Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

В естественных условиях модель мыши для активации Т-клеток CD4 наивно мера, пролиферации и дифференцирования Th1, индуцированных дендритные клетки костного мозга, полученных

18.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58118

⸱

22 августа 2018 г.

 ,  ,  , 
1LamImSys Lab, Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), 2LamImSys Lab, Instituto de Investigación Sanitaria Hospital 12 de Octubre (imas12), 3CIBER de Enfermedades Cardiovasculares

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол для определения в vivo наивно CD4 T клеток (Т-клеток) активации, пролиферации и дифференцирования Th1, вызванных костного ГМ-КСФ (BM)-дендритные клетки (DCs). Кроме того этот протокол описывает BM и T-cell изоляции, поколения DC и DC и T-cell приемных передачи.

Аннотация

Количественная оценка активации клеток CD4 T наивными, пролиферации и дифференцировки Т-хелперами 1 (Th1) клетки является полезным способом оценить роль, которую играет Т-клеток в иммунной реакции. Этот протокол описывает в vitro дифференциация предшественники костного мозга (БМ) для получения гранулоцитов, макрофагов, колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) производные дендритные клетки (DCs). Протокол также описывает приемных передачи овальбумина пептида (OVAp)-загружен ГМ-КСФ производные DCs и наивно CD4 Т-клеток от OTII трансгенных мышей с целью проанализировать в естественных условиях активации, пролиферации и дифференцирования Th1 из переданные CD4 Т-клеток. Этот протокол позволяет обойти ограничения методов исключительно в естественных условиях введенных неспособность специально манипулировать или выбрать популяции клеток изучены. Кроме того этот протокол позволяет исследования в среде в естественных условиях , таким образом избегая изменения функциональных факторов, которые могут произойти в пробирке и в том числе влияние типов клеток и других факторов, можно найти только в неприкосновенности органов. Протокол является полезным инструментом для создания изменений в DCs и Т-клеток, изменить адаптивного иммунного ответа, предоставляя потенциально важные результаты для понимания происхождения или развитие многочисленных сопутствующих заболеваний иммунной.

Введение

CD4 Т-клеток и антиген представляющих клеток (БТР), таких как контроллеры домена, требуется посредников иммунитета к патогенных микроорганизмов в1,2. В периферических лимфоидных органов CD4 Т-клеток активируются после признания специфических антигенов, представленный БТР3,4,5. Активированные клетки CD4 T размножаться и дифференцироваться в отдельных конкретных эффекторных клеток Th, которые необходимы для разработки правильной адаптивного иммунного ответа6,7. Контроль этих процессов имеет решающее значение для производства адекватной адаптивной обороны, который убивает возбудителя не производит вредных тканей повреждения8. Й клетки определяются согласно выражение или производства поверхности молекул, факторов транскрипции и эффекторных цитокинов и выполняют функции основных и точные в ответ на патогены1. Клетки подмножества ячеек Th1 Экспресс транскрипционный фактор T-Бет и цитокинов интерферона гамма (IFNγ) и участие в принимающей обороны против внутриклеточных возбудителей1. Количественное определение активации клеток CD4 T наивными, пролиферации и дифференцирования Th1 является полезным средством оценки роли T клетки играют в иммунного ответа.

Этот протокол позволяет в vivo анализ способности in vitro -генерируется BM-производные DCs для модуляции активации, пролиферации и дифференцирования Th1 наивно CD4 Т-клеток. Протокол также служит, чтобы оценить способность клеток CD4 T наивно быть активирована, индуцированной размножаться, и Th1 дифференцированной (рис. 1). Этот универсальный протокол обходит неспособность специально манипулировать или выбрать исследованных клеток населения в чисто в vivo протоколы. Эффекты различных молекул и лечения на контроллерах домена могут быть изучены с помощью BM от генетически измененных мышей5 или лечения или генетически манипулировать изолированных BM клетки9. Аналогичным образом Т-клеток ответов могут быть изучены путем получения Т-клетки для приемных передачи из различных источников или после нескольких манипуляций3,8,10.

