Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Формирование люминофора в различные конформации альбумина Bovine сыворотки путем связывания Gold(III)

6.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58141

⸱

31 августа 2018 г.

 , 
1Department of Physics and Optical Science, Center for Biomedical Engineering & Science, University of North Carolina

В этой статье

Краткое содержание

Протоколы для изучения привязки золота катионов (Au(III)) к бычьим сывороточным альбумином (БСА), а также характеризующие конформационные зависимых уникальный BSA-Au флуоресценции представлены различные конформации.

Аннотация

Цель представленных протоколов является изучение процесса привязки Au(III) BSA, уступая конформации изменения индуцированной красной флуоресценцией (λет = 640 Нм) BSA-Au(III) комплексов. Этот метод корректирует рН, чтобы показать, что появление красной флуоресценцией коррелирует с рН индуцированной равновесия переходы BSA конформации. Красной флуоресцентной BSA-Au(III) комплексы могут быть сформированы только с корректировка pH на уровне или выше 9.7, который соответствует «A-form» конформацию BSA. Протокол для регулировки BSA Au молярное соотношение и контролировать ход времени процесс привязки Au(III) описано. Минимальное количество Au(III) за BSA, производить красной флуоресценцией, это меньше чем 7. Мы описываем протокола в шаги, чтобы продемонстрировать наличие нескольких сайтов связывания Au(III) в BSA. Во-первых, путем добавления медь (Cu(II)) или никель (Ni(II)) катионов следуют Au(III), этот метод открывает привязки сайта для Au(III), что это не красный Флюорофор. Во-вторых изменяя BSA, тиоловых укупорки агентов, раскрывается другой сайт nonfluorophore формирование Au(III) привязки. В-третьих изменение конформации BSA раскалывание и укупорки дисульфидными облигаций, проиллюстрированы возможные Au(III) привязки сайта. Протокол, описанный для управления BSA конформации и Au(III) привязки, обычно может применяться для изучения взаимодействия других белков и катионов металлов.

Введение

BSA-Au соединения выставке ультрафиолетового (УФ)-возбудимых красной флуоресценцией, с замечательным Стокса сдвига, первоначально синтезирован СЕ и др. 1. уникальный и стабильной красной флуоресценции можно найти различные приложения в таких областях, как зондирования2,3,4,5,6,7изображений или наномедицины8 ,9,10,11,12,13. Это вещество широко изучена многими исследователями в области нано науки в последние годы14,,1516. BSA-Au соединение было истолковано как Au25 нанокластерами. Цель представленных метода — это соединение в деталях изучить и понять происхождение красной флуоресценцией. Следуя представленного подхода, наличие нескольких сайтов связывания Au и происхождение флуоресценции, альтернативой сингл сайт нуклеации АС25 нанокластерами, можно проиллюстрировать. Этот же подход могут быть использованы для изучения, как другие белки17,18,19 complexed с Au(III) можно изменить их неотъемлемой флуоресцентные свойства.

Синтез соединения BSA-Au красно люминесцентные требует узкой контроля Молярная соотношения BSA АС (BSA:Au) для максимальной интенсивности флуоресценции и местоположение пики возбуждения выбросов карта (EEM)20. Может быть показано, что для Au(III) для привязки, существуют несколько сайтов связывания включая аспарагин фрагмента (или фрагмент Asp, первые четыре аминокислотных остатков на N-го BSA)21,22. 34й аминокислоты BSA (КМС-34) показано также для координации Au(III) и участвовать в механизме красный fluorescence([Cys34-capped-BSA]-Au(III))20. Рассекая все Cys Cys дисульфидными облигаций и покрывая все тиолов, красной флуоресценцией является не производится ([all-thiol-capped-BSA]-Au(III)). Это говорит о необходимости Cys Cys дисульфидными облигаций как Au(III) привязки сайта для получения красной флуоресценцией.

