Методическая статья

Бесклеточной и клеточных легких модель для изучения метастазов опухоли

7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58145

⸱

19 августа 2018 г.

 , 
1Department of Surgery, Houston Methodist Hospital Research Institute, 2Division of Thoracic Surgery, Department of Surgery, Weill Cornell Medical College, Houston Methodist Hospital

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем собой протокол для ex vivo легких Рак модель, которая имитирует шаги прогрессии опухоли и помогает изолировать первичной опухоли, циркулирующих клеток опухоли и метастатического поражения.

Аннотация

Это сложно изолировать опухолевых клеток в различных точках прогрессии опухоли. Мы создали ex vivo легких модель, которая может показать взаимодействие опухолевых клеток с естественным матрицы и постоянный поток питательных веществ, а также модель, которая показывает взаимодействие опухолевых клеток с нормальной клеточных компонентов и природные матрицы. Бесклеточной ex vivo легких модель создается путем изоляции блока легочное сердце крысы и удаления всех клеток, с помощью процесса decellularization. Правого главного бронха связана с и опухолевые клетки помещаются в трахею шприца. Клетки двигаться и заполнения левого легкого. Легких затем помещается в биореакторе, где легочной артерии получает постоянный поток средств массовой информации в замкнутом контуре. Опухоль, выращенных на левого легкого является первичной опухоли. Опухолевые клетки, которые изолированы в оборотных средствах циркулируют опухолевые клетки и клетки тумора в правом легком, метастатического поражения. Легких сотовой ex vivo модель создается путем пропуска decellularization процесса. Каждая модель может использоваться для ответа на вопросы различных исследований.

Введение

Метастазами рака является виновником за большинство случаев смерти, связанных с раком и создает конечной задачей в усилиях по борьбе с раком. Общая цель этого метода заключается в разработке протокола для четырехмерное (4-D) ячейку культуры, которая имеет измерение потока, помимо роста трехмерной (3-D) клеток. Он представляет собой три этапа процесса метастазы [т.е., первичной опухоли, циркулирующих клеток опухоли (CTCs) и метастатические поражения].

За последние три десятилетия ученые всего мира дали беспрецедентную богатство информации, чтобы понять механизмы, лежащие в основе метастатическим прогрессии в другой раках, которые улучшили перспективы лечения или выживаемости без прогрессирования. Клиническое ведение некоторых видов рака, таких как рак молочной железы, значительно улучшились1; Однако некоторые виды рака, таких как рак легких, еще бедными выживания2. In vitro и in vivo Животные модели играют важную роль в создании новых понимание механизмов, лежащих в основе развития болезни. В последние несколько лет мобильный линии производные ксенотрасплантатов (CDX) и пациент производные ксенотрасплантатов (PDX) были больше интереса, как они сохраняют многие соответствующие особенности первичной опухоли человека3, например Кинетика роста, гистологические особенности, поведенческих характеристики и ответ на терапию. Однако каждая модель имеет свои ограничения, чтобы понять механизм формирования КТК и метастазов в далекой орган4,5,6.

Недавно мы разработали модель 4-D ex vivo рака легких, используя понятие органа реинжиниринга и на основе перфузии клеточной культуры. Она имитирует рост рака легких человека путем формирования конкреций perfusable опухоли, которые растут с течением времени с аналогичных человека рак выделяется белка производство7. Он представляет собой подпись выражение гена, которая предсказывает плохой выживаемости у пациентов с раком, а также показывает терапевтические реакции к регрессии опухоли после лечения цисплатином8,9. Далее модель легких была изменена таким образом, чтобы он может образовать метастатического поражения. ЦОК развиваются от первичной опухоли и intravasate в сосудистую и extravasate в контралатерального легкого сформировать метастатического поражения10. Ген выражение исследования показывают собственный выражение профиль первичной опухоли, ЦОК и метастатических поражений и upregulation подмножество генов, необходимых для фенотип10. Этот метастатического процесса происходит из-за присутствия биологических условий, видел у пациентов с раком. Преимуществом этой модели является наличие естественных матрицы и архитектуры и перфузии питательных веществ, что приводит к образованию опухоли конкреций. Кроме того он также предоставляет возможность для изучения воздействия различных компонентов микроокружения опухоли или наркотиков на опухолевой прогрессии с течением времени. Эта модель может использоваться для расти диапазон клеток рака (рак легких, рак молочной железы, саркомы и т.д.) в лаборатории set-up.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Протоколы для экспериментов на животных были утверждены институциональный уход животных и использования Комитетом на Хьюстон методист научно-исследовательский институт и осуществляется в соответствии с все правила, применимые законы, руководящие принципы и политику.