Основные преимущества этого протокола являются двоякими. Активация т-клеток, пролиферации и дифференцирования Th1 анализируются с подходом цитометрия потоков; и это в сочетании с в vivo исследований, таким образом предотвращение изменения, которые могут произойти в пробирке и включая типы клеток и другие факторы, которые можно найти только в неприкосновенности органов11.

Жизненно красители используются широко используемый метод для отслеживания пролиферации клеток, избегая использования радиоактивности. Измерения распространения с этих реагентов на основе красителя разбавления после деления клеток. Кроме того эти красители могут быть обнаружены на нескольких длинах волн и легко анализируются проточной цитометрии в сочетании с несколькими флуоресцентные антитела или маркеров. Мы подчеркнуть полезность настоящего Протокола, показывая, как активация Т-клеток, пролиферации и дифференцирования Th1 могут быть проанализированы по проточной цитометрии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Экспериментальные процедуры были утверждены Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Карлоса III (CNIC) и Autónoma Comunidad де Мадрид в соответствии с испанскими и европейскими директивами. Мыши были разведены в конкретных патогеном бесплатно (SPF) условиях и были умерщвлены вдыханием двуокиси углерода (CO2).

1. изоляция клетки костного мозга мыши от Tibias и бедра

Примечание: C57BL/6 congenic мыши штамм несет дифференциального лейкоцита маркер Ptprc, обычно признаются CD45.1 или Ly5.1, в то время как одичал тип C57BL штаммы нести аллеля Ptprcb , известный как CD45.2 или Ly5.2. CD45.1 и CD45.2 варианты можно отличить по проточной цитометрии с использованием антител. CD45.1, CD45.2 и CD45.1/CD45.2 мышей может использоваться как мобильные источники или получателей для приемных передачи, позволяя трассировки различных клеточных популяций подачей cytometry. Предпочтительно использовать возраст- и секс согласованной мужского или женского пола мышей ниже 12-недельного возраста.

  1. Подготовка бедра и Tibias
    1. Усыпить мышей с использованием протокола, одобренного Комитетом институционального ухода за животными.
    2. Продезинфицируйте задних конечностей путем опрыскивания поверхности животных с 70% этиловом спирте.
    3. Используйте стерильные ножницы, пинцет и скальпели. С помощью скальпеля сделать разрез в коже и снять кожу от дистальной части мыши, включая кожу, охватывающих задней конечности. Пил кожи вокруг нижней икроножных мышц и полностью удалить кожу с ног (рисунок 2A, 2B).
    4. Отделите четырехглавой мышцы от бедра с помощью скальпеля. Disarticulate тазобедренного сустава не нарушая головку бедренной кости. Снять мышцы голени с помощью скальпеля (рис. 2 c, 2D). Отделите бедренной кости от голени не нарушая концы костей.
    5. Держите кости в чашке Петри, содержащие 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1% пенициллина/стрептомицина в ледяной 1 x Розуэлл парк Мемориальный институт (RPMI) 1640 среде.
  2. Изоляция клетки
    Примечание: Все последующие шаги должны выполняться под капотом культуры и стерильным материалом, чтобы избежать загрязнения.
    1. В стерильные Петри тщательно Отрежьте проксимальном и дистальном концы каждой кости с помощью скальпеля.
    2. Промойте кости неоднократно с общим объемом 10 мл теплой полный RPMI среды (RPMI + 10% FBS, 2 мм ЭДТА, 1% пенициллина/стрептомицина, 20 мм HEPES, 55 мкм 2-меркаптоэтанол, пируват натрия 1 мм и 2 мм L-глютамин). Промойте кости с обоих концов, с помощью иглы 25 G прилагается к 1 мл шприц.
    3. Передача effluate в 50 мл Конические трубки оснащены 70 мкм нейлон веб-фильтр. Осторожно выбить мусора и клеток конгломератов нежное перемешивании и закупорить.
    4. Центрифуга суспензию клеток на 250 x g 10 мин при комнатной температуре (RT).
    5. Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл холодного эритроцитов-литического буфера (0,15 М NH4Cl + 1 мм KHCO3 + 0,1 мм ЭДТА, скорректированные pH 7.2 с HCl 1 N, 0,4 мкм стерильным фильтруются и хранить при 4 ° C). Сохранить на льду за 5 мин с руководством встряхивания.
    6. Добавьте 10 мл холодного буфера (1 x-фосфатный буфер (PBS) + ЭДТА 2 мм + 2% бычьим сывороточным альбумином (БСА)) инактивирует и промывают буфера lysis клеток красной крови.
    7. Центрифуга суспензию клеток на 250 x g 5 мин при 4 ° C.
    8. Вымыть клетки с 25 мл полного RPMI среднего и центрифуги на 250 x g 5 мин при 4 ° C.
    9. Ресуспензируйте клетки в 5 мл полного RPMI среды. Mix 50 мкл суспензии клеток с Трипановый синий 1:1. Определите номер ячейки в Счетной палате под микроскопом. Расчет количества клеток, используя формулу: клеток/мл = [(не окрашенных клеток фото/4) x 2 x 10000]12.
      Примечание: Этот метод урожайности 40 x 106 -60 x 10-6 костных клеток костного мозга на неинфицированных 8-12 недельных C57BL/6 мыши.
    10. Центрифуга суспензию клеток на 250 x g 5 мин при 4 ° C.

