Пивоваренные дрожжи Экспоненциальный рост кинетика в культуре партии для анализа дыхания и ферментативным метаболизма

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол для оценки метаболизм дыхания и ферментативным путем установки экспоненциальный рост Saccharomyces cerevisiae экспоненциальный рост уравнения. Расчета кинетических параметров позволяет для проверки влияния веществ/соединений на брожение или митохондриальное дыхание.

Аннотация

Пивоваренные дрожжи клетки в экспоненциальной фазе роста, производя СПС через ферментации и/или митохондриальное дыхание. Концентрация углерода сбраживаемых главным образом регулирует как дрожжевых клеток генерировать СПС; Таким образом различия в уровнях сбраживаемых углеводов диски энергетический метаболизм S. cerevisiae. Этот документ описывает метод высокой пропускной способностью на основе экспоненциального дрожжей роста для оценки последствий изменения концентрации и характер источника углерода на метаболизм дыхания и ферментативной. Рост S. cerevisiae измеряется в Гонав или потрясен конической колбе путем определения оптической плотности (OD) на 600 Нм. Затем кривая роста построен построения ОД против времени, что позволяет выявление и отбор экспоненциальной фазе и оснащен экспоненциальный рост уравнение для получения кинетическими параметрами. Низкие конкретные темпы роста с выше удвоение раз обычно представляют дыхания рост. И наоборот более высокие темпы роста конкретных с нижней удвоение раз указывают на ферментативную рост. Пороговые значения удвоения время и темп роста конкретных оцениваются с помощью хорошо известных дыхания или ферментативную условия, такие как источников без сбраживаемых углерода или более высокие концентрации сбраживаемых Сахаров. Это получается для каждого конкретного штамма. Наконец рассчитанные кинетических параметров сравниваются с пороговые значения установить ли дрожжи показывает ферментативной и/или респираторных роста. Преимуществом данного метода является его относительная простота для понимания воздействия вещества/смеси на ферментативную или дыхательных путей метаболизма. Важно подчеркнуть, что рост является сложной и сложной биологический процесс; Таким образом предварительные данные из этого метода должен быть подтвержден количественная оценка потребления кислорода и накоплением побочные продукты брожения. Таким образом этот метод может использоваться как предварительный скрининг соединений/веществ, которые могут нарушить или улучшают ферментативную или дыхательных путей метаболизма.

Введение

Saccharomyces cerevisiae роста служит ценным инструментом для выявления десятки физиологических и молекулярных механизмов. Рост измеряется прежде всего тремя методами: серийных разведений для выборочной проверки, образуя колонии единица подсчета и кривых роста. Эти методы могут использоваться отдельно или в сочетании с различными субстратами, экологических условий, мутантов и химических веществ расследовать конкретные ответы или фенотипов.

Митохондриальное дыхание-это биологический процесс, в котором Кинетика роста успешно применяется для обнаружения неизвестных механизмов. В этом случае добавок питательных сред с без сбраживаемых ....

Протокол

1. Культура средства массовой информации и подготовка посевным материалом

1. Подготовка 100 мл 2% дрожжевой экстракт Пептон декстрозы (YPD) жидкой среды (добавить 1 г дрожжей экстракт, казеина Пептон, 2 g и 2 g глюкозы до 100 мл дистиллированной воды). Отказаться от 3 мл СМИ в 15 мл стерилизуются конические трубы. Автоклав СМИ за 15 мин при температуре 121 ° C и 1,5 psi.
   Примечание: Средства массовой информации могут быть сохранены на срок до одного месяца на 4 – 8 ° C.
2. Прививать Конические трубки, заполненные с 3 мл прохладной стерильные 2% YPD бульон с 250 мкл клеток S. cerevisiae , сохранились в глицерин при-20 ° C. Инкубируйте на ночь ....

Результаты

Кривые роста может использоваться для предварительно различать дыхания и ферментативным фенотипы в дрожжей S. cerevisiae . Таким образом, мы исполняли партии культуры S. cerevisiae (BY4742) с концентрациями различных глюкозы, представивших побудить ферментативным рост: 1%, 2% и 10% (w/v)⁹. Культуры, показаны ферментативным фенотипа имеют небольшое отставание фазы и экспоненциальной фазе с высокими темпами роста (рис. 1

Обсуждение

Много времени прошло с момента J. Monod¹⁰ выразил, что изучение роста бактериальных культур является основным методом микробиологии. Появление молекулярной инструменты задержки использования и изучения роста как техника. Несмотря на сложность роста, которая включает в себя множество взаимосвязанных процессов его основных механизмов можно охарактеризовать с помощью математической модели¹¹. Это надежный подход, который может использоваться в качестве дополнительного инструмен.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Орбитальный шейкер	Thermo Scientific	4353	Для инкубации инокулюма или конических камерных культур
Bioscreen	Кривые роста	C MBR	Для периодических культур в микропланшетах
Глюкоза	Sigma	G7021	Для приготовления бульона YPD
Пептон из казеина, ферментативный дигест	Sigma	82303	Для приготовления бульона YPD
Дрожжевой экстракт	Sigma	09182-1KG-F	Для приготовления бульона YPD
Бактериологический агар	Sigma	A5306	Для препарата агара YPD
2PO4	Sigma	S8282	Для приготовления бульона SC
(NH4)2SO4	Sigma	A4418	Для приготовления бульона
SC Дрожжевая азотная основа без аминокислот и сульфата аммония	Sigma	Y1251	Для приготовления бульона SC
Дрожжи синтетические добавки к среде Sigma		Y1501	Для приготовления бульона SC
сульфат аммония гранулированный	J.T. Baker	0792-R	Для средней добавки, например
ресвератрол	Sigma	R5010	Для средней добавки, например
галактоза	сигма	G8270	Для средних добавок, например
сахароза	Sigma	S7903	Для примера средней добавки
Absolut этанол	Merck	107017	Для примера средней добавки
Glycerin	J.T. Baker	2136-01	Для примера средней добавки
GraphPad Prism	GraphPad Программное обеспечение		Для анализа данных
Сотовые микропланшеты	Thermo Scientific	9502550	Для культур на микропланшетах

, , ,