1. крыса легких урожай

  1. Анестезировать 4 - для 6-недельных крыса мужского Sprague-Dawley, внутрибрюшной инъекции (IP) кетамина (100 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг) в своем фланге. Обеспечить анестезии путем проверки отсутствия движения сжимано ног задних конечностей с щипцами.
  2. После 10 минут брить груди и живота и протрите кожу тампоном, хлоргексидина.
  3. Удалите кожу, поднять его с щипцами и промо с одноразовые скальпелем. После открытия грудной полости, промо с скальпель, выполните двусторонние торакотомии, резки ножницами в передней части грудной клетки слева и правой стороне диафрагмы.
    Примечание: Это не выживание хирургии.
  4. Задержать грудной клетки и залить 2 мл гепарина (1000 единиц/мл) в правый желудочек биение сердца с помощью иглы 27 G.
    Примечание: Это позволит предотвратить любое образование сгустков крови в легких.
  5. Полностью удалить грудная клетка с ножницы и иглы 18 G в левого желудочка как вентиляционные, до тех пор, пока кровь выходит. Затем inject 15 мл гепаринизированным фосфат амортизированное saline (12,5 единиц/мл; гепаринизированным PBS) в правый желудочек, с помощью иглы 25 G.
  6. Вырезать уступает и превосходной верхней полой вены, два крупных вен на правой стороне сердца и очистить легкие с дополнительной 10 мл гепаринизированным PBS в правый желудочек, с помощью иглы 27 G.
    Примечание: Нижней полой вены визуализируется под нижней части сердца как большой сосуд заполнен с красной крови. Аналогично верхней полой вены визуализируется в верхней части сердца как большой сосуд.
  7. Вырежьте трахеи на базе щитовидной железы. Осторожно удалите нисходящей аорты на уровне hemiazygos вен и филиалов аорты на арку.
  8. Выньте блок легочное сердце из грудной полости и остальные части тела крыс.
  9. Выполнить ventriculotomy путем разрезания половина из правого и левого желудочков и поместите на заказ преднаполненных канюлю иглы из нержавеющей стали 18 G через правый желудочек в легочной артерией (PA).
  10. Закрепите катетер с 2-0 шелковый галстук и тщательно правый желудочек и атриум.
  11. Место женщины Luer переборка в левый желудочек и закрепите его с 2-0 шелковый галстук.
  12. Промыть легочное сердце блок с 20 мл гепаринизированным PBS через канюлю ПА и поместите его в Тюбик 50 мл, содержащие культуры средств массовой информации или гепаринизированным PBS.
    Примечание: Для сотовой модели, перейдите к шагу 3.1 для того чтобы настроить биореактор. Для бесклеточной модели перейдите к шагу 2.1 для decellularization.

