Методическая статья

Количественная оценка Efferocytosis по микроскопии флуоресцирования одноклеточного

12.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58149

⸱

18 августа 2018 г.

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology and the Center for Human Immunology, University of Western Ontario, 2Institute of Infection and Global Health, University of Liverpool, 3Department of Respiratory Research, Aintree University Hospital NHS Foundation Trust

В этой статье

Краткое содержание

Efferocytosis, фагоцитарной удаление apoptotic клеток, необходимых для поддержания гомеостаза и облегчается рецепторов и сигнальных путей, которые позволяют для распознавания, поглощения и интернализация apoptotic клеток. Здесь мы представляем протокол микроскопии флуоресцирования для количественной оценки efferocytosis и активность efferocytic сигнальные пути.

Аннотация

Изучение правил efferocytosis требует методы, которые способны точно подсчитать поглощение apoptotic клеток и датчик сигнализации и клеточных процессов, которые управляют efferocytosis. Эта количественная оценка может быть трудным для выполнения как apoptotic клетки часто efferocytosed по частям, таким образом создавая необходимость методы, которые можно точно описать между efferocytosed часть целевого объекта apoptotic против остаточного unengulfed сотовых фрагменты. Подход, изложенный в настоящем документе использует двойной маркировки подходы к точно количественно оценить динамику развития потенциала efferocytosis и efferocytic efferocytes, такие как макрофаги. Помечены цитозоль клетки apoptotic клетки отслеживания краситель, чтобы включить мониторинг всех apoptotic клеток, полученных материалов, в то время как поверхности biotinylation apoptotic клетки позволяет для дифференциации между внутренним и не учитываются apoptotic клеток дробей. Объем efferocytic efferocytes определяется принимая флуоресцентного изображения клеток живых или фиксированной и количественной количество связанного против внутренней цели, как дифференцированные по окрашиванию стрептавидина. Этот подход обеспечивает несколько преимуществ над методы, такие как проточной цитометрии, а именно точное разграничение не efferocytosed против efferocytosed apoptotic клеток фракций, возможность измерения динамики efferocytic, микроскопия живой клетки и способность выполнять исследования клеточной сигнализации в клетках, выражая дневно меченых трансгенов. Комбинированные, методы, изложенные в настоящем Протоколе служат основой для гибкого экспериментальный подход, который может использоваться для точного количественного определения efferocytic активности и допросить сотовой сигнальных путей, активные во время efferocytosis.

Введение

Apoptosis или запрограммированная смерть клетки, является высоко регулируется физиологический процесс, который происходит в большинстве многоклеточных организмов и имеет решающее значение для их развития и гомеостаза1. Помимо участия в нормальной клетки оборота и эмбрионального развития, апоптоз позволяет ликвидации зараженных или поврежденных клеток тканей и может срабатывать в ответ на инфекции, воспаления, рак, а также медицинских вмешательств Например, лучевой терапии или стероидов1. Apoptotic клетки разоблачить «едят-me» сигналы на их поверхности клетки, которые признаны рецепторов на широкий спектр профессиональных и непрофессиональных фагоцитов, именуемые далее «efferocytes». Участие этих рецепторов вызывает поглощения и деградации apoptotic клетки, efferocyte через процесс, известный как efferocytosis2,3. Фосфатидилсерин лучше всего характеризуется едят-мне сигнал вождения efferocytosis. Обычно ограничивается внутренним листовка плазматической мембраны, с apoptosis, активация скрамблаза липидов, которая нарушает этой асимметрии мембраны, тем самым подвергая Фосфатидилсерин на поверхности клеток4. Фосфатидилсерин находится на поверхности внеклеточного-apoptotic клеток, таких как зрелые макрофаги и активации тромбоцитов. Однако эти клетки являются не efferocytosed из-за присутствия «не ешь меня» сигналов, таких как CD47, на их клеток поверхности5,6,7. Подвергаются Фосфатидилсерин признается массив efferocytic рецепторов, выраженную efferocytes. Связывание этих рецепторов к Фосфатидилсерин, либо непосредственно, либо через помощи опсонины, активирует сигнальных путей, способствующих сплошным apoptotic клеток в вакуоль мембраны прыгните называют efferosome8, 9 , 10 , 11 , 12. efferosome предохранители последовательно с endosomes и лизосомы, которые доставляют молекулярный механизм, необходимый для подкислять efferosome и ухудшить apoptotic клетки грузов13,14. После того, как деградация, apoptotic клеток производные материалы продаются в утилизации endosome — процесс, который ограничивает иммунных реакций к apoptotic клеток антигены, и которая может позволить для восстановления питательных веществ из клетки apoptotic13, 15. Неудача в efferocytosis результаты в нарушение Распродажа apoptotic клеток; в конечном итоге эти необезвреженные клетки претерпевают вторичные некрозы. Отмершие клетки релиз про воспалительных цитозольной содержимое, патогенов и autoantigens в внеклеточной окружение, таким образом, движущей широкий спектр инфекционный, воспалительных и аутоиммунных заболеваний16,17. Вместе, апоптоз и efferocytosis облегчить удаление мертвых и умирающих клеток и для поддержания гомеостаза ткани.