Методы химии белка не было широко используется для изучения BSA-Au(III) комплексов в нано научного сообщества. Однако было бы полезно использовать эти методы, чтобы понять некоторые аспекты этих комплексов, а также получить подробное понимание сайтов связывания Au(III) в BSA. Эта статья призвана показать некоторые из этих методов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. синтез BSA-Au(III) комплекса

  1. 25 мг в 1 мл воды класс высокой производительности жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в 5 мл флаконе реакции БСА Растворите.
    Примечание: Решение должно появиться ясно.
  2. Растворите тригидрат хлорида золота (III) (Тетрахлороауратовая кислота) к концентрации 5 мм в воде класса ВЭЖХ.
    Примечание: Решение должно появиться желтый. Тетрахлороауратовая кислоты раствор, приготовленный на этом концентрация приведет к BSA Au соотношение 1:13.
    1. Кроме того, приготовляют раствор Тетрахлороауратовая кислоты с концентрацией везде между 0,38 мм (BSA:Au = 1:1) до 20 мм (BSA:Au = 1:50) в ВЭЖХ класс воды.
      Примечание: Различные соотношения BSA золото приведет к моделей разительно отличаются красной флуоресценцией возбуждения выбросов карты.
  3. Реакция флакон BSA в ванну воды 37 ° C и энергично размешивают в 750 об/мин, с использованием магнитной мешалкой.
  4. Сразу же после перемешивания начинается, добавьте 1 mL Тетрахлороауратовая кислоты в решение. Цвет раствора следует преобразовать от прозрачного до желтого.
  5. Перемешайте смесь для 2 минут при 37 ° C и при 750 об/мин, с использованием магнитной мешалкой.
  6. В пробирку реакции добавьте 100 мкл 1 M NaOH в решение довести рН до 12.
    Примечание: Сразу после добавления NaOH, решение должно слегка темнее до желто коричневого и затем повернуть на желтый.
  7. Продолжать движение на 750 об/мин 2 h и 37 ° C. Решение следует медленно, переход от желтого в темный цвет Желтый/коричневый. Это изменение цвета указывает на формирование красной флюоресцирующей BSA-Au(III) комплекса.
  8. Разрешить образец сидеть при комнатной температуре в течение 2 дней и решение будет по-прежнему темнее янтарных Браун и увеличит интенсивность флуоресценции.
    1. Кроме того пусть образец продолжать движение при 37 ° C для 12 более h мере к Желтый коричневый цвет раствора.

2. синтез BSA-Cu(II)-Au(III)

  1. Растворите 25 мг в 1 мл воды класса ВЭЖХ БСА. Решение должно появиться ясно.
  2. Растворяют медь (II) хлористый в ВЭЖХ класс воде в концентрации 5 мм. Решение должно появиться свет синий.
  3. Добавить 1 мл водного раствора БСА в 5 мл флаконе реакции и место в водяной бане при температуре 37 ° C. Перемешайте смесь на 750 об/мин.
  4. Сразу же добавить 0,5 мл раствора меди (II) хлорид дигидрат реакции флакона и перемешать на 2 мин. Решение будет оставаться свет синий.
  5. Добавление 75 мкл 1 M NaOH довести рН до 12 и позвольте смешиваться в течение 2 ч. Решение станет фиолетовый.
  6. Растворяют Тетрахлороауратовая кислоты в воде класса ВЭЖХ в концентрации 5 мм.
  7. Добавить 0,5 мл водного раствора Тетрахлороауратовая кислоты в реакции флакона и скорректировать рН обратно до 12 с использованием 1 M NaOH.
  8. Перемешайте смесь реакции 2 h.
    Примечание: Решение должно развиваться до коричневого цвета.

