Методическая статья

Целенаправленный и избирательный лечение плюрипотентных стволовых клеток тератомы, используя внешний пучка излучения в модели малого животных

DOI:

10.3791/58115

⸱

17 февраля 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Department of Medicine, Division of Cardiology, Stanford University School of Medicine, 3Medical Service, Cardiology Section, Veteran Affairs Palo Alto Health Care System, 4Department of Pathology, Stanford University School of Medicine, 5Department of Radiology, Molecular Imaging Program, Stanford University School of Medicine, 6Peking University Shenzhen Health Science Institute, 7Department of Radiation Oncology, Stanford University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследования по стратегиям тератомы плюрипотентных стволовых клеток лечение имеет важное значение для клинической перевод стволовых клеток. Здесь мы описываем протокол к, во-первых, генерировать стволовых клеток тератомы мышей и, затем, чтобы выборочно целевого и лечить эти опухоли в естественных условиях, с помощью малых животных облучателя.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Растущее число жертв «туризма стволовых клеток, «нерегулируемого трансплантация стволовых клеток по всему миру, выразили обеспокоенность по поводу безопасности трансплантации стволовых клеток. Хотя пересадка продифференцированы вместо недифференцированных клеток является обычной практикой, тератомы могут по-прежнему возникают от присутствия остаточных недифференцированных стволовых клеток во время пересадки или от спонтанных мутаций в продифференцировано клетки. Потому что терапия стволовой клетки часто поставляются в анатомически спецобъектов, даже небольшие опухоли может быть клинически разрушительным, что приводит к слепоте, паралич, когнитивные нарушения и сердечно-сосудистой дисфункции. Хирургический доступ на эти сайты также могут быть ограничены, оставив больных с несколько терапевтические возможности. Контроль за недостойное поведение стволовых клеток, таким образом, решающее значение для клинической перевод стволовых клеток.

Внешний пучка излучения предлагает эффективным средством доставки таргетная терапия уменьшения бремени тератома при сведении к минимуму травмы в окружающие органы. Кроме того этот метод позволяет избежать генетические манипуляции или вирусный трансдукции стволовых клеток, которые связаны с дополнительных клинических безопасности и эффективности. Здесь мы описываем протокол для создания плюрипотентных стволовых клеток тератомы мышей и применять внешние пучка лучевой терапии, чтобы выборочно удалять эти опухоли в естественных условиях.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Развитие терапии стволовой клетки для регенерации тканей столкнулся с рядом барьеров в последние несколько десятилетий, препятствуют усилиям по эффективной клинической развертывания. Эти препятствия включают бедных ячейки хранения на участках поставки, иммуногенность стволовых клеток и неопластические потенциал формы тератомы1. Tumorigenicity вызывает особое беспокойство клинических как он потенциально может нанести вред трансплантации стволовых клеток получателей2. Счетов образования опухоли из-за нерегулируемого стволовых клеток инъекции уже сообщалось в нескольких клинических параметров3,4,5. Потенциал для формирования тератома является наиболее часто цитируется клинических озабоченность в развитии плюрипотентных стволовых клеток (СМБ) и привела к задержки и отмены нескольких громких эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) испытания6,,78,9. Таким образом существует настоятельная необходимость для трансляционного расследования, выделенные на обеспечение надлежащего лечения, следует эти ятрогенные опухоли возникают.

На сегодняшний день, большинство стратегий для управления стволовых клеток проступок были направлены на сокращение числа ЦОНов с онкогенной потенциальных2,10. К сожалению только небольшое количество остаточного клеток (например,., 1 x 10-4 до 1 x 105 клеток11) необходим для формирования тератома, которая значительно ниже предела обнаружения котируется на имеющихся в настоящее время анализы12, 13. другие ограничения использования этих preseparation методы включают низкую эффективность и высокие расходы, зависимость от одноклеточного суспензий, которые не могут быть подходящими для новых подходов тканевой инженерии и потенциального обесценения ячейки выживание и приживления.