2. легких Decellularization

  1. Подготовка decellularization аппарата
    1. Подготовка каждого decellularization камеры/бутылка пирсинг два отверстия в колпачке и щелкающий женского Luer в отверстия (рис. 1A и 1B). Закрепите его с кольцом черного нейлона на другой стороне. Аналогичным образом просверлите дырку в другой бутылке колпачок для внутривенного установить насадку (рис. 1 c).
      Примечание: На рисунке 1A и 1B имеют же бутылочных крышек с двух разных сторон. Рисунок 1 c — различные шапочки с одной дыркой, как указано выше в шаге 2.1.1.
    2. Прикрепить 0,5 дюймовый трубки (в легочной артерии или в конце ПА) и 6-дюймовый трубки (рис. 1J) для женского Luer от внутри крышки бутылки (рис. 1A и 1B) и прикрепить мужской люэровского на концах. Установите замок с 500 мл бутылки как палата/бутылка decellularization.
    3. Подключите один конец две трубы 2 ft (которые связаны с замком Luer мужчины) либо концы трубки насоса (рис. 1 H), который прилагается к головку насоса (Рисунок 1E и 1F) картриджа (рис. 1 g) с женской Luer блокировки (Рисунок 1I).
    4. Подключите другой конец 2 ft трубок (от шага 2.1.3) каждого женского голову замком Luer на крышку камеры/бутылка decellularization (Рисунок 1 Л).
    5. Гепаринизированным Установка 250 мл бутылка PBS (с 200 мл PBS) путем повешения Перевернутый бутылку на стенде с проксимальный конец набора внутривенного (рис. 1 d) вставлен в колпачке и дистального конца, замена трубки 2 футов, подключенных к decellularization c Hamber/бутылка в конце ПА (рис. 1B). Подключите эту трубку 2 футов к бутылке, отменить.
      Примечание: Бутылки устанавливаются в картон, как показано на рисунке 1 K. Внутривенно трубок приходят из бутылок висит отказаться реагентов в легких эшафот.
  2. Легких decellularization процесс
    1. Запустить гепаринизированным PBS на физиологическое перфузии давлении 30 мм Hg (рис. 1 K), до тех пор, пока она течет свободно в decellularization камере/бутылка и затем присоедините блок легочное сердце до конца через канюлю ПА ПА.
    2. Держите работает насос непрерывно, так что любой избыток буфера/решение внутри камеры/бутылка decellularization получает отбрасывается.
    3. Запустите гепаринизированным PBS через ПА 15 мин при давлении перфузии 30 мм Hg для первоначального мыть (рис. 1 K).
    4. Замените гепаринизированным PBS бутылке 0.1% лаурилсульфат натрия (SDS) в деионизированной воде и perfuse легких на 2 ч для decellularization.
    5. После decellularization perfuse деионизированной воды газобетона через легких леса за 15 мин.
    6. Затем perfuse 1% неионные моющего средства в деионизированной воде 10 мин.
    7. Замените decellularization камеры/бутылка 500 мл газобетона PBS с 1 x антибиотики (пенициллин стрептомицином амфотерицин), сохраняя нетронутыми с цоколем висит легких внутри бутылки.
    8. Выбросите внутривенно набор, положить трубку 2 ft, прилагается к контейнеру отбрасывая обратно к концу легочной артерии палаты decellularization и запустите насос 6 мл/мин (рис. 1 Л).
    9. Perfuse легких для 72 h и сохранить изменения PBS с помощью антибиотиков каждые 12 ч.
      Примечание: Бесклеточной легких готова к немедленному использованию. Он может храниться в-80 градусов до тех пор, пока требуется. Если розовых пятен или сгустки крови могут быть визуализированы четко в долях легких, отказаться от легких. Это позволяет произвольно тест на ДНК или гистопатология. Полный бесклеточной легких не покажет, что клетки и 99,9% ДНК будут смыты.
      Примечание: При работе с моделью сотовой легких, пропустите decellularization. Собранный легких (шаг 1) можно непосредственно задать в биореактор.