3. синтез BSA-Ni(II)-Au(III)

  1. Растворите 25 мг в 1 мл воды класса ВЭЖХ БСА. Решение должно появиться ясно.
  2. Растворите гексагидрат хлорида никеля (II) в ВЭЖХ класс воде в концентрации 5 мм. Решение должно появиться свет зеленый.
  3. Добавить 1 мл водного раствора БСА в 5 мл флаконе реакции и место в водяной бане на 37 oC. перемешать смесь на 750 об/мин.
  4. Сразу же добавьте 0,5 мл раствора гексагидрат хлорида никеля (II) в реакции флакона и смеси на 2 мин.
    Примечание: Решение будет оставаться свет зеленый.
  5. Добавление 75 мкл 1 M NaOH довести рН до 12 и позвольте смешиваться в течение 2 ч.
    Примечание: Решение станет темно-желтого.
  6. Растворяют Тетрахлороауратовая кислоты в воде класса ВЭЖХ в концентрации 5 мм.
  7. Добавить 0,5 мл водного раствора Тетрахлороауратовая кислоты в реакции флакона и скорректировать рН обратно до 12.
  8. Перемешайте смесь реакции 2 h.
    Примечание: Решение должно развиваться до коричневого цвета.

4. синтез [Cys34-capped-BSA]-Au(III)

  1. 2 мг N-ethylmaleimide (NEM) растворяют в 1 мл-фосфатный буфер (PBS, рН 7,4).
  2. Растворите 2 мг в 1 мл раствора PBS-NEM БСА.
  3. Решение передать 5 мл флаконе реакции и перемешать при 20 ° C на 500 об/мин на 1 ч.
  4. Dialyze решение, используя 12 кДа диализа трубы в 500 мл PBS, помешивая магнитной мешалкой на ночь, чтобы удалить непрореагировавшего NEM на 50 об/мин.
  5. Растворяют Тетрахлороауратовая кислоты в PBS к концентрации 0,4 мм.
    Примечание: Решение будет слабый желтый.
  6. Передача флакона реакции на водяной бане при температуре 37 ° C. Движение на 750 об/мин.
  7. Сразу же добавить 1 мл Тетрахлороауратовая раствора кислоты в реакции флакона и позвольте смешиваться в течение 2 мин.
  8. Добавьте 75 мкл 1 M NaOH в флаконе реакции рН 12 и позволяют смешать 2 h.

5. синтез [all-thiol-capped-BSA]-Au(III)

  1. Подготовьте раствор 2 M мочевины и 50 мм бикарбонат аммония (NH4HCO3, pH 8.0) в воде класса ВЭЖХ.
  2. Растворяется 3,3 мг в 1 мл выше решения и передачи 5 мл флаконе реакции БСА.
  3. Сделать Стоковый раствор 0,25 М tris(2-carboxyethyl) фосфин (TCEP), растворяя 62,5 мг TCEP в 1 мл воды ВЭЖХ.
  4. Добавьте Стоковый раствор TCEP реакции флакона до конечной концентрации TCEP 8 мм.
  5. Инкубировать решение на водяной бане в течение 1 ч при 50 ° C. Тщательно размешайте в 500 об/мин, с использованием магнитной мешалкой.
  6. Разрешить решение полностью остыть до комнатной температуры.
  7. Подготовьте раствор 100 мм NEM, растворяя 12,5 мг в 1 мл воды ВЭЖХ класс по СНУК.
  8. Добавьте Стоковый раствор NEM реакции флакона до конечной концентрации NEM 16 мм.
  9. Разрешить решение объединить втечение 2 ч при температуре 20 ° C. Тщательно размешайте в 500 об/мин.
  10. Dialyze решения с помощью диализа трубки 12 кДа, помешивая магнитной мешалкой ночь в 500 мл 50 мм NH4HCO3 для удаления избыточных TCEP, NEM и мочевина решение на 50 об/мин.
  11. Переместить флакона реакции на водяной бане при 37 ° C и перемешайте в 750 об/мин.
  12. Растворяют Тетрахлороауратовая кислоты в воде ВЭЖХ класс к концентрации 0,66 мм.
  13. Сразу же добавить 1 мл Тетрахлороауратовая раствора кислоты в реакции флакона и позвольте смешиваться в течение 2 мин.
  14. Добавить 1 M NaOH до тех пор, пока pH раствора составляет 12 и позволяют решение продолжать смешивать в течение 2 ч.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