Несколько исследований были рассмотрены варианты лечения, после формирования тератома. Возможно наиболее изученной стратегии является включение «самоубийства» генов в стволовые клетки14,15. Этот метод предполагает, генетически манипулировать стволовых клеток для включения индуцибельной апоптоз активации генов, который может быть активирован фармакологических стимуляции postinjection, тем самым обеспечивая спасения подход, если вводили клетки производят тератомы. Этот подход, однако, страдает от существенных недостатков, включая эффекты пробить генетических модификаций ЦОНов и потенциал для постепенного развития наркотиков сопротивления16. Аналогичный подход использует малые молекулы побудить селективного клеточной гибели ЦОНов через ингибирование анти apoptotic пути17. Другие группы были направлены против смерти клетки ЦОНов с использованием антител против плюрипотентности поверхностных маркеров, такие как podocalyxin белка-1 (PODXL)18. Сроки доставки мелкомолекулярных или антитело стоит иметь значительное влияние на терапевтический потенциал Чок, если доставлено слишком рано и может отсутствовать терапевтической эффективности, если доставлен слишком поздно. Кроме того системные эффекты малых молекул и антитела, используемые в этой моде не были изучены.

Альтернативный подход к лечению этих опухолей опирается на использование внешний пучка излучения терапии (ДГТ). ДГТ является одним из основных механизмов, в настоящее время работают в лечении солидных опухолей19. Инновации в ДГТ, включая разработку наведение протонного луча и стереотаксической радиохирургии, позволили расширенной ориентации патологических структур избегая повреждения нормальной ткани, делая конформное ДГТ идеально подходит для решения тератома формирование в анатомически чувствительных структур20. Кроме того этот метод позволяет избежать генетические манипуляции или вирусный трансдукции стволовых клеток, которые оба сопряжено с дополнительных клинических безопасности и эффективности касается15. Наконец достижения в микро Облучатели позволили применение ДГТ в грызунов21.

В этой статье мы продемонстрируем создание малых животных модели формирования тератома путем инъекций человеческого iPSCs в мышах. Затем показано, как применять ДГТ выборочно искоренить эти опухоли в естественных условиях с минимальным ущербом для окружающих тканей. Этот подход обеспечивает таргетная терапия для СМБ производные тератомы избегая пробить последствий системных доставки биологических молекул и пептиды и генетические манипуляции Чок. Для исследуемого целей мы предлагаем необязательный шаг передавать стволовых клеток с генами репортер отслеживать через биолюминесценции изображений (BLI) опухоли ответ к лучевой терапии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот эксперимент животных была одобрена и выполняются институциональных Наблюдательный Совет и административный Группа на лабораторных животных уход в Стэнфордском университете.

1. клеточной культуры iPSCs

  1. Расти человеческого iPSCs, получаемых лентивирусные перепрограммирования на 6-ну пластины с покрытием с базальной мембраны матрица (например, matrigel, называется матрица расписка).
  2. Ежедневная смена СМИ iPSCs с обогащенной питательной среды (см. Таблицу материалы) инкубации при 37 ° C и 5% CO2.
  3. После того, как клетки достичь слияния 80 – 90% (примерно каждые 4 дня), добавьте 1 mL рекомбинантных клеток диссоциации фермента (см. Таблицу материалы) в хорошо и инкубировать при 37 ° C за 5 мин.
  4. После 5 минут отмежеваться клетки из колодца, дозирование, передавать их на 15 мл и центрифуги на 300 x g.
  5. После центрифугирования, аспирационная супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в обогащенных питательной среды (см. Таблицу материалы) обогащенный ингибитор Y27632 на 1:1,000 разрежения.
  6. Выполните клеток, количество диссоциированных клеток и replate на ячейки матрицы покрытием 6-ну пластины на плотности тарелок5 2 x 10-4 x 105.

2. трансдукции iPSCs с двойной фьюжн Репортер ген

  1. Прохождение iPSCs в 6-ну плиты в соответствии с обычной и добавить обогащенного питательной среды (см. Таблицу материалы) содержащий 6 мкг/мл hexadimethrine бромида.
    Примечание: Размер идеально колонии — 200 – 400 клеток/колонии для получения максимальной эффективности трансдукции.
  2. Концентрат самостоятельно инактивирующего человека, перевозящих Светлячок Люцифераза и Зеленый флуоресцентный белок (флуктуации eGFP) обусловлен человека убиквитин promotor-C центрифугированием отложений с ротором SW-29 на 50 000 x g втечение 2 ч при 4 ° C.
  3. Добавить вирусный концентрат iPSCs в 6-ну пластины на разносторонности инфекции (МВД) 10 и инкубировать на ночь при 37 ° C на 5% CO2.
    Примечание: Обилие инфекции определяется выражением мономерных флуоресценции белков анализируемой флуоресценции активированный ячейку Сортировка сканирования (СУИМ).
  4. Следующий день, удалите вирус центрифугированием iPSC 6-ну плит на 300 x g 6 мин при комнатной температуре.
  5. Изменить средства массовой информации ежедневно с обогащенной питательной среды (см. Таблицу материалы) и проход в соответствии с протоколом. Используйте микроскопом для определения эффективности приблизительное трансдукции для eGFP флуоресценции.
  6. КПД 30 – 40% является достаточным для сортировки СУИМ. Перейти к FACS hiPSCs, выражая eGFP, если по крайней мере 30 – 40% клеток выразить eGFP.
  7. Для подтверждения активности флуктуации ex vivo, плиты клетки, выражая GFP, отсортированных по СУИМ на плотности тарелок 5 000 ячеек на хорошо.
  8. Инкубировать transduced клетки и не преобразованы клетки (которые будут служить в качестве отрицательного контроля) с репортером биолюминесценции зонд D-Люциферин (100 мкмоль/Л) для 6 h. измерения биолюминесценции с spectrofluorometer Гонав.