3. биореактор Set-up

  1. Подготовьте биореактор бутылку и предметы, необходимые для установки.
    1. Три отверстия в одного шапка бутылка 500 мл на равном расстоянии и исправить женского Luer во всех трех отверстий, с использованием черного нейлона кольца (рис. 2A и 2B).
      Примечание: Два отверстия, люэровского заканчивается лицо снаружи, в то время как один конец сталкивается внутри бутылки.
    2. Вырежьте 6 в трубе насоса, 2 в трубе, 6 в трубки, 1.5 ft трубы, трубки 2 футов и 10 футов Оксигенатор трубки в биореактор.
    3. Вырезать иглы из нержавеющей стали 18 G и, опять же, соединить концы с биосовместимых труб для трахеи канюли.
    4. Оберните Оксигенатор трубки, с Luer lock разъемами на концах, на электромагнитный проволочную сетку с помощью автоклава ленты (рис. 2 c).
    5. Автоклав вышеупомянутые элементы и держать их в УФ света за 10 мин.
  2. Настройка насоса внутри инкубатор культуры регулярного клеток (37 ° C, 5% CO2) с правильное расстояние между лотков легко помещается бутылка 500 мл.
  3. Спрей на 70% спирте по техобслуживанию насоса и подключить насос трубку с женщин Luer lock разъемы на обоих концах для насоса.
  4. Настройка Оксигенатор, обернутые вокруг соленоида сетки внутри инкубатор культуры клеток, подключив один конец (отток) Оксигенатор труба насоса и другой конец с 1.5 ft трубки в биореактор.
  5. Настройка биореактор бутылку в биобезопасности кабинета с асептических условиях.
    1. Прикрепить трехходовой кран (желтый) руководителю одной из женских Люрс для управления потоком через ПА.
    2. Подключите односторонней краном (синий) к другой женский Luer блокировки переборки для клеток, заполнение через трахею (Рисунок 2F).
    3. Подключить 2 трубы на внешней стороне (белый) и 6 труб внутри бутылки распространить СМИ вне. Подходят мужчины люэровского к трубе 2 ft и прикрепить женский стиль выступ Luer тройник для обеспечения доступности, чтобы добавить или удалить что-нибудь.
    4. Прикрепите односторонней краном в одно из отверстий 3 контактный разъем (женский Luer выступ стиля Tee).
    5. Придаем люэровского мужского и женского люэровского трубы 2 футов.
    6. Добавить 200 мл RPMI1640 с 10% FBS и 1% антибиотиков клетки культуры среднего (меняется согласно требованию клеток) и передачи биореактор инкубатора. Подключите Оксигенатор трубку с двумя открытыми концами (односторонней краном и Tee разъем) сделать это замкнутая биореактора.
  6. Предварительно запустите насос 6 мл/мин внутри инкубатор культуры клеток с СМИ культуры клеток для заполнения Оксигенатор и трубы, так, что нет пузырьков воздуха существуют в трубке.
  7. Как только трубы заполнены с СМИ, Закройте запорный и удалить биореактор бутылка из инкубатора, отключив оксигенаторы от обоих концов биореактор бутылки.
  8. Положить бутылку биореактор в биобезопасности кабинета, пройти СМИ культуры через кран и придаем ПА канюля эшафот легких (бесклеточной или сотовой) краном через разъем "Луер".
    Примечание: Тут можно использовать бесклеточной модель (после процесса decellularization) или блок свежеубранных легочное сердце (т.е., сотовая модель, как он сохраняет родной крыса клетки).
  9. Перейти СМИ культуры через одностороннюю краном, чтобы удалить воздух и связать трахеи канюля, Шелковые нитки в трахею.
  10. Убедитесь в том избежать любых скручивания ПА и трахеи. Закройте крышку бутылки биореактор с легких эшафот внутри снова, асептически передачи биореактор для инкубатора и запуска насоса со скоростью 6 мл/мин.
  11. Запуск средства массовой информации культуры на 10-15 минут, чтобы убедиться, все лепестки получить завышены и легких выглядит в хорошем состоянии (Рисунок 2 g).

4. метастазы модель и заполнения ячеек

Примечание: Перейти к ячейке посева с выше легкого модель для изучения роста первичной опухоли. Измените эшафот легких (бесклеточной или сотовой) следующим для метастатической модели.