Изучение молекулярных механизмов лежащих в основе efferocytosis требует методы, которые обеспечивают четкую количественную оценку apoptotic клеток поглощения. Эта количественная оценка осложняется тем, что в отличие от других поглощения таких механизмов, как эндоцитоза и фагоцитоз18,19, efferocytosis не может привести к сплошным нетронутыми целевой ячейки, в результате частичного поглощения apoptotic клетки efferocyte20. Протокол, описываемые описывает в пробирке efferocytosis assay который обеспечивает точное разграничение интернализированных против-внутреннюю часть индивидуальных apoptotic клеток и могут быть объединены с целым рядом-клеток и микроскопия живой клетки подходы. Традиционные фагоцитоза анализов добавить антитела специфические фагоцитарной цели в конце эксперимента для того, чтобы называть не учитываются цели, где наш метод отличается маркировки apoptotic цель с ковалентно связан биотина21 , 22. в то время как apoptotic клеток специфические антитела могут использоваться в этом assay, biotinylation подход позволяет для любого целевого белка подшипник быть помечены и избегает потенциальных проблем с перекрестной реактивности вторичные антитела, если выполняется иммуноокрашивания . В частности мы наметим подготовки apoptotic клеток Jurkat, которые были двойной окрашенных клеток отслеживания красителя и биотин. Ячейка, отслеживания краситель позволяет для apoptotic клеток, полученных материалов быть считано во время efferocytosis, тогда как поверхности biotinylation позволяет для дискриминации внутреннюю от-внутреннюю часть efferocytosed apoptotic клеток. Мы также описывают культуру и подготовка J774.2 и THP-1 клеточных линий для использования в качестве мышиных и человеческого efferocytes, моноцитарных м2 макрофагов в качестве примера главной ячейки efferocytosis, и Jurkat клетки для использования как efferocytic целей. Эти методы легко может применяться для других клеточных линий или первичной клетки, клетки-мишени любой форме клеточной смерти (например апоптоза, некроз и necroptosis) и имитирует микронного размера, имитирующие apoptotic клетки через липидного покрытия или покрытие с лигандами, специфичные для efferocytic рецептор интерес.

Метод, изложенные в настоящем Протоколе имеет ряд преимуществ над методами цитометрии на основе потока, широко используется в области23,24. Непосредственно визуализации фагоцитарной apoptotic клеток взаимодействия, в сочетании с четкой маркировки как общая и не учитываются apoptotic клеток материала, можно сделать количественные показатели efferocytosis. Кроме того использование рН нечувствительным флуорофоров ограничивает отягощающих факторов, таких, как подавление FITC и GFP флуоресценции в лизосомальных рН, который смешивает некоторые альтернативные методы25. И наконец, хотя не подробно, эти методы могут быть использованы с помощью efferocytes, выражая дневно меченых трансгенов, или с иммуноокрашивания после фиксации, для количественной оценки сигнальные молекулы деятельность и мониторинг клеточные процессы во время efferocytosis.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Сбор крови от здоровых добровольцев был одобрен Советом здравоохранения этики научных исследований науки в университете Западного Онтарио. Венепункции была выполнена в соответствии с руководящими принципами изложения политики Tri-Совет по исследований человеческого.

1. Культура и подготовка клеточной линии Моноцит THP-1

  1. Моноциты THP-1 в культуре как подвеска культуры в колбах T25 при 37 ° C + 5% CO2. Клетки должны быть выращены в 5 мл Розуэлл парк Мемориальный институт 1640 (RPMI 1640) + 10% плода Bovine сыворотки (ФБС).
  2. Затем каждый день приостановить ячейки равномерно на протяжении роста СМИ, осторожно встряхивая колбу, немедленно подсчитать ячейки с Горяева. Клетки должны быть пассированной плотность клеток при достижении 1 х 106 клеток/мл:
    1. Предварительно теплой RPMI 1640 + 10% FBS в ванну воды 37 ° C.
    2. Передача 2 x 105 клетки в пробки microcentrifuge 1,5 мл или 15 мл Конические трубки и Пелле клетки центрифугированием на 500 x g при комнатной температуре в течение 5 мин.
    3. Удалить супернатант не нарушая Пелле клеток и Ресуспензируйте Пелле в 1 мл (1,5 мл пробки microcentrifuge) или 5 мл (15 мл Конические трубки) фосфат амортизированное saline (PBS).
    4. Центрифуга трубки на 500 x g при комнатной температуре на 5 мин удалить PBS не нарушая Пелле ячейки.
    5. Ресуспензируйте Пелле в 1 мл свежего RPMI 1640 + 10% FBS.
    6. В новое место колбу T25 4 мл утепленные средств массовой информации и к этому добавьте ресуспензированы клетки от 1.2.5. Культура в 37 ° C + 5% CO2 инкубатора до тех пор, пока клетки требуют пассированый (обычно 3 дня), или до тех пор, пока клетки необходимы для эксперимента.
  3. Для эксперимента с THP-1-производные макрофагов удалите необходимое количество клеток из фляги и пластины до пассированый:
    1. Поместите необходимое количество 18 мм круглые стекло coverslips (#1.5 толщина) в лунки 12-ну плиты — обычно 1 coverslip за состояние и/или timepoint. В каждом хорошо аликвота моноциты4 THP-1 5 x 10. Количество клеток добавил к каждой скважины могут быть изменены, если требуется.
    2. Воспитывать общий объем каждой ячейки содержащих хорошо для 1 мл с помощью RPMI + 10% FBS прогреты до 37 ° C.
    3. Добавьте 100 Нм phorbol 12-миристат 13-ацетат (PMA) для каждой скважины и культуры для 3 дней, чтобы побудить дифференцировки моноцитов THP-1 в Макрофаг подобных клеток.