2. DC дифференциации, созревания и антиген загрузки

  1. BM клеток уборки
    1. Семя полный культуры на поверхности пластины 6-ну ультра-Низкий-насадку на 106 клеток / мл среды, обычно в 5 мл на хорошо. Дифференцированные макрофаги будет приложить к культуре пластины. После 12 h передачи супернатанта, который в основном содержит моноцитов, чтобы очистить пластины 6-Ну, отбрасывая старые 6-ну пластины с придерживался макрофаги.
    2. Для содействия дифференцировки клеток, культура клетки не сторонник на 5 x 105 клеток / мл в обычно 5 мл на хорошо полного среднего RPMI, содержащий 20 нг/мл, коммерчески полученные рекомбинантных мышиных ГМ-КСФ при 37 ° C и 5% двуокиси углерода (CO2) и наблюдать ежедневно.
    3. Каждые 3 дня, спина вниз подвесной клетки и собирать адэрентных клеток с 5 мм ЭДТА в PBS и вращаться вниз. Объединить и Ресуспензируйте на 5 x 105 клеток/мл в свежих носитель, содержащий 20 нг/мл rm-GM-CSF.
    4. На 8 день собирать сторонником и отдельные клетки как выше и Ресуспензируйте 5 x 105 клеток/мл в средних содержащий 20 нг/мл ГМ-КСФ и 20 нг/мл липополисахарида (LPS) за 24 ч в тканевой культуры пропитанная стерильные Петри, чтобы побудить высокой MHC-II , CD80 и CD86 выражения.
    5. Проверка DC дифференциация подачей cytometry, как указано в шаге 2.2.
  2. Потока цитометрии дифференцировки и созревания анализ.
    1. Центрифуга суспензию клеток на 250 x g 5 мин при 4 ° C. Повторите этот шаг два раза.
    2. Блок Fc рецепторов по инкубации Пелле ресуспензированы клеток в мыши ФК блокатора рецепторов (очищенный анти мыши CD16/CD32 IgG антитела2b ) для 15 мин при температуре 4 ° C согласно инструкциям производителя.
    3. Центрифуга суспензию клеток на 250 x g 5 мин при 4 ° C.
    4. Для каждого зонда Ресуспензируйте 250.000 клеток в 300 мкл буфера потока цитометрии (1 x PBS + ЭДТА 2 мм + 2% BSA) при 4 ° C.
    5. 30 мкл раствора клеток на хорошо передавать 96-хорошо пластины.
    6. Центрифуга суспензию клеток на 250 x g 5 мин при 4 ° C.
    7. Отменить супернатант и 30 мкл антител содержащие буфер для каждой хорошо после указания производителя. Инкубировать клетки с антитела для 20 мин при 4 ° C.
      Примечание: Обычно используемых маркеров для DCs, моноциты и макрофаги являются CD11b, CD64, CD115, CD11c, MHCII, CD80 и CD86 (рис. 3).
    8. Центрифугуйте образцы на 250 x g 5 минут при температуре 4 ° C и Ресуспензируйте в 200 мкл на хорошо холодного потока цитометрии буфер, содержащий маркер, чтобы исключить мертвые клетки (например, пропидий йодидом, 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) или Амин реактивных красителей ) на производителя рекомендуемая концентрация13.
    9. Контролировать дифференцировки клеток путем передачи образцов цитометрии расходомерных трубок и выполнение анализа цитометрии потока, исключая мёртвые клетки на 0, 3, 6 и 9 дней.
  3. Загрузка DC антигена.
    1. На 8 день, Центрифугуйте образцы на 250 x g 5 минут при температуре 4 ° C и Ресуспензируйте гранулы в 200 мкл среднего (RPMI + 10% FBS без антибиотиков). Повторите этот шаг два раза.
    2. Инкубировать DCs с 10 мкг/мл OVAp (323-339; ISQAVHAAHAEINEAGR) за 1 x 107 DCs в 1 мл среды (RMPI + 1% FBS) в пластиковой трубки для по крайней мере 30 минут при 37 ° C. Используйте не загружен OVAp РС как условие отрицательного контроля.
    3. Центрифугуйте образцы на 250 x g 5 минут при температуре 4 ° C и Ресуспензируйте гранулы в 200 мкл полный RPMI среде. Повторите этот шаг два раза.
    4. Центрифугуйте образцы на 250 x g 5 минут при температуре 4 ° C и Ресуспензируйте гранулы в 200 мкл среднего (RPMI + 10% FBS) на 2 x 106 клеток/мл.