3. трансплантация ЦОНов в спинной бочку для формирования тератома иммунодефицитных мышей

  1. Добавьте 1 mL рекомбинантных клеток диссоциации фермента смеси на 6-ну пластину, содержащие человеческого iPSCs, преобразованы в культуре (см. раздел 2) с двойной фьюжн Репортер ген (флуктуации-GFP) и инкубировать в течение 5 мин.
  2. После инкубационного периода разогнать клетки пипеткой аспирации и выражения. Добавить равное количество питательной среды и затем центрифуги на 250 x g на 4 мин.
  3. После центрифугирования, аспирационная супернатанта решение, Ресуспензируйте Пелле клеток в 30 мкл матрицы и поместите его на льду сохранять свою жизнеспособность до инъекции. Подтвердите урожай 1 х 106 клеток с помощью Горяева.
  4. Если используя двойной фьюжн Репортер ген transfected клеток, приостановите двойной положительных клеток СУИМ (раздел 2) в 30 мкл матрицы.
  5. Побудить анестезии в неделю 8-10 Атинические обнаженной мышей с использованием isoflurance 2% кислорода 1 Л/мин и затем использовать обслуживания 2% изофлюрановая с 1 Л/мин кислорода.
  6. С помощью шприца 28,5 G, вставки ячейки/матрица смеси (см. Таблицу материалы) подвеска в подкожной пространство на фланге, направленных для инъекций в всего 5 x 103 -5 х 106 клеток (примерно 100 ul на инъекцию).
  7. Рассмотрим более хвостового инъекции сайт, если вы планируете сохранить мышей для длительного периода времени и прогнозирования роста большой опухоли.
  8. Наркотизированных животных разрешено восстановить на площадку с подогревом до амбулаторных (обычно < 1h) с мониторинг частоты дыхания, кожи цвет ног до амбулаторно.

4. биолюминесценции, Визуализация (BLI) пересаженные клетки для оценки выживаемость клеток и рост тератома

  1. На нужную timepoints после прививки выполните внутрибрюшинной инъекции (IP) 375 мг/кг репортер зонда D-люциферин в мышей.
  2. 10 мин после инъекции IP, изображение биолюминесценции сигнал на наркотизированных животных (выполняется, как описано в разделе Шаг 3.5) 30 мин, с использованием windows приобретение 1 мин интервалом 5-мин.
    Примечание: Рекомендуется загрузок изображения приобретений. Анестезия сохраняется во время визуализации, обеспечивая вдыхании изофлюрановая через носовой конус.
  3. Для анализа данных нарисуйте региона интерес (ROI) над BLI сигнала и, затем, нормализуют время приобретения для количественного определения выбросов в единицах максимальная фотонов в секунду на квадратный сантиметр за стерадиан (/sr фотоны/s/см2).