2. Культура и подготовка линии клетки макрофагального J774.2

  1. Культура J774.2 клеток в колбах T25 при 37 ° C + 5% CO2. Клетки должны быть выращены в 5 мл Дульбекко изменение средних орла (DMEM) + 10% FBS и пассированной после того, как культура достигает 80-90% confluency. Для прохода клетки:
    1. Удалите все средства массовой информации из фляги и подъем раз с 5 мл PBS.
    2. Вынуть колбу PBS и заменить с 5 мл свежего DMEM + 10% FBS.
    3. С помощью скребка ячейки, выскабливаю дно колбы приостановить клетки в средствах массовой информации. Энергично Пипетка клетки несколько раз разрушить любой ячейки агрегатов.
    4. Разбавьте клетки 1:5, удалив 4 мл суспензии клеток из колбы и заменив его с 4 мл свежего средств массовой информации. Оставшиеся суспензию клеток можно отказаться, используется для запуска новой культуры клеток в свежий настой T25 или для эксперимента.
  2. Чтобы настроить для assay efferocytosis с использованием J774.2 клеток:
    1. Один день до начала эксперимента, приостановите J774.2 клетки в 5 мл свежего средств массовой информации, в соответствии с 2.1.1–2.1.3 шаги. Подсчитать ячейки с помощью Горяева и подготовить необходимый объем клеток в концентрации 5 х 104 клеток/мл.
    2. Поместите необходимое количество 18 мм круглые стекло coverslips (#1.5 толщина) в лунки 12-ну плиты. В каждом хорошо аликвота 1 мл суспензии клеток клеток/мл4 5 x 10.
    3. Культура в одночасье разрешить клетки присоединиться к coverslip и оправиться от пассированый.

3. Культура макрофагов первичного человека м2

  1. Собирайте 10 мл крови гепаринизированным человека за каждый 12-ну пластины макрофаги м2 требуется.
  2. В 15 мл пластиковых пробирок слой 5 мл крови человека на вершине 5 мл подогретым Lympholyte поли клетки разделения среды. Подготовить несколько трубок, если обработка > 5 мл крови вместо использования большего объема трубы.
  3. Центрифуга на 300 g x 35 мин, с использованием средних ускорение и без перерыва.
  4. Осторожно удалите Верхняя полоса богатые мононуклеарных клеток с использованием пластиковых дозаторов и передачи 50 мл пластиковых пробирок. Если в шаге 3.2 были подготовлены несколько трубок, полосы можно объединить в единый 50 мл трубки. Довести объем трубки до 50 мл с PBS.
  5. Центрифуга на 300 x g 8 мин и удалить супернатант. Во время этого шага место газобетона 18 мм диаметр круговой coverslips (толщина #1.5) в каждую лунку 12-ну плиты.
  6. Ресуспензируйте Пелле клеток в 300 мкл сыворотки бесплатно RPMI 1640 за желаемое количество скважин; например, если 10 мл крови было обработано подготовить полный 12 хорошо пластины, приостановить Пелле клеток в 3,6 мл средства массовой информации.
  7. Добавьте 300 мкл суспензии клеток coverslip содержащих хорошо в пластине 12-хорошо. Инкубируйте в течение 1 ч при 37 ° C + 5% CO2.
  8. Осторожно промыть coverslip 3 x с 1 мл раствора утепленные PBS для удаления любой non сторонник клеток.
  9. Добавьте 1 mL RPMI 1640 + 10% FBS + 10 нг/мл рекомбинантного человеческого M-CSF + клетки культуры антибиотик/противогрибковое. Инкубируйте на 37 ° C + 5% CO2 на 5 дней.
  10. Заменить СМИ RPMI 1640 + 10% FBS + 10 нг/мл рекомбинантного человеческого M-CSF + 10 нг/мл человеческого рекомбинантного ИЛ-4 + клетки культуры антибиотик/противогрибковое. Инкубируйте на 37 ° C + 5% CO2 на 2 дня для завершения м2 поляризации.
  11. Поляризованные макрофаги следует использовать в течение 3 дней.

4. Подготовка Apoptotic Jurkat клеток

  1. Культура клетки Jurkat в 5 мл RPMI 1640 + 10% FBS при 37 ° C + 5% CO2. Jurkats подвеска клеток линии и может поддерживаться пассированый 1:5 в свежие, подогретым СМИ каждые 3 – 5 дней.
  2. Чтобы подготовить apoptotic клетки, позволяют Jurkat культуры вырастет до высокой плотности (4 – 5 дней после пассированый). Аликвота 1,5 мл в 1,5 мл microcentrifuge трубки и Пелле клетки центрифугированием на 500 x g за 5 мин.
  3. Отменить супернатант и вновь приостановить Пелле клеток в 1 мл сыворотки бесплатно RPMI 1640 носитель, содержащий 1 мкм staurosporine.
  4. Инкубируйте 16 ч при 37 ° C + 5% CO2 для отображения apoptotic клетки.
  5. При необходимости подтвердите индукции апоптоза, окрашивание с Annexin V:
    1. Аликвота 100 мкл staurosporine лечение Jurkat клеточной культуры в пробки microcentrifuge 1,5 мл. Пелле клетки центрифугированием на 500 x g 5 минут, удалить супернатант и вновь приостановить Пелле клеток в 100 мкл сыворотки свободной среды RPMI 1640.
    2. 1 мкл флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC)-конъюгированных Annexin V и проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре в темноте.
    3. 900 мкл PBS и передача весь объем на один колодец 12-ну пластины, содержащие coverslip круглые стекло 18 мм (толщина #1.5). Спин вниз в центрифуге оснащены пластины адаптера на 200 x g за 1 мин заставить клетки присоединиться к coverslip. Кроме того клетки могут быть помещены в камерных слайд для воображения.
    4. Изображение с помощью микроскопа флуоресценции.

