Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Нейтрофильные внеклеточного ловушки, порожденных низкой плотности нейтрофилов получены перитонеальный лаваж жидкости посредником рост опухолевых клеток и вложения

8.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58201

⸱

3 августа 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Gastrointestinal Surgery, Jichi Medical University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем метод, в котором low-density нейтрофилов человека (LDN), оправился от послеоперационных перитонеальный лаваж жидкости, производят массовые нейтрофилов внеклеточного ловушки (сетки) и эффективно ловушки бесплатно опухолевых клеток, которые впоследствии растут.

Аннотация

Активация нейтрофилов освобождение нейтрофилов внеклеточного ловушки (сетки), которые могут захватить и уничтожить микробов. Последние исследования показывают, что сети участвуют в различных процессах болезни, например, аутоиммунные заболевания, тромбоз и опухолевых метастаз. Здесь мы покажем подробный в vitro технику для выявления чистой активности во время треппинга бесплатно опухолевых клеток, которые растут после присоединения к сети. Во-первых мы собрали низкой плотности нейтрофилов (LDN) от послеоперационных перитонеальный лаваж жидкости из пациентов, перенесших лапаротомию. Краткосрочные культивирования LDN привели к массовым NET формирования, который был визуализирован с зеленый люминесцентной ядерных и хромосомы изображение. После совместного инкубации линий клеток человека рак желудка, MKN45, OCUM-1 и NUGC-4 с сеткой Нетс были ловушку многие опухолевых клеток. Впоследствии вложение был полностью отменен, деградация сетей с DNase I. Time-lapse видео показали, что клетки опухоли, захваченных Нетс не умрет, но вместо энергично вырос в непрерывной культуры. Эти методы могут применяться для обнаружения клей взаимодействия сетей и различных видов клеток и материалов.

Введение

Превращение ядерной нейтрофилов в циркулирующей крови обычно отделяются от мононуклеарных клеток через метод подготовки градиента плотности. Однако некоторые нейтрофилов, известный как low-density нейтрофилов (LDN), с CD11b(+), CD15(+), CD16(+) и CD14(-) фенотипов, совместной очищенную с мононуклеарных клеток. Относительное количество LDN значительно увеличивается при различных патологических состояниях, включая аутоиммунные заболевания1,2, сепсис3и рак4,5. Предыдущие исследования показали, что LDN являются фенотипически и функционально собственный класс6нейтрофилы. Следует отметить, что LDN в циркулирующей крови чаще производить нейтрофилов внеклеточного ловушки (сетки), чем нормальной густоты нейтрофилов2,7. Нетс веб как структуры, состоящий из нуклеиновых кислот, гистонов, протеаз и гранулированных и цитозольной белков, и они могут эффективно завлечь и уничтожить патогенов8.

Недавно было показано сеток захватить не только микробы, но и тромбоцитов и циркулирующих клеток опухоли, которые могут помочь в тромба формирования9 и опухолевых метастаз10,11. Однако молекулярные механизмы за клей взаимодействия сетей и тромбоцитов или опухолевых клеток по-прежнему неясны. Совсем недавно в пробирке адгезии assay показали, что клетки миелоидного лейкоза (12K562) и клетки карциномы легких (13A549) придают сетей через β1 и β3 интегринов. Авторы использовали чистых запасов изолированы от нейтрофилов и активированную phorbol 12-миристат 13-ацетат (PMA) как субстрат адгезии14. Хотя этот assay позволяет определение реальных взаимодействий с чистой компонентами в отсутствие нейтрофилов, это спорный ли «клеток свободный чистых запасов» изолированные высокоскоростной центрифугированием сохраняет молекулярной структурой, идентичной сетки производится в VIVO. Недавно мы нашли что перитонеальный лаваж жидкости после абдоминальной хирургии содержатся многие пожилые LDN, который генерируется массивные сеток и придает опухолевых клеток, вызывая перитонеальных метастазов15. В этом исследовании мы успешно изучили адгезию опухолевых клеток с нетронутыми сеток без каких-либо физических манипуляций. Здесь мы показать детали техники для обнаружения клей взаимодействия сетей и бесплатные опухолевых клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

LDN были получены от пациентов, зачисленных в этом исследовании и были одобрены организационного обзора Совет Jichi медицинского университета.