3. изоляция наивно CD4 Т-клеток от OTII мышей

Примечание: Этот метод дает примерно 100 х 106 spleenocytes на неинфицированных 8 12 недельных C57BL/6 мыши. Может использоваться как мужчин, так и женщин. CD4 Т-клеток могут быть изолированы от селезенки и лимфатических узлов; CD4 Т-клеток приходится приблизительно 25% и 50% клеток в этих органах, соответственно. Выполните следующие действия в стерильных условиях.

  1. Изолировать паховые, подмышечные, плечевого, шейки матки и брыжеечных лимфатических узлах и селезенке от OTII трансгенных мышей (Рисунок 4) и передавать их на пластиковые Петри, содержащие 10 мл полного RPMI среднего.
  2. Промывать ячейки ситечко с 2 мл полного RPMI среды и удалить его из 50 мл трубки. Передачи лимфатических узлов и селезенки стрейнер ячейки 70 мкм помещены в 50 мл трубки. Однородный, используя поршень шприца (рис. 5) и добавить среднего до 15 мл.
  3. Центрифугуйте образцы на 250 x g 5 минут при температуре 4 ° C и Ресуспензируйте гранулы в 15 мл полного RPMI среды. Повторите этот шаг два раза.
  4. Суспензию клеток селезенки Ресуспензируйте Пелле клеток и лизируют красные кровяные клетки, как указано в шаге 1.2.5.
  5. Центрифуга суспензию клеток на 250 x g 5 мин при 4 ° C.
  6. Вымыть клетки с 25 мл полного среднего RPMI и центрифуги на 250 x g 5 мин на RT.
  7. Ресуспензируйте клетки в 5 мл среды. Смешайте 50 мкл суспензии клеток 1:1 с Трипановый синий. Определите номер ячейки, используя Счетной палате под микроскопом. Расчет количества клеток, используя формулу: клеток/мл = [(не окрашенных клеток фото/4) x 2 x 10000]12.
  8. Повторите шаг 2.2.2.
  9. Следуя инструкциям изготовителя инкубации клеток с терапевтами разведений биотинилированным антител к CD8α, IgM, B220, CD19, MHCII (I-Ab), CD11b, CD11c, CD44, CD25 и DX5 30 мин на льду для позднее негативный выбор CD4 Т-клеток.
  10. Следуя инструкциям производителя и основываясь на количество клеток и количество шариков, рассчитать необходимое количество стрептавидина покрытием магнитные микрошарики и изолировать CD4 Т-клеток с помощью разделителя магнитные клеток и соответствующие разделения столбцов.
  11. Ресуспензируйте клетки в 5 мл полного RPMI среды и держать их на льду во время подсчета живые клетки, как описано в пункте 3.7.
  12. Экстракт 2 x 105 клеток и проверьте чистоту собранного клеток с помощью анти-CD3, CD4 и CD8, B220 флуоресцентных антител в проточный цитометр, используя рекомендации производителя разбавления антитела.
  13. Пятно изолированных наивно CD4/OTII Т-клеток, Ресуспензируйте 106 клеток в 500 мкл буфера (1 x PBS + ЭДТА 2 мм + 2% BSA). Подготовка 500 мкл буфера (1 x PBS + ЭДТА 2 мм + 2% BSA) содержащий двойной конечная концентрация рекомендованный изготовителем жизненно важных клеток трассирующими красителя. Смешайте оба решения, медленно добавляя решение трассирующими сотовый к суспензии клеток. Инкубировать клетки для 5 минут при 37 ° C.
  14. Вымыть клетки с 5 мл полного среднего RPMI и центрифуги на 250 x g 5 мин при 4 ° C. Повторите этот шаг два раза. Ресуспензируйте клеток в 1 мл полного RPMI среды в 1 x 10-7кл/мл.

4. в естественных условиях активации, распространением и Th1 дифференциация Assay

Примечание: Жизненно важные ячейки трассирующими красителя Карбоксифлуоресцеина диацетата succinimidyl эфира (CFSE) и другие succinimidyl на основе эфира красители, которые рады и излучают флуоресцирования на разных длинах волн, широко используются для оценки распространения лимфоцитов потока цитометрии из-за их высокой флуоресценции интенсивности, Лонг жизнь, низкой изменчивости и низкой токсичности14.

  1. Восприимчивую (и.в.) 1 x 106 живой клетки жизненно важные трассировочные краситель окрашенных наивно T CD4/OTII клетки в 100 мкл PBS на мышь внутривенно перехода. Обозначение Т-клетки могут передаваться восприимчивую хвост вен или ретро орбиталь инъекций15; в обоих случаях клетки будет домом для лимфоидных органов (рис. 6A).
  2. Вызов получателя мышей один день позже передав восприимчивую 100000 LPS-созрел OVAp загружен DCs подкожно (с.и.) в башмаки (Рисунок 6B).
  3. Урожай подколенной лимфоузлов от получателей мышей и их обработку до получения одного клеточных суспензий после те же шаги, как описано ранее в 3.1 и 3.2. Сделать это на 2 день после иммунизации для измерения активации клеток CD4/OTII Т и день 5 для измерения распространения плюс Th1 дифференциации.
  4. Для анализа активации клеток T на 2 день, запятнать клетки с флуоресцентных антител против CD4, CD69 и CD25 (опционально CD45.1 и CD45.2) и определить процент C69+CD25+ T-клеток CD4 населения. Анализировать проточной цитометрии (рис. 7).
  5. Чтобы проверить пролиферации клеток T на 5 день, пятно клеток с использованием соответствующих флуоресцентных антител против CD4 и, при необходимости, CD45.1 и CD45.2. Проанализируйте разрушение жизненно важные трассировочные краситель сигнала численности CD4 проточной цитометрии (рис. 8). Можно определить несколько параметров в этих исследованиях, таких как количество клеточных делений претерпела клетками, помечены краситель трассирующими жизненно важных клеток, процент деления клеток в каждом пика флуоресценции и процент деления клеток в ячейке населения.
  6. Чтобы определить Th1 дифференциации в день 5, плиты 400 000 ячеек на хорошо 96-луночных плиты в 200 мкл полного среднего RPMI, содержащие 1 мкм ionomycin и 10 нг/мл phorbol 12 миристат 13 ацетат (PMA) за 6 ч при 37 ° C в инкубаторе. За последние 4 часа добавьте 3 – 10 мкг/мл brefeldin A блокировать секрецию цитокинов на носитель.
  7. Центрифуга для пластин для 5 мин на 250 x g при 4 ° C. Отказаться от супернатанта, быстрое инверсии 96-луночных пластины.
  8. Повторите шаг 2.2.2.
  9. Пятно клеточных мембран, инкубации 15 мин при температуре 4 ° C в 30 мкл буфера (1 x PBS + ЭДТА 2 мм + 2% BSA) содержащий антител на CD4 и, при необходимости, CD45.1 и CD45.2 на рекомендованный изготовителем разведениях. Вымыть клетки путем добавления 150 мкл буфера (1 x PBS + ЭДТА 2 мм + 2% BSA) и центрифуги пластины для 5 мин на 250 x g при 4 ° C и удалить супернатант.
  10. Исправить ячейки, добавив 100 мкл paraformaldehyde/1% 2% сахарозы для 20 мин на RT. центрифуги пластины для 5 мин на 1000 x g и 4 ° C. Выбросите супернатант.
  11. Разрушения клеток, добавляя 50 мкл буфера внутриклеточных permeabilization (1 x PBS + 0.1% BSA, 0,01 М HEPES, 0.3% сапонин) и Инкубируйте 30 мин при 4 ° C.
  12. Добавьте 150 мкл PBS и центрифуги для 5 мин на 1000 x g на RT. удалить супернатант.
  13. Пятно внутриклеточных цитокинов, добавив 30 мкл конъюгированных Флюорофор анти IFNγ антитела в буфере (PBS + 0.1% сапонин) и Инкубируйте 30 мин на RT.
  14. Вымойте клетки путем добавления 150 мкл буфера (PBS + 0.1% сапонин). Центрифуга для пластин для 5 мин на 1000 x g на RT и удалить супернатант. Повторите этот шаг два раза.
  15. Анализ клеточных популяций подачей cytometry (рис. 8).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Рисунок 1 иллюстрирует шаги, описанные в настоящем Протоколе. Рисунок 2 иллюстрирует изоляции и культуры клеток мыши BM. ГМ-КСФ и LPS этих культур позволяет поколения в пробирке и созревания DCs. рис. 3 показан cytometry анализ потоков дифференцировки и созревания полученные DCs ГМ-КСФ BM-производные DCs. OVAp-загрузить и отдельных жизненно важных клеток трассировки краситель окрашенных CD4/...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол позволяет для характеристики BM-производные DCs способность модулировать активации, пролиферации и дифференцировки клеток CD4 T наивно. Кроме того она может также использоваться для оценки подверженности модуляции CD4 Т-клеток, БМ производные DCs. Этот протокол изменения в этих мероприятиях может быть измеренной в естественных условиях.

В зависимости от гипотезы под следствием может использоваться несколько комбинаций Т-клеток и DCs. Например один можно проанализировать ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать

Благодарности

Мы благодарим д-р Симон Bartlett для английского редактирования. Это исследование было поддержано грантов из Instituto de Salud Карлоса III (ISCIII) (ПЭ14/00526; PI17/01395; ПЦ11/00145; CPII16/00022), Мигель Сервет программа и Фонд Ramón Аресес; При совместном финансировании региональных Europeo Fondo de Desarrollo (ФЕДЕР). CNIC поддерживается Министерством экономики, промышленности и конкурентоспособности (МЭПТ) и Фондом Pro CNIC и является Северо Очоа центр повышения квалификации (SEV-2015-0505). RTF основан Фонд Рамона Аресес и CNIC, VZG, ISCIII, BHF Институто де инвестигасьон обеспечиваются больница 12 де октубре (imas12) и JMG-G ISCIII Мигель Сервет программы и imas12.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ЭтанолVWR Химикаты20,824,3655 л
НожницыFine Science Tools (F.S.T.)14001-12
Щипцыдля тонких научных инструментов (F.S.T.)11000-13
Тонкие щипцыFine Science Tools (F.S.T.)11253-20
Скальпельдля тонких научных инструментов (F.S.T.)10020-00Коробка из 100 лезвий
Фетальная бычья сывороткаSIGMAF7524
Пенициллин/стрептомицинLONZADE17-602E
Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)GIBCO21875-034
Стерильные чашки ПетриFalcon353003
игла 25 калибраBD Microlance 3300600
Шприц 1 млNovicoN15663
15 мл конические тубыFalcon352096
50 мл конические тубыFalcon352098
70 мм; m нейлоновый фильтрBD Falcon352350
Красный буфер для лизиса кровиSIGMAR7757100 мл
EDTASIGMA ED2SS-250
Бычья сыворотка АльбуминSIGMAA7906100 г
Трипан синийSIGMA302643-25G
Культуральные пластиныFalcon353003
4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота (HEPES)CambrexBE17-737E
Бета-меркаптоэтанолMerck8-05740-0250
Пируват натрияLONZABE13-115E
L-глутаминLONZABE17-605E
Рекомбинантный мышиный гранулоцитарный макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF)Prepotech315-03
липополисахарид (ЛПС)SIGMA-ALDRICHL2018
96-луночная пластинаCostar3799
v450 антитело против мыши CD11bBD Biosciences560455
ПЭ антитело против мыши CD64 BioLegend139303
ПЭ антитело против мыши CD115 BioLegend135505
FITC против мыши Антитело к CD11cBioLegend117305
антитело FITC против мыши Антитело MHCIIBioLegend125507
антитело APC против мыши CD86BioLegend105011
антитело APC против мыши CD80 BioLegend104713
пробирки для проточной цитометрииZelian300800-1PS 12X75 5 мл
OTII ПептидовоальбуминаInvivoGen323-339
антимышиное биотинилированное антитело CD8&alphaTonbo Biosciences30-0081-U500
антимышиное биотинилированное антителоIgMBioLegend 406503
мышиное биотинилированное антитело B220Tonbo Biosciences30-0452-U500
антимышиное биотинилированное антитело CD19Tonbo Biosciences30-0193-U500
антимышиное биотинилированное антитело MHCII (I-Ab)BioLegend115302
мышиное биотинилированное антитело CD11bTonbo Biosciences30-0112-U500
антимышиное биотинилированное антитело CD11cBioLegend117303
мышиное биотинилированное антитело CD44BioLegend103003
антимышиное биотинилированное Антитело CD25Tonbo Biosciences30-0251-U100
антимышиное биотинилированное антитело DX5BioLegend108903
покрытые стрептавидином магнитные микрогранулыMACS Miltenyi Biotec130-048-101
Магнитный сепараторMACS Miltenyi Biotec130-090-976Разделитель QuadroMACS
Разделительные колонкиMACS Miltenyi Biotec130-042-401
PE антимышиное антитело CD4BioLegend100408
APC антимышиное CD3-антителоBioLegend100235
FITC антимышиное антитело CD8Tonbo Biosciences35-0081-U025
Клеточный фиолетовый индикаторThermofisherC34557
APC антимышиное антитело CD25Tonbo Biosciences20-0251-U100
Alexa647 антитело против мыши CD69 BioLegend104518
PerCPCY5.5 антитело против мыши CD45.1антитело Tonbo Biosciences65-0453
APC против мыши CD45.1 антителоTonbo Biosciences20-0453
PECY7 антитело против мыши CD45.1 антителоTonbo Biosciences60-0453
FITC против мыши CD45.2 антителоTonbo Biosciences35-0454
ИономицинSIGMA-ALDRICHI0634
Форбол 12 Миристат 13 Ацетат (PMA)SIGMAP8139
Брефельдин А (BD GolgiPlug)BD555029
ПараформальдегидМиллипор8-18715-02100
Буфер внутриклеточной пермеабилизацииeBioscience00-8333
APC антитело к мышиному IFNgTonbo Biosciences20-7311-U100
Fc-блок (антимышиный CD16/CD32)Tonbo Biosciences70-0161-U100
B6. мыши SJL CD45.1Лаборатория Джексона002014
BD LSRFortessa™ Клеточный анализаторBD Biosciences649225
DAPI SolutionThermofisher62248