5. тератома облучения с помощью доклинических изображение руководствуясь облучателя (рис. 1)

  1. Анестезировать мышь в нокдаун коробку с помощью 2% изофлюрановая в 100% кислорода со скоростью потока 1 Л/мин. После того, как мышь полностью под наркозом, передача его в постели образ руководствуясь доклинические облучатель (см. Таблицу материалы). Поддержание анестезии на 2% изофлюрановая непрерывно через носовой конус.
  2. Получить микро CT изображения как набор 400 проекции изображений свыше 360°, с использованием 40 kVp, 2 мА рентгеновского пучка и восстановить их в объемных изображений с изотропной пикселя размером 0,2 мм.
  3. Планирование лучевой терапии с помощью микро КТ изображений с помощью программного пакета RT_Image (http://rtimage.sourceforge.net/) и выполнить лечение.
    Примечание: План лечения, используемый состоит из двух 225 kVp рентгеновских лучей, ориентированные пройти через поверхностные целевой тератома плинтуса поверхности остальнои мыши и щадящие базовой внутренностей. Время экспозиции для балок корректируются на основе ежеквартальных системы калибровки данных так, что доза в центре целевой опухоль была 6 гр.
  4. Повторите процесс лечения на три дня подряд доставить целевых опухоли в общей сложности 18 гр.
  5. Поддерживать стандартные после лечения, ухода за животными.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Обычно вводится мышей продемонстрируют тератома роста формирования после 4 – 8 недель, как это подтверждается BLI изображений (рис. 2). Опухоли будет резко сокращаться при облучении с суммарной дозы 18 гр, один месяц после родов клеток, что приводит к значительному уменьшению Люцифераза сигнал (рис. 2). Важно отметить, что нормальных тканей, принятых 5 мм из облученного сайта не имеют каких-либо значительных повреждений (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Доклинические данные и анекдотические случаи от жертв «стволовых клеток туризма» подтверждают, что риск развития тератомы является серьезным недостатком, связанные с лечения PSC23. Таким образом, развитие внимательного подхода для предотвращения и лечения опухолевой риск, связанный с клеточной терапии является важным шагом в содействии клинический перевод восстановительной клеточной терапии. В этой статье мы описал метод терапевтических ориентации PSC-связанные тератомы, используя ДГТ в мышиной мо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить национальных институтов из здравоохранения R01 HL134830 (ПКН), K08 HL135343 (KS) и 5F32HL134221 (микропроцессорный); Говард Хьюз медицинский институт (ASL); и Институт сердечно-сосудистой Стэнфорд (ASL) за их поддержку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Индуцированная плюрипотентная линия контроля стволовых клетокСтэнфордский университетНгуен ЛабораторияКлеточная культура iPSC
Матрица базальной мембраны Corning matrigel 354234Fisher ScientificCB-40234Клеточная культура iPSC
Essential 8 питательная средаATCC-Глобальный центр биоресурсов30-2203Клеточная культура iPSC
Tryple EGibco12605-036Клеточная культура ингибитора iPSC
Y27632 HCL (ROCK Inhibitor)Fisher ScientificS104950MGКультура клеток iPSC
LentivirusCyagenP170721-1001cjnТрансдукция iPSC с двойным слиянием репортерного гена
Polyrbrene Инфекция/ТрансфекцияMillipore SigmaTR-1003-GТрансдукция iPSC с двойным слиянием репортерного гена
Репортерный ген fluc-eGFP, управляемый убиквитиновым промоутеромСтэнфордский университетЛаборатория Сэма ГамбхираТрансдукция iPSC с двойным слиянием репортерного гена
D-люциферинаПеркинЭлмер 122799Трансдукция iPSC с двойным слиянием репортерного гена и
проточного цитометра BLI (BD FACSARIA III)BD Biosciences FACSAriaТрансдукция iPSC с двойным слиянием репортерного гена
микропланшетным спектрофлуориметром (Glomax Navigator System)Promega Bio Systems, Саннивейл, КалифорнияGM2000Трансдукция iPSC с двойным слиянием репортерного гена
Xenogen IVIS 200 Perkin Elmer124262BLI
IsofluraneSigma-AldrichCDS019936облучении
X-Rad SmART облучатель с визуальным контролем Precision X-ray Inc., Норт-Бранфорд, CTX-Rad SmARTоблучение
RT_Image программным пакетомСтэнфордский университет (http://rtimage.sourceforge.net/)RT_Image v0.2βоблучение