От флуоресценции в BSA-Au(III) комплексе, было отмечено, что преобразование внутренней голубой флуоресценцией BSA (λет = 400 Нм) для красной флуоресценцией (λет = 640 Нм) происходит в о рН 9.7 через уравновешение Переход (рис. 1). ВЕМ BSA-Au(III) на различных BSA чтобы молярное соотношение АС показан на рисунке 2, и эти данные показывают, как изменить молярное соотношение дает же длина волн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

BSA-Au(III) соединений, подготовленных при рН 12 экспонат красной флуоресценции в выбросах волны λет= 640 Нм при возбуждении с ультрафиолетового (УФ) света λex= 365 Нм (рис. 1A). Появление красной флуоресценцией представляет собой медленный процесс и займет несколько дней при комнатной температуре для увеличения максимальной интенсивности. Запуск реакции при 37 ° C принесет оптимальные результаты, хотя выше температура может использоваться для создания красной ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

С.е. отмечает поддержку от герцога фонд специальной инициативы, Wells Fargo фонд, Фонд PhRMA, а также запуска средства из университета Северной Каролины, Шарлотта.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Бычий сывороточный альбумин (БСА), 96%Сигма-ОлдричА5611
тригидрат золота (III) хлорида, 99,9%Сигма-Олдрич520918
дигидрат меди (II), 99,999%Сигма-Олдрич459097
гексагидрат никеля (II), 99,9%Сигма-Олдрич654507
N-этилмалеимид (НЭМ), >99,0%Sigma-Aldrich4259
Трис(2-карбоксиэтил)фосфин гидрохлорид (TCEP), >98,0%Sigma-AldrichC4706
Гидроксид натрия, >98,0%Sigma-AldrichS8045
мочевина, 99,5%Chem-Implex Int'l30142
Фоспат буферизованный физиологический раствор (PBS)CorningMT21040CV
бикарбонат аммония, 99.5%Сигма-Олдрич9830