5. Количественная оценка Efferocytic поглощения и динамика, с помощью Efferocytosis Assay фиксированные клетки и пятнать наизнанку

  1. Подготовьте THP-1, J774.2 или м2 человека макрофагов, как описано в разделах 1-3, соответственно.
  2. Вечером перед началом эксперимента Подготовьте apoptotic клетки Jurkat, как описано в разделе 4.
  3. Непосредственно перед экспериментом граф apoptotic клеток с помощью Горяева. Перевести достаточное количество apoptotic клеток в пробки microcentrifuge 1,5 мл-мы обычно добавить 5 x 105 клеток/Ну, обеспечивая цель: efferocyte соотношении 10:1.
  4. Пелле Jurkat клетки центрифугированием на 500 g x 5 мин и Ресуспензируйте в 500 мкл PBS.
  5. Во время центрифугирования, кратные 10 мкл ДМСО в новые пробки microcentrifuge 1,5 мл. Растворяются в ДМСО минимальное количество N-hydroxysuccinimidobiotin (ГСЗ-биотин). достаточно 5-10 кристаллов (~0.005 мг).
  6. Передать 500 мкл apoptotic клеток/PBS подвеска ДМСО/ГСЗ биотин содержащие трубки. Затем разбавьте отслеживания краситель для производителя рекомендуемая концентрация в суспензию клеток apoptotic клетки. Убедитесь в том выбрать ячейку, отслеживание краска, которая не перекрываются спектрально с FITC-стрептавидина (например красный или far-red ячейки отслеживания краситель).
  7. Инкубируйте подвеска для 20 мин при комнатной температуре в темноте. Добавить равное количество RPMI 1640 + 10% FBS и проинкубируйте 5 мин при комнатной температуре в темноте, чтобы утолить любой непрореагировавшего красителя.
  8. Пелле клетки центрифугированием на 500 x g 5 минут, удалить супернатант и вновь приостановить окрашенных apoptotic клетки в 100 мкл RPMI 1640 + 10% FBS за хорошо макрофагов.
  9. Добавьте 100 мкл суспензии клеток окрашенных apoptotic каплям в каждой скважине макрофагов. Центрифуга 200 x г за 1 мин в центрифуге оснащены пластины адаптера может заставить контакта между макрофагами и apoptotic клетки.
  10. Инкубируйте плита за желаемый период времени при 37 ° C + 5% CO2 в инкубатор культуры ткани. Макрофаги, efferocytosed материал является обычно первым обнаружить после 20-30 мин и завершена после 120-180 мин.
  11. В нужный момент точек удалить ячейки из инкубатора. Вымойте клетки дважды с 1 мл раствора комнатной температуре PBS остановить efferocytosis и удалить не efferocytosed apoptotic клетки.
  12. В 1:1,000 разрежения в каждую лунку добавить FITC-конъюгированных стрептавидина и проинкубируйте втечение 20 мин в темноте. Это будет ярлык подвергаются биотина на любой материал клетки apoptotic non-efferocytosed.
    Примечание: При желании, клеточных ядер могут быть окрашены во время этого шага путем добавления топографической разрежения Hoechst 33342 или 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, дигидрохлорид (DAPI).
  13. Вымойте клетки 3 раза с 1 мл PBS, аккуратно покачивая или качалка образцы для 5 мин на полоскание. Исправить клетки с параформальдегида 4% (PFA) в PBS для 20 мин при комнатной температуре. Промойте клетки один раз с PBS для удаления избыточных PFA.
  14. Гора coverslips на слайде для изображений и передачи флуоресцентным микроскопом. Захват z стеки достаточное количество клеток для точной количественной оценки — обычно 10 – 30 ячеек на условие. Non внутреннюю apoptotic клеток материал будет очевидным в результирующий образ как ячейки отслеживания краситель, помечены материал, окруженная FITC-стрептавидина окрашивания, в то время как efferocytosed материал образует дискретные ячейки отслеживания краситель puncta свободной от любой стрептавидина пятнать.
  15. Количественно efferocytosis в результате изображения через целый ряд мер:
    1. Рассчитайте индекс efferocytic, определяя среднее количество дискретных efferosomes (ячейка отслеживания puncta краситель+/streptavidin– ) за макрофагов. Количественно только макрофаги привязан к apoptotic клеток или содержащие ≥1 видимой efferosomes. Запись макрофаги привязан к apoptotic клеток, но не хватает дискретных efferosomes, как efferocytic индекс 0.
    2. Рассчитайте efferocytic эффективность путем измерения доли макрофагов, содержащих ≥1 efferosome.
    3. Вычислить скорость efferocytosis клетками изображения фиксированной и витражи на несколько моментов времени. Только изображение макрофаги привязаны к apoptotic клетки, или содержащие видимых efferosomes, с z стеки захватили каждой ячейки. После записи образа, определите скорость efferocytosis:
      1. С помощью окрашивания стрептавидина как руководство и средство выбора произвольной или многоугольника в Фиджи/ImageJ26 (или другой пакет программного обеспечения анализа изображений), круг все ячейки отслеживания краситель+/streptavidin– (например внутреннюю) материал в одной плоскости z-стека. Измерьте интенсивность комплексной ячейки отслеживания краска этот регион. Отдельные меры для каждого efferosome (например , диаметр, позиционирования относительно границы ячейки или ядра и т.п.)15,27 может легко быть приобретены одновременно с этими измерениями, значительно увеличение данных собранных в ходе анализа.
      2. На том же z секции, используя стрептавидина, окрашивание и средство выбора произвольной или многоугольник, круг все ячейки отслеживания /streptavidin краска++ (например не учитываются) материала в одной плоскости z-стека . Включайте только окрашивания apoptotic клеток при контакте с фагоцитов. Измерьте интенсивность комплексной этого региона.
      3. Повторите шаги 4.2.3.1 для 4.2.3.2 для оставшихся z участков изображения. Сумма интенсивность комплексной efferocytosed (ΣРЭ) и не efferocytosed (Σne) материалов. Фракция apoptotic клеток, который был efferocytosed может быть вычислено для ячейки как:
        figure-protocol-1
      4. Количественно фракция efferocytosed для всех ячеек во всех точках времени. Обратите внимание, что интенсивности флуоресценции apoptotic клеток/efferosomes может варьироваться между изображениями, вследствие изменений в поглощение ячейки отслеживания красителями отдельных apoptotic клеток и из-за изменения параметров получения изображений, таких как время экспозиции. Таким образом только сравнить нормализованные значения как часть Efferocytosed, или интенсивности независимые значения, такие как индекс efferocytic и efferocytic эффективности, между изображениями, между экспериментальных условиях, а также между повторить эксперименты.
    4. Чтобы убедиться, что результирующий набор данных точно отражает различия в efferocytosis между ячейками, проводят эти анализы на максимальное количество ячеек можно в каждом эксперименте.
      Примечание: Индекс эффективности и efferocytic Efferocytic может быть рассчитана быстро (через несколько секунд/клетка), и мы обычно стремятся проанализировать по меньшей мере 100 ячеек на эксперимент, повторяя каждый эксперимент по крайней мере 3 раза. Расчёт брались efferocytosed материал и efferosome конкретные меры более трудоемкий, обычно с 2 – 3 мин/cell для опытный аналитик. Для этих расчетов мы количественно минимум 15 ячеек на условие, на эксперимент.
    5. Индекс записи efferocytic, efferocytosed фракция и отдельных efferosome данных на основе в клеток.
      Примечание: Это позволяет для анализа данных с использованием одной ячейки подходов, таким образом позволяя вариации между клеток быть количественно. Анализ уровня населения по-прежнему может проводиться на эти наборы данных путем усреднения одной ячейки данных, полученных в отдельных экспериментов. Efferosome конкретных измерений могут быть проанализированы на уровне населения, одной ячейки и как ансамбли (например как населения независимо от клетки, содержащие их efferosomes)15.