Ссылки

  1. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations (*). Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2010).
  2. Bustos-Moran, E., Blas-Rus, N., Martin-Cofreces, N. B., Sanchez-Madrid, F. Orchestrating Lymphocyte Polarity in Cognate Immune Cell-Cell Interactions. International Review of Cell and Molecular Biology. 327, 195-261 (2016).
  3. Gonzalez-Granado, J. M., et al. Nuclear envelope lamin-A couples actin dynamics with immunological synapse architecture and T cell activation. Science Signaling. 7 (322), ra37(2014).
  4. Rocha-Perugini, V., Gonzalez-Granado, J. M. Nuclear envelope lamin-A as a coordinator of T cell activation. Nucleus. 5 (5), 396-401 (2014).
  5. Rocha-Perugini, V., et al. CD9 Regulates Major Histocompatibility Complex Class II Trafficking in Monocyte-Derived Dendritic Cells. Molecular and Cellular Biology. 37 (15), (2017).
  6. Kaech, S. M., Wherry, E. J., Ahmed, R. Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development. Nature Reviews Immunology. 2 (4), 251-262 (2002).
  7. Iborra, S., Gonzalez-Granado, J. M. In Vitro Differentiation of Naive CD4(+) T Cells: A Tool for Understanding the Development of Atherosclerosis. Methods in Molecular Biology. 1339, 177-189 (2015).
  8. Toribio-Fernandez, R., et al. Lamin A/C augments Th1 differentiation and response against vaccinia virus and Leishmania major. Cell Death & Disease. 9 (1), 9(2018).
  9. Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice. Journal of Visualized Experiments. (113), (2016).
  10. Cruz-Adalia, A., et al. Conventional CD4(+) T cells present bacterial antigens to induce cytotoxic and memory CD8(+) T cell responses. Nature Communications. 8 (1), 1591(2017).
  11. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of Visualized Experiments. (88), e51627(2014).
  12. Cruz-Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., Torres-Torresano, M., Garcia-Ferreras, R., Veiga Chacon, E. T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells. Journal of Visualized Experiments. (107), e52976(2016).
  13. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584-1797 (2017).
  14. Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. Journal of Immunological Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
  15. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animals (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
  16. Warth, S. C., Heissmeyer, V. Adenoviral transduction of naive CD4 T cells to study Treg differentiation. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
  17. Liou, H. L., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Активация наивных CD4 Т-клетокадоптивный перенос клетоканализ методом проточной цитометриивыделение клеток костного мозгазабор лимфатических узловпролиферация Т-клетоквнутриклеточное окрашивание цитокиновтрансгенные мыши OTII
В естественных условиях модель мыши для активации Т-клеток CD4 наивно мера, пролиферации и дифференцирования Th1, индуцированных дендритные клетки костного мозга, полученных
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.