Ссылки

  1. Xie, J., Zheng, Y., Ying, J. Y. Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent Gold Nanoparticles. Journal of the American Chemical Society. 131, 888-889 (2009).
  2. Saha, K., Agasti, S. S., Kim, C., Li, X., Rotello, V. M. Gold Nanoparticles in Chemical and Biological Sensing. Chemical Reviews. 112, 2739-2779 (2012).
  3. Zhang, Y., et al. New Gold Nanostructures for Sensor Applications: A Review. Materials. 7, 5169-5201 (2014).
  4. Chen, L. -Y., Wang, C. -W., Yuan, Z., Chang, H. -T. Fluorescent Gold Nanoclusters: Recent Advances in Sensing and Imaging. Analytical Chemistry. 87 (1), 216-229 (2015).
  5. Cai, W., Gao, T., Hong, H., Sun, J. Applications of Gold Nanoparticles in Cancer Nanotechnology. Nanotechnology, Science and Applications. 1, 17-32 (2008).
  6. Nune, S. K., et al. Nanoparticles for Biomedical Imaging. Expert Opinion on Drug Delivery. 6, 1175-1194 (2009).
  7. Dorsey, J. F., et al. Gold Nanoparticles in Radiation Research: Potential Applications for Imaging and Radiosensitization. Translational Cancer Research. 2, 280-291 (2013).
  8. Daniel, M. -C., Astruc, D. Gold Nanoparticles: Assembly, Supramolecular Chemistry, Quantum-Size-Related Properties, and Applications toward Biology, Catalysis, and Nanotechnology. Chemical Reviews. 104 (1), 293-346 (2004).
  9. Ferrari, M. Cancer Nanotechnology: Opportunities and Challenges. Nature Reviews Cancer. 5, 161-171 (2005).
  10. Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. Gold Nanoparticles: Interesting Optical Properties and Recent Applications in Cancer Diagnostics and Therapy. Nanomedicine. 2, 681(2007).
  11. Arvizo, R., Bhattacharya, R., Mukherjee, P. Gold Nanoparticles: Opportunities and Challenges in Nanomedicine. Expert Opinion on Drug Delivery. 7, 753-763 (2010).
  12. Doane, T. L., Burda, C. The Unique Role of Nanoparticles in Nanomedicine: Imaging, Drug Delivery and Therapy. Chemical Society Reviews. 41, 2885(2012).
  13. Egusa, S., Ebrahem, Q., Mahfouz, R. Z., Saunthararajah, Y. Ligand Exchange on Gold Nanoparticles for Drug Delivery and Enhanced Therapeutic Index Evaluated in Acute Myeloid Leukemia Models. Experimental Biology and Medicine. 239, 853(2014).
  14. Qu, X., et al. Fluorescent Gold Nanoclusters: Synthesis and Recent Biological Application. Journal of Nanomaterials. (784097), (2015).
  15. Chakraborty, I., Pradeep, T. Atomically Precise Clusters of Noble Metals: Emerging Link between Atoms and Nanoparticles. Chemical Reviews. 117, 8208-8271 (2017).
  16. Raut, S., et al. Evidence of energy transfer from tryptophan to BSA/HSA protected gold nanoclusters. Methods and Applications in Fluorescence. 2, (2014).
  17. Le Guével, X., Daum, N., Schneider, M. Synthesis and Characterization of Human Transferrin-Stabilized Gold Nanoclusters. Nanotechnology. 22 (27), (2011).
  18. Kawasaki, H., Yoshimura, K., Hamaguchi, K., Arakawa, R. Trypsin-Stabilized Fluorescent Gold Nanocluster for Sensitive and Selective Hg2+ Detection. Analytical Sciences. 27 (6), 591(2011).
  19. Lu, D., et al. Lysozyme-Stabilized Gold Nanoclusters as a Novel Fluorescence Probe for Cyanide Recognition. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 121, 77-80 (2014).
  20. Dixon, J. M., Egusa, S. Conformational Change-Induced Fluorescence of Bovine Serum Albumin-Gold Complexes. Journal of the American Chemical Society. 140, 2265-2271 (2018).
  21. Peters, T. Jr All About Albumin. , (1996).
  22. Masuoka, J., Saltman, P. Zinc(II) and Copper(II) Binding to Serum Albumin. A Comparative Study of Dog, Bovine, and Human Albumin. Journal of Biological Chemistry. 269, 25557-25561 (1994).
  23. Takeda, K., Wada, A., Yamamoto, K., Moriyama, Y., Aoki, K. Conformational Change of Bovine Serum Albumin by Heat Treatment. Journal of Protein Chemistry. 8 (5), 653-659 (1989).
  24. Klotz, I. M., Curme, H. G. The Thermodynamics of Metallo-protein Combinations. Copper with Bovine Serum Albumin. Journal of the American Chemical Society. 70, 939-943 (1948).
  25. Fiess, H. A., Klotz, I. M. The Thermodynamics of Metallo-Protein Combinations. Comparison of Copper Complexes with Natural Proteins. J. Am. Chem. Soc. 74, 887-891 (1952).
  26. Rao, M. S. N. A Study of the Interaction of Nickel(II) with Bovine Serum Albumin. Journal of the American Chemical Society. 84, 1788-1790 (1962).
  27. Peters, T. Jr, Blumenstock, F. A. Copper-Binding Properties of Bovine Serum Albumin and Its Amino-terminal Peptide Fragment. Journal of Biological Chemistry. 242, 1574-1578 (1967).
  28. Xue, Y., Li, X., Li, H., Zhang, W. Quantifying Thiol-Gold Interactions towards the Efficient Strength Control. Nature Communications. 5, 4348(2014).
  29. Xu, Y., et al. The Role of Protein Characteristics in the Formation and Fluorescence of Au Nanoclusters. Nanoscale. 6 (3), 1515-1524 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Связывание золота(III)формирование флуоресценциирегулирование pHконформационные изменениясайты связывания металловмодификация тиоламирасщепление дисульфидных связейобработка мочевинойвосстановление TCEP
Формирование люминофора в различные конформации альбумина Bovine сыворотки путем связывания Gold(III)
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.