6. живут Efferocytosis Assay клетки Apoptotic клетки

  1. Подготовьте THP-1, J774.2 или м2 макрофагов, как описано в шагах 1-3, соответственно. При необходимости следует transfected клеток с трансгенов или другие генетические конструкции по крайней мере в 18 h до выполнения каких-либо экспериментов.
  2. Вечером перед началом эксперимента, подготовьте apoptotic клетки Jurkat, как описано в разделах 4 и 5, со следующими изменениями:
    1. Разбавить клетки и индуцировать апоптоз согласно 4.1 – 4.3 и собрать необходимое количество apoptotic клеток согласно 5.3-5.4.
    2. Добавление ячейки отслеживания красителя на производителя рекомендуемая концентрация суспензию apoptotic клеток. Инкубируйте подвеска для 20 мин при комнатной температуре в темноте. Добавить равное количество RPMI 1640 + 10% FBS и проинкубируйте 5 мин при комнатной температуре в темноте, чтобы утолить любой непрореагировавшего красителя. Не добавляйте ГСЗ биотина для этих экспериментов.
    3. Пелле клетки центрифугированием на 500 x g 5 минут, удалить супернатант и вновь приостановить окрашенных apoptotic клетки в 100 мкл RPMI 1640 + 10% FBS за хорошо макрофагов.
  3. При необходимости, лейбл порекомендованное макрофаги, удалив культуры средств массовой информации из каждой скважины и добавив 500 мкл PBS, содержащих производители разрежения ячейки отслеживания красителя, не перекрываются спектрально с ячейкой, отслеживание краситель добавляется apoptotic клетки или любой Флуоресцентный трансгенов выраженные макрофаги. Проинкубируйте втечение 20 мин при комнатной температуре в темноте, а затем добавить равное количество DMEM + 10% FBS и проинкубируйте 5 мин при комнатной температуре в темноте, чтобы утолить любой непрореагировавшего красителя.
  4. Передача Макрофаг содержащих coverslip в Лейден камеру. Добавить 400 мкл DMEM + 10% FBS, следуют 100 мкл суспензии помечены apoptotic клеток. Смешайте нежно закупорить СМИ 2 – 3 раза.
  5. Передать Лейден камере нагревается и CO2-перфузии палаты флуоресцентный Микроскоп живой клетки.
    Примечание: Для Микроскоп установок, которые не имеют возможности перфузии CO2 , использовать ткани культуры среднего буферизацией с 1 мм 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic кислота (HEPES) вместо бикарбоната натрия для поддержания физиологических pH во время Культура, подвергается воздействию воздуха.
  6. Захват покадровой серии, содержащий белый свет (Фазовый контраст или ДВС) изображения и изображения всех флуоресцентные метки:
    1. Используйте 100 X объектив для экспериментов при урегулировании мелких деталей (например мембраны динамика фагоцитарной apoptotic клеток взаимодействий). Между тем, более общих мер (ставка apoptotic клеток поглощения, время взаимодействия между макрофагами и apoptotic клетки, и т.д.) лучше всего отражаются с помощью 60 X или 63 X цели.
    2. Если доступна, используйте точки посещение для нескольких полей Просмотр изображений во время одного приобретения, тем самым увеличивая количество событий efferocytic, захваченные в одном эксперименте
    3. Потому что efferocytes часто поглотит небольшие фрагменты apoptotic клетки, а не нетронутыми клетки, то лучше захватить z стеки. Чтобы свести к минимуму Фототоксичность, захватить z разделов, разделенных глубины очага вашей цели микроскопы (обычно 0.5-1.0 мкм), через толщину клетки (обычно 8-10 мкм для макрофагов, например 8 – 20 ломтиков/клеток). Это гарантирует, что все сплошным и людьми события будут видны в по крайней мере одной плоскости z. Можно также использовать крупные (диаметром 1-5 мкм) apoptotic клеток имитирует или apoptotic клетки, которые подвергаются минимальной фрагментации во время efferocytosis (например тепла потрясен нейтрофилов) вместо без укладки z-. Мы описали подготовки мимики и apoptotic нейтрофилов ранее28.
    4. Чтобы свести к минимуму Фотообесцвечивание, использовать яркие флуорофоров и захват фото с помощью приобретения параметры, которые сводят к минимуму Фотообесцвечивание — например низк интенсивности возбуждения, в сочетании с Камера высокой прибыли и экспозиции раз29. Мы настоятельно рекомендуем использовать микроскоп с высок чувствительности электромагнитного зарядовой (ЭМ-CCD) камеры или спиннинг диск конфокальный и высокоскоростной пьезоэлектрический механические стадии, для этой формы визуализации.
  7. Количество возможных анализа методов, которые могут быть применены к эти покадровой видео является обширной и вне нашей способности для обзора здесь. В качестве некоторых примеров использование ручного или автоматического отслеживания программного обеспечения для отслеживания fusion, деления и движение efferosomes внутри клетки15, количественную оценку динамики фьюжн efferosome с endolysosomes colocalization анализа в макрофагах выражая Флуоресцентный трансгенов отсек конкретных13, процессы поглощения монитора например зондирующего и Кубок формирования30, определить динамику набора сигнализации и оборотом белки efferosome13, и/или количественно деструктивные действия efferosomes с помощью apoptotic клетки с pH фактора, окислитель чувствительных или протеаз активированный флуорофоров31.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Культура клеток Jurkat с 1 мкм staurosporine результаты в апоптоз в одночасье > 95% клеток, которые могут быть подтверждены с Annexin V окрашивание (рис. 1). Другие типы клеток может использоваться для этих экспериментов, хотя концентрация staurosporine и продолжительность лечения staurosporine должны быть оптимизированы для каждой ячейки строки. Для надежного обнаружения и количественного определения efferocytosis > 80% клеток должно быть apoptotic до ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Методы, изложенные в настоящем Протоколе позволяют изображений и количественной оценки процесса динамического efferocytic, используя подходы в-клеток и клеток. Эти подходы предлагают несколько преимуществ над обычно занятых потока методы на основе цитометрии23,24. Использование наизнанку окрашивание с фиксированной образцы обеспечивает более надежную и точную количественную оценку скорости и степени efferocytosis — действительно, многие методы, основанные на цито...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют никакого конфликта интересов.

Благодарности

Это исследование финансировалось Канадским институтов медицинских исследований (КНИИЗ) действующих грантов СС-123419, естественных наук и инженерных исследований Совет из Канады обнаружения Грант 418194 и Онтарио Министерство исследований и инноваций ранних исследований премии для BH. DGW способствовали некоторые из изображений, представленных, оптимизации протоколов и написания манускрипта; Он финансировался насоса грунтование грант от Ливерпульского университета. CY финансируется Ванье Магистратура стипендии и КНИИЗ MD/PhD студенчества. Финансирующие учреждения имели никакой роли в дизайн исследования, сбор данных и анализ, решение опубликовать или подготовка рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
RPMI 1640 MediaWisent3500-000-EL
DMEM MediaWisent319-005-CL
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Wisent080-150
PBSWisent311-010-CL
18 мм круглая стеклянная защитная накладная #1,5 толщинаЭлектронная микроскопия Науки72290-08Размер и форма покровного стекла не критичны, но 18 мм укладываются в лунки стандартного 12-луночного планшета, что упрощает культивирование клеток
StaurosporineCayman Chemical81590Растворить в ДМСО при 1 мМ (1 000х стоковый раствор)
Аннексин V-Alexa 488ThermoFisherR37174
EZ-Link NHS-BiotinThermoFisher20217Хранить в эксикаторе. Не готовьте стоковый раствор.
DMSOSigma-AldrichD2650
CellTrace FarRedThermoFisherC34572
CellTrace OrangeThermoFisherC34851
Hoescht 33342ThermoFisher62249
FITC-StreptavadinThermoFisherSA1001
Среда для сепрационной сепрации лимфолит-поликлетокCedarlane LabsCL5071
Рекомбинантная человеческая M-CSFPeprotech200-04
Рекомбинантная человеческая IL-4Peprotech300-25
J774.2 Макрофагальная клеточная линияSigma-Aldrich85011428-1VL
THP-1 Моноцитарная клеточная линия человекаATCCTIB-202
Т-клеточная линия JurkatATCCTIB-152

Ссылки

  1. Elmore, S. Apoptosis: A review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
  2. Toda, S., Hanayama, R., Nagata, S. Two-step engulfment of apoptotic cells. Molecular and Cellular Biology. 32 (1), 118-125 (2012).
  3. Ravichandran, K. S. Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: Progress and conundrums. The Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).
  4. Fadok, V. A., Voelker, D. R., Campbell, P. A., Cohen, J. J., Bratton, D. L., Henson, P. M. Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages. Journal of Immunology. 148 (7), 2207-2216 (1992).
  5. Bevers, E. M., Comfurius, P., van Rijn, J. L., Hemker, H. C., Zwaal, R. F. Generation of prothrombin-converting activity and the exposure of phosphatidylserine at the outer surface of platelets. European Journal of Biochemistry. 122 (2), 429-436 (1982).
  6. Callahan, M. K., Williamson, P., Schlegel, R. A. Surface expression of phosphatidylserine on macrophages is required for phagocytosis of apoptotic thymocytes. Cell Death and Differentiation. 7 (7), 645-653 (2000).
  7. Kojima, Y., et al. CD47-blocking antibodies restore phagocytosis and prevent atherosclerosis. Nature. 536, 86-90 (2016).
  8. Seitz, H. M., Camenisch, T. D., Lemke, G., Earp, H. S., Matsushima, G. K. Macrophages and dendritic cells use different Axl/Mertk/Tyro3 receptors in clearance of apoptotic cells. Journal of Immunology. 178, 5635-5642 (2007).
  9. Ichimura, T., Asseldonk, E. J. P. V., Humphreys, B. D., Gunaratnam, L., Duffield, J. S., Bonventre, J. V. Kidney injury molecule-1 is a phosphatidylserine receptor that confers a phagocytic phenotype on epithelial cells. The Journal of Clinical Investigation. 118 (5), 1657-1668 (2008).
  10. Flannagan, R. S., Canton, J., Furuya, W., Glogauer, M., Grinstein, S. The phosphatidylserine receptor TIM4 utilizes integrins as coreceptors to effect phagocytosis. Molecular Biology of the Cell. 25 (9), 1511-1522 (2014).
  11. Park, D., et al. BAI1 is an engulfment receptor for apoptotic cells upstream of the ELMO/Dock180/Rac module. Nature. 450 (7168), 430-434 (2007).
  12. Elliott, M. R., Koster, K. M., Murphy, P. S. Efferocytosis Signaling in the Regulation of Macrophage Inflammatory Responses. Journal of Immunology. 198 (4), 1387-1394 (2017).
  13. Yin, C., Kim, Y., Argintaru, D., Heit, B. Rab17 mediates differential antigen sorting following efferocytosis and phagocytosis. Cell Death & Disease. 7 (12), e2529(2016).
  14. Kinchen, J. M., et al. A pathway for phagosome maturation during engulfment of apoptotic cells. Nature Cell Biology. 10 (5), 556-566 (2008).
  15. Yin, C., Argintaru, D., Heit, B. Rab17 mediates intermixing of phagocytosed apoptotic cells with recycling endosomes. Small GTPases. 0 (0), 1-9 (2017).
  16. Silva, M. T. Secondary necrosis: The natural outcome of the complete apoptotic program. FEBS letters. 584 (22), 4491-4499 (2010).
  17. Thorp, E. B. Mechanisms of failed apoptotic cell clearance by phagocyte subsets in cardiovascular disease. Apoptosis. 15 (9), 1124-1136 (2010).
  18. Sarantis, H., Grinstein, S. Monitoring phospholipid dynamics during phagocytosis: application of genetically-encoded fluorescent probes. Methods in Cell Biology. 108, 429-444 (2012).
  19. Steinberg, B. E., Grinstein, S. Analysis of macrophage phagocytosis: Quantitative assays of phagosome formation and maturation using high-throughput fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 531, 45-56 (2009).
  20. Wang, J., Hossain, M., Thanabalasuriar, A., Gunzer, M., Meininger, C., Kubes, P. Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair. Science. 358 (6359), 111-116 (2017).
  21. Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. The Journal of Cell Biology. 169 (1), 139-149 (2005).
  22. Greenlee-Wacker, M. C., Rigby, K. M., Kobayashi, S. D., Porter, A. R., DeLeo, F. R., Nauseef, W. M. Phagocytosis of Staphylococcus aureus by human neutrophils prevents macrophage efferocytosis and induces programmed necrosis. Journal of Immunology. 192 (10), 4709-4717 (2014).
  23. Wootton, D. G., et al. Recovery from pneumonia requires efferocytosis which is impaired in smokers and those with low body mass index and enhanced by statins. Thorax. 71 (11), 1052-1054 (2016).
  24. Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
  25. Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophysical Journal. 74 (3), 1591-1599 (1998).
  26. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  27. Johnson, D. E., Ostrowski, P., Jaumouillé, V., Grinstein, S. The position of lysosomes within the cell determines their luminal pH. The Journal of Cell Biology. 212 (6), 677-692 (2016).
  28. Evans, A. L., Blackburn, J. W. D., Yin, C., Heit, B. Quantitative efferocytosis assays. Methods in Molecular Biology. 1519, 25-41 (2017).
  29. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), (2017).
