окрашивание мембраны слабой интенсивности (1 +) может быть трудно признать. - Оценка частичной или полной клеточной мембраны пятнать.
Примечание: Цитоплазматический окрашивание имеет будут исключены из толкования. - Рассчитайте TPS, оценки доли PD-L1 позитивных опухолевых клеток по отношению к все опухолевые клетки присутствуют в районах хорошо сохранившийся опухоли.
Примечание: Следует только жизнеспособные опухолевых клеток. Все другие клеточные элементы, например иммунные клетки, отмершие клетки, нормальные клетки и артефакты, должны быть исключены из рассмотрения.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
С помощью процедуры, представленные здесь и как описано подробно в недавней публикации этой группы10,11, оптимизированный LDT был клинически апробирован с 120 архивных FFPE NSCLC биопсии образцов от пациентов, перенесших хирургическое Резекция или биопсия в больнице университета Пастера, Ницца, между марта 2007 года и марта 2016 года. Кроме того, для оценки выражения PD-L1 цитологических мазков, TPS оценивалось в 70 образцы биопси...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мы подтвердили оптимизированный LDT, используя 22 c 3 PD-L1 антитела концентрат, сравнивая его с соответствующей клинически проверенных коммерческих тест10,11. 22 c 3 сосредоточены на основе антител LDT, показали высокий уровень согласования между образцы цитологии (~ 95%) по сравнению с PD-L1 IHC выражение определено с помощью проба PD-L1 IHC 22 c 3 ≥1% TPS и ≥50% TPS, вырезать точек и биопсия (~ 100%). Как недавно рекомендованный Международной ассоциации по изу...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Это исследование финансировалось Merck & Co., Inc., Москва, Нью-Джерси, США. Спонсоры играли никакой роли в дизайн исследования, сбор данных и анализ, решение опубликовать или подготовка рукописи.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| NovaPrep HQ1 | Novacyt | NA | Консервант раствор для цитологических образцов |
| Novaprep® HQ+ B | Novacyt | NA | Муколитический раствор |
| Tissue-Tek VIP 6 | Сакура | 6042 VIP 6 | |
| Tissue-Tek TEC 5 Система консоли для встраивания тканей | Sakura | 5229 TEC 5 | |
| микроскоп предметное стекло SuperFrost Plus Thermo | Fisher Scientific | 4951PLUS4 | |
| DL-дитиотреитол | порошок Sigma-Aldrich | D3801 | |
| Heidolph Multi Reax Vortex Shaker | Thermo Fisher Scientific | 13-889-410 | |
| Shandon Cytoblock | Thermo Fisher Scientific | 7401150 | |
| 22C3 анти-PD-L1 концентрат антител | Agilent Dako | #M365329 | |
| PD-L1 IHC 22C3 pharmDx | Agilent Dako | SK006 | |
| автокраситель Link 48 | Agilent Dako | AS480 | |
| Автопятнитель BenchMark ULTRA | Ventana | #750-600 | |
| Универсальный компоновщик OptiView HQ | Ventana | #760-700 | |
| Мультимер OptiView HRP Ventana | #760-700 | ||
| Усилитель OptiView H2O2 | Ventana | #760-099 | |
| Усилитель OptiView | Ventana | #760-099 | |
| OptiView Мультимер для амплификации | Ventana | #760-100 | |
| OptiView DAB | Ventana | #760-700 | |
| OptiView Copper | Ventana | #760-700 | |
| Гематоксилин II | Ventana | #790-2208 | |
| Реагент для воронения | Ventana | #760-2037 | |
| Кондиционирование клеток 1 (CC1) | Ventana | #950-124 | |
| Ткань-Тек Пленка Покровная Тапочка | Сакура | 4742 |
Ссылки
- Garon, E. B., et al. Pembrolizumab for the treatment of non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 372 (21), 2018-2028 (2015).
- Herbst, R. S., et al. Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial. The Lancet. 387 (10027), 1540-1550 (2016).
- Reck, M., et al. Pembrolizumab versus Chemotherapy for PD-L1-Positive Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1823-1833 (2016).
- Langer, C. J., et al. Carboplatin and pemetrexed with or without pembrolizumab for advanced, non-squamous non-small-cell lung cancer: a randomised, phase 2 cohort of the open-label KEYNOTE-021 study. The Lancet Oncology. 17 (11), 1497-1508 (2016).
- Buttner, R., et al. Programmed Death-Ligand 1 Immunohistochemistry Testing: A Review of Analytical Assays and Clinical Implementation in Non-Small-Cell Lung Cancer. Journal of Clinical Oncology. 35 (34), 3867-3876 (2017).
- Folch, E., Costa, D. B., Wright, J., VanderLaan, P. A. Lung cancer diagnosis and staging in the minimally invasive age with increasing demands for tissue analysis. Translational Lung Cancer Research. 4 (4), 392-403 (2015).
- Padmanabhan, V., et al. Improving Adequacy of Small Biopsy and Fine-Needle Aspiration Specimens for Molecular Testing by Next-Generation Sequencing in Patients With Lung Cancer: A Quality Improvement Study at Dartmouth-Hitchcock Medical Center. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 141 (3), 402-409 (2017).
- Tsao, M. S., et al. IASLC ATLAS of PD-L1 Immunohistochemistry Testing in Lung Cancer. , International Association for the Study of Lung Cancer (IASLC) Press. (2017).
- Thunnissen, E., de Langen, A. J., Smit, E. F. PD-L1 IHC in NSCLC with a global and methodological perspective. Lung Cancer. , 102-105 (2017).
- Ilie, M., et al. Use of the 22C3 anti-PD-L1 antibody to determine PD-L1 expression in multiple automated immunohistochemistry platforms. PLoS One. 12 (8), e0183023(2017).
- Ilie, M., et al. Use of the 22C3 anti-programmed death ligand 1 antibody to determine programmed death ligand 1 expression in cytology samples obtained from non-small cell lung cancer patients. Cancer Cytopathology. 126 (4), 264-274 (2018).
- Skov, B. G., Skov, T. Paired Comparison of PD-L1 Expression on Cytologic and Histologic Specimens From Malignancies in the Lung Assessed With PD-L1 IHC 28-8pharmDx and PD-L1 IHC 22C3pharmDx. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 25 (7), 453-459 (2017).
- Russell-Goldman, E., Kravets, S., Dahlberg, S. E., Sholl, L. M., Vivero, M. Cytologic-histologic correlation of programmed death-ligand 1 immunohistochemistry in lung carcinomas. Cancer Cytopathology. 126 (4), 253-263 (2018).
- Heymann, J. J., et al. PD-L1 expression in non-small cell lung carcinoma: Comparison among cytology, small biopsy, and surgical resection specimens. Cancer Cytopathology. 125 (12), 896-907 (2017).
- Stoy, S. P., Rosen, L., Mueller, J., Murgu, S. Programmed death-ligand 1 testing of lung cancer cytology specimens obtained with bronchoscopy. Cancer Cytopathology. 126 (2), 122-128 (2018).
- Ilie, M., Hofman, P. Reproducibility of PD-L1 assessment in non-small cell lung cancer-know your limits but never stop trying to exceed them. Translational Lung Cancer Research. 6 (Suppl 1), S51-S54 (2017).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
Иммуногистохимия PD-L1концентрат антител 22C3показатель доли опухолевых клеток (TPS)биопсийные цитологические образцыпротокол для автоматического иммуногистохимического анализатораобработка цитологических образцовзаливка опухолевой ткани в парафинанализ экспрессии PD-L1отбор пациентов для иммунотерапии