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sallam, K., Wu, J. C. Embryonic stem cell biology: insights from molecular imaging. Methods in Molecular Biology. 660, 185-199 (2010).
  2. Lee, A. S., Tang, C., Rao, M. S., Weissman, I. L., Wu, J. C. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nature Medicine. 19 (8), 998-1004 (2013).
  3. Amariglio, N., et al. Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient. PLOS Medicine. 6 (2), e1000029(2009).
  4. Kuriyan, A. E., et al. Vision Loss after Intravitreal Injection of Autologous "Stem Cells" for AMD. The New England Journal of Medicine. 376 (11), 1047-1053 (2017).
  5. Berkowitz, A. L., et al. Glioproliferative Lesion of the Spinal Cord as a Complication of "Stem-Cell Tourism". The New England Journal of Medicine. 375, 196-198 (2016).
  6. Zhang, W. Y., de Almeida, P. E., Wu, J. C. Teratoma formation: A tool for monitoring pluripotency in stem cell research. StemBook. , The Stem Cell Research Community. (2012).
  7. Scott, C. T., Magnus, D. Wrongful termination: lessons from the Geron clinical trial. STEM CELLS Translational Medicine. 3 (12), 1398-1401 (2014).
  8. Strauss, S. Geron trial resumes, but standards for stem cell trials remain elusive. Nature Biotechnology. 28 (10), 989-990 (2010).
  9. Coghlan, A. Unexpected mutations put stem cell trial on hold. New Scientist. 227 (3033), 9(2015).
  10. Tang, C., et al. An antibody against SSEA-5 glycan on human pluripotent stem cells enables removal of teratoma-forming cells. Nature Biotechnology. 29 (9), 829-834 (2011).
  11. Lee, A. S., et al. Effects of cell number on teratoma formation by human embryonic stem cells. Cell Cycle. 8 (16), 2608-2612 (2009).
  12. Tano, K., et al. A novel in vitro method for detecting undifferentiated human pluripotent stem cells as impurities in cell therapy products using a highly efficient culture system. PLoS One. 9 (10), e110496(2014).
  13. Kuroda, T., et al. Highly sensitive in vitro methods for detection of residual undifferentiated cells in retinal pigment epithelial cells derived from human iPS cells. PLoS One. 7 (5), e37342(2012).
  14. Cao, F., et al. In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery. Circulation. 113 (7), 1005-1014 (2006).
  15. Cao, F., et al. Molecular imaging of embryonic stem cell misbehavior and suicide gene ablation. Cloning Stem Cells. 9 (1), 107-117 (2007).
  16. Kotini, A. G., de Stanchina, E., Themeli, M., Sadelain, M., Papapetrou, E. P. Escape Mutations, Ganciclovir Resistance, and Teratoma Formation in Human iPSCs Expressing an HSVtk Suicide Gene. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 5, e284(2016).
  17. Smith, A. J., et al. Apoptotic susceptibility to DNA damage of pluripotent stem cells facilitates pharmacologic purging of teratoma risk. STEM CELLS Translational Medicine. 1 (10), 709-718 (2012).
  18. Choo, A. B., et al. Selection against undifferentiated human embryonic stem cells by a cytotoxic antibody recognizing podocalyxin-like protein-1. Stem Cells. 26 (6), 1454-1463 (2008).
  19. Yorke, E., Gelblum, D., Ford, E. Patient safety in external beam radiation therapy. American Journal of Roentgenology. 196 (4), 768-772 (2011).
  20. Zhou, H., et al. Development of a micro-computed tomography-based image-guided conformal radiotherapy system for small animals. International Journal of Radiation Oncology • Biology • Physics. 78 (1), 297-305 (2010).
  21. Slatkin, D. N., Spanne, P., Dilmanian, F. A., Gebbers, J. O., Laissue, J. A. Subacute neuropathological effects of microplanar beams of x-rays from a synchrotron wiggler. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (19), 8783-8787 (1995).
  22. Lee, A. S., et al. Brief Report: External Beam Radiation Therapy for the Treatment of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Teratomas. Stem Cells. 35 (8), 1994-2000 (2017).
  23. Berkowitz, A. L., et al. Glioproliferative Lesion of the Spinal Cord as a Complication of "Stem-Cell Tourism". The New England Journal of Medicine. 375 (2), 196-198 (2016).
  24. Swijnenburg, R. J., et al. In vivo imaging of embryonic stem cells reveals patterns of survival and immune rejection following transplantation. Stem Cells and Development. 17 (6), 1023-1029 (2008).
  25. Cao, F., et al. Noninvasive de novo imaging of human embryonic stem cell-derived teratoma formation. Cancer Research. 69 (7), 2709-2713 (2009).
  26. Priddle, H., et al. Bioluminescence imaging of human embryonic stem cells transplanted in vivo in murine and chick models. Cloning and Stem Cells. 11 (2), 259-267 (2009).
  27. Dale, R. G. Dose-rate effects in targeted radiotherapy. Physics in Medicine & Biology. 41 (10), 1871-1884 (1996).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи