Оценка ответов Зика вирус специфических Т-клеток в Immunoprivileged органах зараженных Ifnar1- / - мышей

Краткое содержание

Протокол для оценки реакции антиген специфические Т-клеток в immunoprivileged органах Ifnar1^{- / -} мышиных модели для вируса Зика (ZIKV) описано. Этот метод имеет решающее значение для изучения клеточных механизмов защиты и иммунопатогенезе ZIKV вакцин и также является ценным для оценки их эффективности.

Аннотация

Зика вирус (ZIKV) может вызвать воспаление в immunoprivileged органов (например, мозг и яичка), ведущих к синдром Гийена-Барре и повреждение яичек. Во время инфекции с ZIKV иммунные клетки было показано, чтобы проникнуть в ткани. Однако клеточных механизмов, определяющих защиту и/или иммунопатогенезе этих иммунных клеток при ZIKV инфекции по-прежнему в значительной степени неизвестными. Здесь мы описываем методы для оценки функции вирус специфических Т-клеток в этих органах immunoprivileged ZIKV-инфицированных мышей. Эти методы включают) ZIKV инфекции и прививки вакцины в Ifnar1^{- / -} мышей; b) гистопатология, иммунофлюоресценции и иммуногистохимии анализов для выявления вирусной инфекции и воспаления в мозг, яички и селезенки; c подготовка Тетрамер ZIKV-производные Т-клеточных эпитопов; d обнаружение ZIKV-специфических Т-клеток в моноцитов, изолированный от мозг, яички и селезенки. С помощью этих подходов, это можно обнаружить антиген специфические Т-клеток, которые проникли в immunoprivileged органы и оценить функции этих клеток T во время инфекции: потенциал иммунной защиты через вирус Специальные акции и иммунопатогенезе или усугубить воспаление. Эти выводы могут также помочь прояснить вклад Т-клеток, вызванные иммунизации против ZIKV.

Введение

ZIKV является flavivirus комарами, который был впервые выделен в 1947 году в Уганде от лихорадочного резус макака. Недавно ZIKV стал общественного здравоохранения чрезвычайной ситуации, из-за его быстрое распространение в Америке и его неожиданные связи с микроцефалия и Гийена-Барре синдром^1,2,3. Эпидемиологических данных ZIKV было подозрение, чтобы быть причиной синдрома Гийена-Барре в около 1 на 4000 инфицированных взрослых⁴. Кроме того была продемонстрирована связь между ZIKV и яичках инфекции/повреждения в модель мыши, предполагая, что ZIKV инфекции, при определенных обстоятельствах, может обойти барьер крови яичка и в конечном итоге привести к мужского бесплодия⁵ . Эти выводы подчеркивают важность полностью понимания индукции защитных или патологические иммунные реакции при ZIKV инфекции.

Многое еще предстоит узнать о сотовых иммунной реакции на ZIKV. CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеточных реакций к капсидному, конверт и неструктурных протеин 1 (NS1) были обнаружены в ZIKV-инфицированных обезьян и людей^6,,^7,8. В мышей, несколько исследований показали что CD8⁺ T клетки играют защитную роль в контроле ZIKV репликации^9,10,11. Важно отметить, что Хурадо et al. показал, что ZIKV инфекции приводит к распаду blood - brain барьер и периваскулярной инфильтрации CD8⁺ клеток-эффекторов T в семенниках мышей^{- / -} Ifnar1. Кроме того, они показали, что CD8⁺ T клетки провоцируют связанные ZIKV паралич и появляются играть определенную роль в неонатальной мозга иммунопатологии. В предыдущем исследовании, мы подготовили Тетрамер_294-302 ZIKV-E и показал, что ZIKV-конкретных CD8⁺ T клетки существуют в мозги и шнуры спинного мозга мышей^{- / -} ZIKV-инфицированных Ifnar1, которые могут иметь важные последствия для разработки и разработка вакцин ZIKV¹⁰.

В ответ на настоятельную необходимость вакцинации для предотвращения инфекции ZIKV несколько вакцин в доклинических стадиях развития, включая вакцины, рекомбинантных вакцин на основе векторной и очищенный протеин Субблок вакцин РНК. В фазе 1 клинические испытания¹²вакцины ДНК плазмиды. Оценка безопасности и эффективности вакцин ZIKV, таким образом, важное значение. Одним из преимуществ вакцин является их способность добиться конкретных ответов в Т-клеток, которые могут быть важны для защиты от ZIKV. С помощью связанных с epitope тетрамера ZIKV-производные Т-клеток, иммунореактивности Т-клеток, вызванные аденовируса векторной ZIKV вакцины могут быть обнаружены в иммунизированной мыши, и M и E гликопротеинов были показаны побудить надежные антиген специфические CD8⁺ Т-клеток иммунореактивности¹³.

Во время вирусной инфекции признание пептидные антигены, представленных сложных молекул гистосовместимости (MHC) Т-клеточных рецепторов (TCR) является важным механизмом для защиты принимающих¹⁴T-cell-mediated. На основе этой теории, технологии Тетрамер является уникальным инструментом для выяснения роли, которые антиген специфические клетки T играть в регулировании иммунной реакции¹⁵. Этот протокол описывает создание модели Ifnar1^{- / -} мышь для ZIKV инфекций и обнаружение реактивных Т-клеток в селезенку, мозг и семенниках мышей с использованием технологии Тетрамер. Кроме того мы использовали Тетрамер_294-302 ZIKV-E для выявления и оценки иммунореактивности Т-клеток, индуцированных ZIKV вакцина (AdC7-M/E) в иммунизированной мыши. Это исследование обеспечивает руководство для изучения ответов Т-клеток в immunoprivileged органах и предоставляет ссылку для потенциальных приложений в плаценты или мозг плода.

Протокол

Эксперименты на животных были утверждены институциональный уход животных и использование Комитета национального института для вирусного контроля и профилактики заболеваний, Китай CDC. Все эксперименты проводились после институциональный уход животных и использование Комитет одобрил животных протоколов.

1. вирусной инфекции

1. Держать взрослого (6-8 недели старый) Ifnar1^{- / -} (50% мужчин и 50% женщин) мышах в условиях стандартных специальных возбудителя бесплатно (SPF) и позволить им регулярного доступа к продовольствию и воде.
2. Заразить Ifnar1^{- / -} мышей с ZIKV через ретро орбиталь прививка 100 мкл ZIKV в фосфат амортизированное saline (PBS) буфер, содержащий 1 х 10⁴ фокус формирование единиц (FFUs) вируса. Аналогичным образом обеспечивают контроль мышей с равным объемом PBS.
   Предупреждение: Заразить мышей в условиях ABSL2 и выполнять эти процедуры с вирусом мышей в кабинете биобезопасности.
3. Контролировать вес и клинические признаки (толчки, шатаясь марта, двусторонние вялого задних конечностей) мышах ежедневно на 15 дней.

2. иммунизации вакциной ZIKV

1. Использование Ifnar1^{- / -} (50% мужчин и 50% женщин) мышах между 6 и 8 недель возраста. Держите мышей в стандартных условиях SPF 18 – 29 ° C и 12 h свет/темно цикла с доступом к продовольствию и воде.
2. Иммунизировать мышей^{- / -} Ifnar1 с ZIKV вакцины: придать 100 мкл AdC7-M/E [4 x 10¹⁰ (частицы вируса)] в PBS буфера через внутримышечной инъекции (и.м. маршрут) с помощью 1 мл шприца с иглой 23 G.
3. Аналогичным образом придать управления мышей с равным объемом PBS.

3. изоляция моноциты из селезенки

Примечание: Изоляции моноциты из селезенки описан как упоминалось ранее,¹⁶.

1. Анестезировать прививки и ZIKV-инфицированных мышей 7 d после прививки, используя 5% изофлюрановая concentrationin 100% кислорода (при скорости потока 1 Л/мин). Усыпить мышей от шейки матки дислокации. Затем сразу окуните всю поверхность мыши в 75% этанола.
   Предупреждение: от этого шага все экспериментальные процедуры должны выполняться консерванта в биобезопасности кабинета.
2. С помощью иглы, исправьте конечностей (Усыпленных, ранее инфицированных/прививки) мышей на пены пластины с живота вверх.
3. Вырезать кожу вдоль средней линии живота на грудную клетку с стерильным скальпель, сократить мышцы живота с ножницами, разоблачить брюшной полости и аккуратно удалить печень.
   Примечание: Длиной, темно красный орган слева от желудка является селезенки.
4. Удаление селезенки, промойте его 3 x в PBS для удаления любой крови и поместите его в 1,5 мл ледяной Розуэлл парк Мемориальный институт среды (RPMI). Держите селезенки на льду.
5. Для создания одной ячейки подвеска из селезенки, место органа(ов) на стерильную 40 мкм-клеток сетчатый фильтр на вершине 50 мл трубки и добавить 2 мл ледяной RPMI средних содержащий 10% плода бычьим сывороточным (ФБС). С помощью плунжера шприц 5 мл, механически размять органа(ов) и добавить среднего до тех пор, пока орган был полностью землю через сетку.
6. Передать 15 мл суспензии клеток и центрифуги на 600 x g 5 мин при 4 ° C. Удалите супернатант.
7. Ресуспензируйте клетки с 5 мл буфера lysis эритроцитов (РБК) (NH₄Cl, Na₂ЭДТА и KHCO₃; см. Таблицу материалы) и инкубировать реакция лизиса при комнатной температуре для 5 – 6 мин.
8. Остановить РБК lysis с 10 мл ледяной RPMI/FBS среды и центрифуги трубки на 600 x g 5 мин при 4 ° C. Удалите супернатант.
9. Ресуспензируйте клетки с 10 мл полного среднего RPMI (RPMI с 10% vol/vol FBS и 100 ед/мл пенициллин стрептомицином). Перевести небольшой трубки 10 мкл суспензии клеток, смешать его с 10 мкл 0,4% wt/vol Трипановый синий и подсчитать количество ячеек с помощью Горяева.

4. изоляция моноциты из мозга и яичек

1. Анестезировать ZIKV-инфицированных мышей-самцов 7 d после прививки, используя 5% isofluranein 100% кислорода (при скорости потока 1 Л/мин). Усыпить мышей от шейки матки дислокации. Затем сразу окуните всю поверхность мыши в 75% этанола.
   Предупреждение: От этого шага все экспериментальные процедуры должны выполняться консерванта в биобезопасности кабинета. Изоляции моноциты из мозга и яичках описан как упоминалось ранее,¹⁷.
2. Иммобилизации (Усыпленных, ранее инфицированных) мужчины мыши в лежачем положении на разделочную доску.
3. Защиты головы с прямой 1 x 2 зубов щипцами и использовать Iris ножницы сделать разрез средней линии на голове подвергать черепа.
4. Зажать обе стороны орбит с острыми пинцетом и исправить мозга. Поместите один подсказки ножницами Ирис в затылочного и боков нарезать черепа. Повторите этот шаг для другой стороны.
5. Используйте острые ножницы Iris тщательно вырезать из полости же, вверх по средней линии, к носу. Попробуйте держать конец ножницы как поверхностные избежать, ранив мозга.
6. Поднимите мозга с щипцами и использовать Iris ножницами тщательно анализировать черепных нервных волокон. Удаление мозга с щипцами и поместите его в тубы 15 мл 5 мл ледяной RPMI/10% FBS среды.
7. Grab брюшной кожи пинцетом и использовать Iris ножницами сделать продольный разрез через кожный покров и брюшной стенки и разоблачить в нижней части живота. Нажмите яички до разрез. Осторожно потяните жирового слоя с помощью пинцета и разоблачить шаровидных яичка с обеих сторон.
8. Использование резкого Ирис ножницы тщательно анализировать жирового слоя и придатка. Разместите яички в тубы 15 мл 5 мл ледяной RPMI/10% FBS среды с щипцами.
9. Для создания одной ячейки подвеска из мозга или яички, место орган на стерильную ячейки сито с сеткой 100 мкм на вершине 50 мл трубки и добавить 2 мл ледяной RPMI/10% FBS среды. С помощью плунжера шприц 5 мл, размять орган и добавить среднего до тех пор, пока орган был полностью землю через сетку.
10. Передать 15 мл суспензии клеток и центрифуги на 600 x g 5 мин при 4 ° C. Удалите супернатант.
11. Ресуспензируйте клетки с 5 мл 30% плотности градиента средних и, затем, добавить их очень медленно в 2 мл 70% плотности градиента среды в 15 мл.
12. Выключить тормоз и центрифуги трубы на 4 ° C на 800 x g для 30 минут получить лимфоцитов из среднего слоя.
13. Передать свежие 15 мл интерфаза, добавляют 10 мл холодной RPMI/10% FBS среднего и центрифуги трубки на 300 x g 10 мин при 4 ° C. Удалите супернатант.
14. Ресуспензируйте клетки с 10 мл ледяной RPMI/FBS среды и центрифуги их на 600 x g 5 мин при 4 ° C. Удалите супернатант.
15. Ресуспензируйте клетки с 10 мл полного RPMI среды и подсчитать количество ячеек как шаг 3.9.

5. Тетрамер подготовка

1. Постройте плазмид, выражая внеклеточных доменов^b H-2D с тегом биотинилированным сайта на C-конечная α3 домена и β₂м с помощью вектора pET28a с NdeI и XohI ограничения сайта¹⁸.
2. Экспресс и подготовить включение тела H-2D^b и β₂м как описано выше²⁰.
3. RENATURE и очистить MHC/пептидный комплекс H-2D^b-E_294-302.
   1. Подготовка 200 мл refolding раствора [100 мм трис-HCl (рН 8,0), 400 мм L-аргинин, 2 ЭДТА-Na, 5 мм GSG и 0,5 мм GSSG]. Добавление ингибиторов протеазы: 2 мл phenylmethylsulphonyl фтора (PMSF, акций 100 мм), 100 мкл pepstatin (штока 2 мг/мл), и 100 мкл leupeptin (штока 2 мг/мл). Прохладный буфера на 4 ° C на 30 мин.
   2. Добавьте^bH-2D, β₂m и пептида refolding решение.
      1. Придать 500 мкл β₂м растворяют в растворе гуанидина (30 мг/мл бульона), с помощью шприца. Для этого использовать шприц 5 мл с иглой 23 G и вставляют β₂m refolding решения по капле. Держите решение, медленно и постоянно помешивая на 150 об/мин при 4 ° C.
      2. После того, как β₂m была распущена в refolding растворе, решить 2 мг E_294-302 пептида в 200 мкл ДМСО и быстро внедрить его в refolding раствор с помощью пипетки. Медленно перемешайте раствор на 150 об/мин при 4 ° C на 15 мин.
      3. Придать 1,5 мл H-2D^б растворяют в растворе гуанидина. Держите движение вращающийся бар на 150 об/мин для складывая H-2D^b на 4 ° C для 8-10 ч.
         Примечание: Решение был помещен в закрытом поле в холодной комнате.
   3. Концентрат сложил белка в камере под давлением с мембраной 10 кДа. Обмен буфера [20 мм трис-HCl (pH8.0), 50 мм NaCl] в палату и сосредоточить его в окончательный объем 30-50 мл.
   4. Передача refolding решение для пластиковых пробирок и спина его на 2500 x g 15 мин при 4 ° C.
   5. Тщательно супернатант передать 10 кДа центробежного фильтра и далее сосредоточить его в окончательный объем 500 мкл на 2500 x г за 30 мин.
   6. Супернатант передать свежие трубки и спина его на g 12000 x 15 мин очистить протеин с S200 10/300 GL гель filtration хроматографии.
   7. Собирать MHC комплекса пик и сосредоточить его в окончательный объем 350 мкл.
4. Для создания тома 500 мкл реакции для biotinylation, добавьте regents в следующем порядке: 100 мкл раствора A [0.5M bicine (рН 8.3)], 100 мкл раствора B (100 мм АТФ, 100 мм MgOAc, 200 µΜ биотин), 100 мкл дополнительных d-биотина (500 µΜ биотин) , 20 мкл Бира фермента (60 мкг), 0.5 мкл pepstatin (2 мг/мл) и 0,5 мкл leupeptin (2 мг/мл). Инкубировать трубки реакции на ночь при 4 ° C.
   Предупреждение: Не добавляйте любые ЭДТА в реакции biotinylating.
5. Очищают с помощью S200 MHC 10/300 GL гель фильтрации столбца для удаления любых дополнительных биотин.
6. Определите эффективность biotinylating с Пробирной стрептавидина сдвиг¹⁸.
   1. Подготовка трех образцов, A, B и C, на льду за 30 мин. Затем, проанализировать результаты на 10% SDS-PAGE. Образец состоит из 8 мкл биотинилированным MHC молекул и 2 мкл буфера обмена, образца B 8 мкл биотинилированным MHC молекул и 2 мкл стрептавидина (20 мг/мл) и образца C 2 мкл стрептавидина (20 мг/мл) и 8 мкл буфера обмена.
      Предупреждение: Не кипятите образца.
7. Форма мультимеры биотинилированным MHC молекул.
   1. Производят Тетрамер путем смешивания биотинилированным E_294-302 пептид H₂D^b комплекс с надписью фикоэритрин стрептавидина в соотношении 1:5 обеспечить полную привязку всех молекул MHC биотинилированным моль.
   2. Рассчитайте количество стрептавидина конъюгата, необходимые для tetramerization.
      1. Определить родинки MHC/пептидных комплексов, приходится концентрацию белка и молярная масса (пример: 1.8 мг общего белка = 40 нмоль).
      2. Рассчитать родинки стрептавидина конъюгата, необходимо путем деления родинки пептид MHC 5 (пример: 40/5 = 8 нмоль стрептавидина конъюгат).
      3. Рассчитать количество стрептавидина необходимы (мкг) в зависимости от стрептавидина конъюгата (пример: стрептавидина PE [300 000 г/М] → 8 нмоль необходимы = 2400 g).
   3. Разделите стрептавидина фикоэритрин 10 образцов. Добавьте каждый образец трубка, содержащая биотинилированным E_294-302 пептид H₂D^b комплекса, с интервалом в 20 мин. После загрузки последний пример, Инкубируйте трубки реакции на 4 ° C на ночь в темноте.
8. Применить multimerized реагенты в трубку спин 100 кДа и сосредоточить его центрифугированием в 2000 x g при 4 ° C к объему < 100 мкл.
9. Разбавить образец в спин трубы до 4 мл, используя PBS (рН 8.0) и сосредоточить его снова < 100 мкл.
10. Повторите шаг буфера обмена в PBS (рН 8,0) 4 x.
11. Заполните общий объем снова до 500 мкл, используя PBS (рН 8,0). Концентрат образец оценкам концентрации 2-2,5 мг/мл в 2 000 x g при 4 ° C. Магазин образец в темноте при 4 ° C.

6. проточной цитометрии

1. Инкубируйте клеточных суспензий (с шагом 3,9 и/или шаг 4.15) при 4 ° C с 0.1 мкл против мышиных CD16/CD32 Fc-рецептор блокировки реагента на 20 мкл (коэффициент разбавления 1: 200) на 10 минут, чтобы предотвратить любой неспецифических привязки.
2. Центрифуга Тетрамер трубки на 20000 x g для по крайней мере 15 мин при 4 ° C.
3. Каждый хорошо добавьте 20 мкл суспензии клеток в 96-луночных platecontaining 1 x 10⁶ клеток.
4. Готовить достаточное количество смеси Тетрамер_294-302 E пятно все экспериментальные трубы. Подготовьте свыше 15% от общего объема этой смеси на счет для дозирования ошибок. Разбавить_294-302 тетрамера E (2 мг/мл, 1 мкл/испытание) в буфере СУИМ (PBS, 0,5% FBS) так что 20 мкл E_294-302 Тетрамер смесь добавляется к каждому тесту.
5. 20 мкл E_294-302 Тетрамер смеси, 96-луночных пластины. К концу этого шага окончательный объем в каждой скважине должна быть 40 µL.Incubate пластину в темноте при комнатной температуре за 30 мин.
6. Добавьте первичного антитела (FITC-конъюгированных или APC-конъюгированных анти CD3 (0,2 мг/мл), PerCP конъюгированных анти CD8 (0,2 мг/мл)) в 1 мкл/тест суспензию клеток и, затем, Инкубируйте на 4 ° C на 30 мин в темноте.
7. Вымыть клетки 2 x с 2 мл буфера СУИМ и центрифуги их в 600 x g 5 мин тщательно удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки с 200 мкл буфера СУИМ.
8. Храните образцы временно на 4 ° C в темноте до гранулярных анализ потока.
9. Используйте следующие стробирования стратегию для анализа гранулярных потока.
   1. Создайте ворот на диагонали кластерных фуфайки путем построения вперед точечной (FSC) по сравнению с боковой области точечной (SSC).
   2. Затем, ворота на CD3⁺ клеток на стороне точечной (SSC) против CD3; Далее, ворота на CD3⁺ CD8⁺ клетки; Наконец, наброски CD8^{+ +} Тетрамер клетки¹⁹.

7. гистопатология, иммунофлюоресценции и Immunohistochemistry Assay

1. Гистопатология пробирного
   1. Собирать тканей мозга и яичка ZIKV-инфицированных Ifnar1^{- / -} мышей 7 d после прививки и исправить их в 4% нейтральные амортизированное формальдегида.
      Предупреждение: параформальдегида токсичен; носите соответствующие средства индивидуальной защиты.
   2. Внедрите ткани в парафин.
   3. Раздел ткани на 5 мм, с помощью vibratome.
   4. Окрашивать ткани с гематоксилином и эозином (H & E).
2. Иммуногистохимия пробирного
   1. Deparaffinize, увлажняет и антиген получить ткани секций, основанная на процедурах описано ранее²¹.
   2. Лечить разделов ткани с 3% H₂O₂ в PBS (рН 7,6) за 10 мин и блокировать их с 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) за 10 мин.
   3. Инкубировать разделов ткани с крыса анти мыши антитела CD3 (разбавление: 1/1000) за 8 ч при комнатной температуре и, затем, инкубировать их в 4 ° C на ночь.
   4. Полоскания тканей с PBS и, затем, инкубировать их с 3 капли биотинилированным вторичное антитело (разрежения: 1/1000) за 2 ч при комнатной температуре, после чего 3 капли авидин биотин пероксидаза (разбавления: 1/200) при комнатной температуре за 30 мин.
   5. Привязка, с 3 капли 30, 30-Диаминобензидин tetrahydrochloride (разбавления: 1/1000), как описано ранее²².
   6. Counterstain разделов ткани с Мейера гематоксилином.
3. Помощью иммунофлуоресцентного анализа
   1. Просушите секции замороженные яичка (6 мм) для 10 мин при комнатной температуре.
   2. Исправьте их с ледяной ацетона 10 мин.
   3. Вымойте секции с PBS для 3 x и блокировать их с блокирующий буфер (1% BSA, 0,3% Тритон, ПБС) при 37 ° C за 30 мин.
   4. Инкубировать разделов ткани с основного антитела (Z6) (20 мкг/мл) при 4 ° C на ночь.
   5. Полоскания тканей с PBS и применять вторичные антитела (коэффициент разбавления: 1/200) за 1 ч при 37 ° C.
   6. Вымойте разделов ткани с PBS и counterstain их для ядер с помощью 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (коэффициент разбавления: 1/1000), следуя инструкциям производителя.

Результаты

После этих методов мы разработали модель мышиных ZIKV инфекций. 1 х 10⁴ фокус формирование единиц (ФФУ) из ZIKV Ifnar1^{- / -} мышей в возрасте 6 – 8 недель были заражены retroorbital инъекции. После инфекции с ZIKV в Ifnar1^{- / -} мышей наблюдались патологические симптомы и признаки (рис. 1А), а также изменения веса (рис. 1Б). Мышиных мозги показал очевидное отек и гиперемию (рис. 1C). Тем временем, яички сжал постепенно (рис. 1D). Кроме того патологические изменения и разрушение ткани были найдены в головном мозге и яички (рисA). Мы исполняли assay иммунофлюоресценции для обнаружения ZIKV в мозг и яички (рис. 2B). Высоких вирусных нагрузок были обнаружены в головном мозге и яичка иммуноокрашивания (рис. 2B). Иммуногистохимия показал надежную инфильтрации CD3⁺ T клеток в головном мозге мышей после инфекции с ZIKV (рис. 2C).

Чтобы обнаружить и оценить ответы ZIKV-специфических Т-клеток, мы подготовили мыши MHC-I H-2D^b-E Тетрамер_294-302 . Пептид E_294-302 может помочь renature^b H-2D должным образом и дают большое количество растворимого MHC-I (рисA). В assay сдвига высокая эффективность в biotinylation можно наблюдать (рис. 3B). Впоследствии три стрептавидина флуоресцирования (APC, PE и BV421) - меткой реализует - я тетрамера были произведены для обнаружения ZIKV-специфических Т-клеток (рис. 3C). PE-помечены Тетрамер был выше эффективность для выявления конкретных CD8⁺ Т-клеток, по сравнению с надписью APC и BV421 тетрамера, хотя разница не была статистически значимой.

Используя E Тетрамер_294-302 , мы обнаружили ZIKV-специфических Т-лимфоцитов в селезенке зараженных мышей подачей cytometry в 7 d после прививки ZIKV (3.49 ± 0,45%). Кроме того аналогично описанному в разделе 3 настоящего Протокола, с 4 недель после вакцинации вакцины AdC7-M/E, ZIKV-специфических Т-лимфоцитов были обнаружены в селезенке (6.89 ± 1,36%) (Рис. 4).

Кроме того мы обнаружили лимфоцитов, проникли в immunoprivileged органах, таких как мозг и яичек, после ZIKV инфекции. Ворота были установлены для выбора CD3⁺CD8⁺ T-клеток в общей лимфоцитов мозга и яичках. Высокий коэффициент E_294-302 Тетрамер специфичные Т-клетки могут быть обнаружены в головном мозге (42,2% в CD3⁺CD8⁺ T клетки) и яичка (26,4% в CD3⁺CD8⁺ T клетки) лимфоцитов (рис. 5).

Рисунок 1 : Характеристика ZIKV инфекции в Ifnar1^{- / -} мышей. Ifnar1^{- / -} мышей в возрасте 6 – 8 недель были заражены с 10⁴ фокус формирование единиц (ФФУ) из ZIKV retroorbital инъекции, и мышей, вводится с PBS использовались как неинфицированных элементов управления. Морфология (A) и (B) Вес изменения зараженных Ifnar1^{- / -} мышей наблюдали. Красные стрелки показывают Ifnar1 мышей^{- / -} , представленные с myeloparalysis и мотор парезами после инфекции. (C) мозги на 7 d после прививки и яички (D) на 0, 7, 14 и 30 дней после прививки были собраны. Представитель изображения мозга и яички от мышей отображаются с линейкой для обозначения размеров. Планки погрешностей представляют среднее ± SEM. n = 10 мышей на группу за эксперимент. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Обнаружение ZIKV и лимфоцитов в головном мозге и яички мышей^{- / -} ZIKV-инфицированных Ifnar1. (A) Эта группа показывает гистопатологические изменения в мозге и яички от ZIKV-инфицированных мышей, по сравнению с негативный контроль на 7 d после прививки. Шкалы бар = 25 мкм (левая панель) и 50 мкм (правая панель). (B) иммунофлюоресценции пробирного была выполнена с анти ZIKV Z6 антитела (зеленый). С ZIKV-инфицированных мышей на 7 d после прививки были собраны все образцы тканей. Ядра, окрашивали DAPI (синий). Шкалы бар = 50 µm. (C) иммуногистохимия показывает надежные инфильтрации CD3⁺ T-клеток в мозг и яички. Шкалы бар = 25 мкм (левая панель) и 50 мкм (правая панель). Фиолетовый указывает гематоксилином, Браун представляет собой Антитело CD3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 : Подготовка реализует специфичные для ZIKV-я тетрамера. (A) привязки E_294-302 до H-2D^b выяснены путем в vitro складывая. Голубой означает H-2D^b-E_294-302 белка. Оранжевый представляет отрицательный контроль без пептид. (B) Эта группа показывает пробирного сдвиг H-2D^b-E_294-302 . (C) макет представляет элемент управления, PBS. Три стрептавидина флуоресцирования (APC, PE и BV421) - меткой реализует - я тетрамера были использованы для обнаружения ZIKV-специфических Т-клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4 : Гранулярных анализ вирус специфических CD8 потока ⁺ Т-клеток селезенки мышей, инфицированных ZIKV и прививки вакцины в. Ifnar1^{- / -} мышей в возрасте 6-8 недель либо были заражены 10⁴ фокус формирование единиц (ФФУ) из ZIKV или получил разовая доза-4 x 10¹⁰ вирусных частиц AdC7-M/E или PBS как отрицательный контроль. Через 7 дней после инфицирования или 4 недель после вакцинации splenocytes мыши были собраны и проанализированы подачей cytometry. Данные отображаются как среднее ± SD. Статистический анализ проводился с помощью односторонней ANOVA (не значительные: P > 0,05; *P < 0,05; **P < 0.01; ***P < 0,001; ***P < 0.0001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Рисунок 5 : Стробирования стратегии и представитель результаты CD8 вирус специфических⁺ T клеток в головном мозге и семенниках мышей, инфицированных ZIKV. Представитель участки отображаются для проникли лимфоцитов в (A), мозг и (B) яички. Правопреемства ворот имеет значение для выбора лимфоидных точечная⁺ и CD3⁺ события. Из них, CD8⁺ события являются воротами для анализа epitope специфичных Т-клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Обсуждение

Иммуногенность epitope Т-клеток играет значительную роль в клеточный иммунитет против патогенов²³. Таким образом обнаружение ZIKV-специфических Т-клеток в immunoprivileged органах является методология критической понять Т-клеточные ответы против естественной ZIKV инфекции. Тем временем Т-клеточного ответа обнаружения является отличным инструментом для изучения эффективности вирусных вакцин. Здесь, мы покажем всеобъемлющий протокол визуализировать эксперименты, которые включают изоляцию лимфоцитов из селезенки, мозг и яичек ZIKV-инфицированных мышей, подготовка Тетрамер_294-302 epitope E immunodominant и признание ZIKV-конкретных CD8 клетки⁺ T в immunoprivileged органах ZIKV-инфицированных мышей.

Предыдущие исследования показали, что живой ZIKV или его РНК могут быть обнаружены в сперме пациентов мужского пола, который указывает, что ZIKV может обойти барьер крови яички и повторить себя в репродуктивной системе²⁴. Ранее мы также показали, что ZIKV может вызвать повреждение яичек и привести к мужского бесплодия в²⁵мышей. ZIKV инфекция может привести к виремии в макаках, и вирусной РНК могут быть обнаружены в центральной нервной системе (ЦНС), а также в висцеральных органов. Иммуногистохимия показали, что ZIKV-специфические антигены были представлены в ЦНС и несколько периферийных органов²⁶. Кроме того, в мышиных моделях, ZIKV инфекция может вызвать надежные противовирусное CD8⁺ Т-клеточный ответ в селезенке и СНК²⁶.

По сравнению с предыдущей работы, это исследование устанавливает систематические методы для обнаружения ZIKV-конкретных CD8⁺ Т-клеточных реакций в мозге и яичек, которые immunoprivileged сайтов. Важно оценить функциональность вирус специфических Т-клеток в immunoprivileged органах ZIKV-инфицированных мышей. Использование тетрамера для обнаружения ZIKV-конкретных CD8⁺ Т-клеток ответов в immunoprivileged органах значительно укрепит наше понимание ZIKV инфекций и их принимающих иммунных реакций. Используя E Тетрамер_294-302 , вирус специфических Т-клеток в головном мозге и яички могут быть изолированы проточной цитометрии, расследовать клеточных механизмов защиты и иммунопатогенезе во время ZIKV инфекции. Между тем, это полезно для исследователей на изучение функций CD8 клетки⁺ T для управления ZIKV, или для повышения иммунопатогенезе в этих органах во время ZIKV инфекции.

Для анализа мышиных CD8 антиген специфические⁺ Т-клеток ответы в immunoprivileged органах, мы подготовили H-2D^b-E_294-302 Тетрамер и обнаружен CD8 клетки⁺ T подачей cytometry. Тетрамера являются мощным инструментом для выявления антигена специфичные Т-клетки. Здесь были созданы три типа флюрохром конъюгированных стрептавидина (APC, PE и BV421). Хотя Есть никаких статистически значимых отличий в APC-, BV421-и PE-меченых тетрамера для обнаружения антиген специфические Т-клеток, PE-меченых реализует-я тетрамера принесли наилучшие результаты. Следовательно PE-помечены Тетрамер был использован на протяжении всего этого исследования. Интересно, что основываясь на PE-меченых H-2D^b-E Тетрамер_294-302 , мы обнаружили высокое соотношение антиген специфические Т-клеток в головном мозге и яичек, которые показывают способность миграции вирус специфических Т-клеток из крови immunoprivileged органов.

Однако существуют некоторые ограничения к протоколу. H-2D^b-E_294-302 Тетрамер не является полезным для обнаружения человека Т-клеток, потому что Тетрамер обнаружения зависит от ограничений MHC. Показ immunodominant HLA-ограничено пептиды по-прежнему необходима. Кроме того ретро орбитальной инфекции эффективна для ZIKV инфекции, но может быть не удобно операции для некоторых следователей. Таким образом другие маршруты инфекции, включая брюшной полости, подкожно или внутривенно, также рекомендуется.

В протоколе, описанные здесь важнейшим шагом является изоляция моноциты из мозга и яички. Важно приобрести высококачественные лимфоцитов; Таким образом важно обратить внимание, например, центробежный скорость, прочность шлифовальных ткани и рассечение тканей мозга и яички. Кроме того для подготовки Тетрамер, Ингибиторы протеаз (PMSF, pepstatin, leupeptin) полезны при защите белок от ухудшается. Поэтому имеет смысл добавить ингибитор протеазы в refolding буфер и обмениваться буфера во время процесса подготовки Тетрамер.

В заключение мы представляем методы обнаруживать антиген специфические Т-клеток ответов в органах immunoprivileged модели Ifnar1^{- / -} мышь для ZIKV инфекции. Эта платформа может широко применяется для расследования иммунные механизмы новых и вновь возникающих вирусов, которые могут обойти барьеры между кровью и immunoprivileged органов. Кроме того это исследование может проложить путь для будущего развития вакцин и immunotherapies.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Z6	наша лаборатория		Ma W, Li S, Ma S, et al. Вирус Зика вызывает повреждение яичек и приводит к мужскому бесплодию у мышей. Cell, 2016, 167: 1511-1524 e1510
CD3	Санта-Крус	sc-1127; RRID: AB_631128
флуоресцеин-конъюгированный аффинипур козий античеловеческий IgG(H+L)	ZSGB-BIO	ZF-0308
Кролик против козы IgG, FITC конъюгированный	CWBIO	CW0115
FITC антимышиный CD3	Biolegend	17A2
APC антимышиный CD3	Biolegend	100236
PerCP антимышиный CD8a	Biolegend	100732
Percoll	GE Healthcare	P8370
PMSF	Ameresco	0754-5G	Токсичный и коррозионный реагент. Обращайтесь с осторожностью
Streptadivin	BD	S4762-FZ	Дает прозрачный раствор при 10мг/мл в PBS и  хранится при -20 °°; C
Пепстатин	Сигма	Р4265-5МГ	5 мг в 2,5 мл ДМСО, аликвоты хранят при -20 °Ордм; С
Лойпептин	Сигма	Л8511	5 мг в 2,5 мл дН<суб>2О, аликвоты хранят при - 20 °Ордм;
Пептиды	С Scilight-пептид		Должны быть ресуспендированы в ДМСО и храниться при температуре -20°С; C
RPMI 1640	Hyclone	SH30809.01	Необходимо хранить при температуре 4 °de; C
DMSO	MP		Хранить при комнатной температуре.
APC-Streptadivin	BD	554067	Должен храниться и обслуживаться при температуре<бр/> 4°C. Не замораживайте.
FITC-Streptadivin	BD	554060	Должен храниться и обслуживаться при температуре 4 °C. Не замораживайте.
PE-стрептадивин	BD	554061	Должен храниться и обслуживаться при температуре <4 >°C. Не замораживайте.
BV421-Стрептадвин	BD	563259	Необходимо хранить и обслуживать при температуре < бр/> 4 °C. Не замораживайте.
PageRuler Лестница из неокрашенного белка	Thermo Fisher Scientific	26614	Должен храниться при температуре 4°°; C
Клеточные фильтры	BF	BF10-5040	Хранить при комнатной температуре.
Amicon Ultra 100 kDa	Millipore	UFC510024	хранить при комнатной температуре.
Ультрацентрифуга	Thermo Fisher Scientific
Цитометр FACS Cantol			Flow должен содержать лазеры и фильтры, совместимые с используемой окрашивающей панелью.
Superdex 200 Увеличение 10/300 GL	GE healthcare	28990944
AKTA PURE	GE healthcare
буфер для лизиса эритроцитов	Solarbio	R1010	хранится при 4 °C.