  30. Flannagan, R. S., Harrison, R. E., Yip, C. M., Jaqaman, K., Grinstein, S. Dynamic macrophage "probing" is required for the efficient capture of phagocytic targets. The Journal of Cell Biology. 191 (6), 1205-1218 (2010).
  31. Joshi, G. N., Gilberti, R. M., Knecht, D. A. Single cell analysis of phagocytosis, phagosome maturation, phagolysosomal leakage, and cell death following exposure of macrophages to silica particles. Methods in Molecular Biology. 1519, 55-77 (2017).
  32. Karaji, N., Sattentau, Q. J. Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells. Frontiers in Immunology. 8 (DEC), 1863(1863).
  33. Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes fuse with late endosomes and/or lysosomes by extension of membrane protrusions along microtubules: role of Rab7 and RILP. Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6494-6506 (2003).
  34. Reiners, J. J., Kleinman, M., Kessel, D., Mathieu, P. A., Caruso, J. A. Nonesterified cholesterol content of lysosomes modulates susceptibility to oxidant-induced permeabilization. Free Radical Biology & Medicine. 50 (2), 281-294 (2011).
  35. Boya, P., et al. Lysosomal membrane permeabilization induces cell death in a mitochondrion-dependent fashion. The Journal of Experimental Medicine. 197 (10), 1323-1334 (2003).
  36. Fairn, G. D., Grinstein, S. How nascent phagosomes mature to become phagolysosomes. Trends in Immunology. , 1-9 (2012).
  37. Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Molecular Biology of the Cell. 25 (21), 3330-3341 (2014).
  38. Phanse, Y., et al. Analyzing cellular internalization of nanoparticles and bacteria by multi-spectral imaging flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (64), e3884(2012).
  39. Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 230-233 (2011).
  40. Davies, S. P., Reynolds, G. M., Stamataki, Z. Clearance of apoptotic cells by tissue epithelia: A putative role for hepatocytes in liver efferocytosis. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
  41. Ismail, O. Z., Zhang, X., Bonventre, J. V., Gunaratnam, L. G protein α12(Gα12) is a negative regulator of kidney injury molecule-1-mediated efferocytosis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 310 (7), F607-F620 (2016).
  42. Vaught, D. B., Stanford, J. C., Cook, R. S. Efferocytosis creates a tumor microenvironment supportive of tumor survival and metastasis. Cancer Cell & Microenvironment. 2 (1), (2015).
  43. Heit, B., Yeung, T., Grinstein, S. Changes in mitochondrial surface charge mediate recruitment of signaling molecules during apoptosis. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 300 (1), C33-C41 (2011).
  44. Múnera, J. O., Wells, J. M. Generation of Gastrointestinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1597, 167-177 (2017).
  45. Truman, L. A., et al. CX3CL1/fractalkine is released from apoptotic lymphocytes to stimulate macrophage chemotaxis. Blood. 112 (13), 5026-5036 (2008).
  46. Evans, A. L., et al. Antagonistic Coevolution of MER Tyrosine Kinase Expression and Function. Molecular Biology and Evolution. , (2017).
  47. Flannagan, R. S., Heit, B., Heinrichs, D. E. Intracellular replication of Staphylococcus aureus in mature phagolysosomes in macrophages precedes host cell death, and bacterial escape and dissemination. Cellular Microbiology. , (2015).
  48. Mubaid, F., Brown, C. M. Less is More: Longer Exposure Times with Low Light Intensity is Less Photo-Toxic. Microscopy Today. 25 (06), 26-35 (2017).
  49. Bogdanov, A. M., Kudryavtseva, E. I., Lukyanov, K. A. Anti-fading media for live cell GFP imaging. PloS One. 7 (12), e53004(2012).
  50. Rossner, M., Yamada, K. M. What's in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166 (1), 11-15 (2004).
  51. Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
  52. Ma, G. Z. M., Stankovich, J., Kilpatrick, T. J., Binder, M. D., Field, J. Polymorphisms in the receptor tyrosine kinase MERTK gene are associated with multiple sclerosis susceptibility. PloS One. 6 (2), e16964(2011).
  53. Thorp, E., Cui, D., Schrijvers, D. M., Kuriakose, G., Tabas, I. Mertk receptor mutation reduces efferocytosis efficiency and promotes apoptotic cell accumulation and plaque necrosis in atherosclerotic lesions of apoe-/- mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (8), 1421-1428 (2008).
  54. Nguyen, K. -Q. N., et al. Overexpression of MERTK Receptor Tyrosine Kinase in Epithelial Cancer Cells Drives Efferocytosis in a Gain-of-Function Capacity. The Journal of Biological Chemistry. 289 (37), 25737-25749 (2014).
  55. Morimoto, K., et al. Lovastatin enhances clearance of apoptotic cells (efferocytosis) with implications for chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Immunology. 176 (12), 7657-7665 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Z

Похожие статьи