  1. Вынуть биореактор с леской легких от инкубатора и положил его в биобезопасности кабинета.
  2. Использовать Luer lock шприц 5 мл культуры средств массовой информации через трахею и открыть крышку биореактора с висеть легких леса (Рисунок 2F).
  3. На этот шаг еще один человек должен помочь в модификации легких метастатического модели.
  4. Получите шелк 2-0 готов и использовать угловой пинцет, чтобы сделать проход через трахею в точке бифуркации.
  5. Галстук собирается правого легкого в точке бифуркации трахеи и проверить свободный поток средств массовой информации через трахею для левого легкого, передавая культуры средств массовой информации.
    Примечание: После трахеи привязан к точке бифуркации, клетки, семенами через трахею будут автоматически направлены на семян к левой долях. Она может быть проверена перед посевом клетки толкая культуры средств массовой информации через трахею. В метастатических модели средства массовой информации будет двигаться левой долей только, которые будут раздувать, а не правом долей10.
  6. Установите 20 мл Luer блокировки шприц на вершине трахеи канюлю и добавьте клеток рака легкого ATCC (A549, H1299) в 50 мл RPMI1640 полный культуры средств массовой информации (Рисунок 2F).
  7. Выполняют клетки, посева в кабинете биобезопасности. Добавить 15 мл клеток в шприц и дайте ему пройти через долях легких под действием силы тяжести. Добавьте остальные клетки, прежде чем любые воздушные пузырьки проходят через.
  8. В бесклеточной легких посева, собирать перфузии СМИ, капает вниз в бутылке биореактора и дайте ему пройти через трахею снова 3 x.
    Примечание: Перфузии СМИ иногда есть раковые клетки семенами. Таким образом для эффективного заполнения, положил обратно СМИ снова в трахею через шприц.
  9. После того, как семенами, удалите шприц, подождите 15 минут, добавить свежий СМИ и возвращение биореактор в инкубаторе. Удалите все пузырьки воздуха в трубке.
  10. Запустите насос для perfuse СМИ в 6 мл/мин.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Легких, добываемых из крыса сохраняет нетронутыми сосудистую и альвеолы11 (Рисунок 3А и 3Б). После decellularization компоненты внеклеточного матрикса бесклеточной легких, таких как коллаген, фибронектин и эластина, сохранились11 (рис. 3 c, 3D, 3Eи 3F). Decellularization приводит к полного удаления родной крыса клет...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

4-D ex vivo легких предоставляет возможность для изучения роста опухоли и метастазов в лаборатории set-up. Родной легких матрица представляет собой сложную систему, которая обеспечивает поддержку для нормальной ткани и поддерживает ячеек взаимодействия, взаимодействие клеток матрица, клеточной дифференциации и ткани Организации. Это дает возможность добавлять любые компоненты микроокружения опухоли для изучения их влияния на рост опухоли и взаимодействие с другими клетками.

Урожай лег...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

P. мин Ким получил грантовую поддержку от второй Джон W. Kirklin исследований стипендии, Американская ассоциация грудной хирургии, Грэм исследовательский фонд, Хьюстон методистской специальности врач группы Грант и Майкл м. и Джоанн H. конуса исследований премии. Мы благодарим Энн Сайкин за редактирование язык рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Sprague Dowley ratHarlan206MMale
Chlorhexidine swabPrevantics, Нью-Йорк, СШАNDC 10819-1080-1
HeparinSagent Pharmaceuticals, Шаумбург, Иллинойс, СШАNDC 25021-400-10
Игла 18-го калибраMcMaster Carr, США75165A249
2-0 шелковый галстукEthicon, Сан-Анджело, Техас, СШАA305H
Насос Masterflex L/SCole-Parmer, Вернон Хиллз, Иллинойс, СШАEW-07554-80
Насосная головка Masterflex L/SCole-Parmer, Вернон Хиллз, Иллинойс, СШАEW-07519-05
Картридж насоса Masterflex L/SCole-Parmer, Вернон Хиллз, Иллинойс, СШАEW-07519-70
Трубка TygonCole-Parmer, Вернон Хиллз, Иллинойс, США 14171211
Трубка насоса MasterFlexCole-Parmer, Вернон Хиллз, Иллинойс, США06598-16
Внутренние разъемы замка ЛюэраCole-Parmer, Вернон Хиллз, Иллинойс, США45508-3475165A249
Штекерные соединители замка ЛюэраCole-Parmer, Вернон Хиллз, Иллинойс, США45513-04
черное нейлоновое кольцоCole-Parmer, Вернон Хиллз, Иллинойс, СШАEW-45509-04
Набор для внутривенного введенияCareFusion41134E
Додецилсульфат натрия (SDS)Fisher ScientificCAS151-21-3
Triton X-100Sigma-AldrichX100-1L
АнтибиотикиGibco15240-062
Силиконовый оксигенаторCole-Parmer, Вернон Хиллз, Иллинойс, СШАABW00011Сетка Saint-GoBain-Wire
1164610105ЛоусНью-Йорк Проволока
с внутренней резьбой Luer Lug Style TEECole-Parmer, Вернон Хиллз, Иллинойс, США45508-56
Интегральное стопорное кольцо с наружной резьбой для 200-й серии BarbCole-Parmer, Вернон Хиллз, Иллинойс, США45518-08
Женская соединительная муфта с резьбой ЛюэраCole-Parmer, Вернон Хиллз, Иллинойс, США45508-22
Соединитель ClaveICU Medical11956
Hi-Flo и торговля; 4-ходовой запорный кран с поворотной наружной резьбой Luer Locksmith MedicalMX9341L
трубка насоса MasterFlexCole-Parmer, Вернон Хиллз, Иллинойс, США06598-13для канюли
,

Ссылки

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
  2. Torre, L. A., Siegel, R. L., Jemal, A. Lung Cancer Statistics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 893, 1-19 (2016).
  3. Lallo, A., Schenk, M. W., Frese, K. K., Blackhall, F., Dive, C. Circulating tumor cells and CDX models as a tool for preclinical drug development. Translational Lung Cancer Research. 6 (4), 397-408 (2017).
  4. Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. Mouse models for tumor metastasis. Methods in Molecular Biology. 928, 221-228 (2012).
  5. Bissell, M. J., Hines, W. C. Why don't we get more cancer? A proposed role of the microenvironment in restraining cancer progression. Nature Medicine. 17 (3), 320-329 (2011).
  6. Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nature Reviews Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).
  7. Mishra, D. K., et al. Human lung cancer cells grown in an ex vivo 3D lung model produce matrix metalloproteinases not produced in 2D culture. PloS One. 7 (9), e45308(2012).
  8. Vishnoi, M., Mishra, D. K., Thrall, M. J., Kurie, J. M., Kim, M. P. Circulating tumor cells from a 4-dimensional lung cancer model are resistant to cisplatin. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 148 (3), discussion 1063-1064 1056-1063 (2014).
  9. Mishra, D. K., et al. Gene expression profile of A549 cells from tissue of 4D model predicts poor prognosis in lung cancer patients. International Journal of Cancer. Journal International du Cancer. , (2013).
  10. Mishra, D. K., et al. Ex vivo four-dimensional lung cancer model mimics metastasis. The Annals of Thoracic Surgery. 99 (4), 1149-1156 (2015).
  11. Mishra, D. K., et al. Human lung cancer cells grown on acellular rat lung matrix create perfusable tumor nodules. The Annals of Thoracic Surgery. 93 (4), 1075-1081 (2012).
  12. Pence, K. A., Mishra, D. K., Thrall, M., Dave, B., Kim, M. P. Breast cancer cells form primary tumors on ex vivo four-dimensional lung model. Journal of Surgical Research. 210, 181-187 (2017).
  13. Mishra, D. K., et al. Human Lung Fibroblasts Inhibit Non-Small Cell Lung Cancer Metastasis in Ex Vivo 4D Model. The Annals of Thoracic Surgery. 100 (4), discussion 1174 1167-1174 (2015).
  14. Mishra, D. K., Miller, R. A., Pence, K. A., Kim, M. P. Small cell and non small cell lung cancer form metastasis on cellular 4D lung model. BMC Cancer. 18 (1), 441(2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

ex vivo

Похожие статьи