1. изоляция LDN из брюшной полости смывов и чистой обнаружения

  1. Приобретение образца
    1. Влить 1000 мл стерильным физиологическим непосредственно в брюшную полость до закрытия раны в пациентов, которые подверглись абдоминальной хирургии вследствие злокачественных новообразований желудочно-кишечного тракта.
      Примечание: Образцы были получены от пациентов, перенесших гастрэктомия, колэктомия или esophagectomy без предвзятости, на основании возраста или пола. Солевой раствор был переведен в контейнер и выливают в весь живот в течение одной минуты. Обычно это выполняется как послеоперационных перитонеальный стиральные без значительного воздействия на пациентов.
    2. Промывание брюшной полости широко для по крайней мере 1 мин.
      Примечание: Рекомендуется, что заваренного жидкость медленно перемешивают руками хирурга так что образцы являются однородными.
    3. Восстанавливает 200 мл жидкости промывания с четырьмя 50 мл-шприцы.
      Примечание: Иногда резиновый соединитель используется для занять жидкости.
  2. Выполнение очистки перитонеальный LDN, используя конкретные МАБ гранулоцитов, CD66b16.
    Примечание: Поскольку промежуточного слоя после плотность градиентного центрифугирования содержит много мононуклеарных клеток, положительный выбор полиморф нейтрофилов, используя CD66b МАБ была выполнена.
    1. Передать перитонеальный лаваж жидкость 50 мл трубки.
      Примечание: В этот шаг, передайте жидкости через 100 мкм Нейлоновый фильтр для удаления примесей.
    2. Центрифуга перитонеальной жидкости на 270 g x 7 мин на RT.
    3. Ресуспензируйте гранулы в 5 мл PBS с 0,02% ЭДТА.
    4. Тщательно наложение 5 мл суспензии клеток на 3 мл раствора градиент плотности.
    5. Центрифуга на 1700 x g 15 мин на RT без каких-либо перерывов.
    6. Урожай ~ 2-3 мл раствора, содержащего промежуточных слоев (рис. 1A) с помощью пипетки и смешайте его с 10 мл PBS с 0,02% ЭДТА.
    7. Центрифуга перитонеальной жидкости при 400 g x 7 мин на RT и удалить супернатант.
    8. Добавьте еще 10 мл PBS с 0,02% ЭДТА и центрифуги на 270 g x 7 мин на RT. удалить супернатант.
    9. Растворяют в 60 мкл буфера для комплекта разделения магнитных ячейки ячейки Пелле (1 x 10-7).
    10. 20 мкл ФК блока для гранул и проинкубируйте втечение 10 мин при 4 ° C.
    11. Добавить 20 мкл анти CD66b с микрошарики и инкубировать еще 10 мин при 4 ° C.
    12. Вымойте и вновь приостановить гранулы в 500 мкл буфера MACS.
    13. Применить суспензию клеток к столбцу магнитные в магнитном поле подходящие магнитного сепаратора и собирать потока через содержащих CD66b(-) клетки путем промывания столбец с 15 мл буфера.
    14. Удалите столбец из магнитного сепаратора и немедленно промыть магнитно помечены CD66b(+) клетки, твердо толкает поршень в столбце.
      Примечание: Популяции клеток CD66b(+) состоит в основном из нейтрофилов определяется анализ СУИМ, показывая, что > 95% CD66(+) фракции являются позитивными для CD11b, CD15 и CD16, но негативные для CD14.
  3. Генерация сеток
    1. После центрифугирования в 270 g x 7 мин на RT, вновь приостановить изолированных LDN (5 x 10-6) в 1 мл раствора RPMI1640 с 10% FCS.
    2. Культура LDN на тарелку с покрытием 6-ну поли L-лизин (6 см в диаметре) за 2 ч при 37 ° c в 5% CO2.
    3. Добавьте Зеленый флуоресцентный изображение (мембраны непроницаемый краситель пятно на ядро и хромосом) в конечной концентрации 5 мкм.
    4. Сразу же наблюдать морфология сеток (внеклеточной ДНК компоненты, изгнаны из LDN под микроскопии флуоресцирования).

2. окрашивание опухолевых клеток с красной флуоресцентной клеток компоновщика краска

  1. Подготовка человеческих раковых клеток линии MKN45, NUGC и OCUM-1.
  2. Вымыть 1 x 107 клеток с PBS + 0,02% ЭДТА в 15 мл трубки и центрифуги на 270 x g 7 мин на RT.
  3. Добавить 1 мл раствора для окраски гранул красителя и Пипетка осторожно.
  4. Распустить 4 мкл люминесцентные клеток компоновщика красного красителя в 1 мл раствора для окрашивания и смешать с суспензию клеток от шаге 2.2.
  5. Инкубировать гранулы для 4 мин на RT.
  6. Добавить 4 мл DMEM (10% FBS) остановить окрашивание реакции.
  7. Центрифуга 270 g x 7 мин и удалить супернатант.
  8. Повторите шаги, 2.6 и 2.7 дважды.
  9. Проверить с флуоресцентным микроскопом (возбуждения = 551 Нм, испуская = 567 Нм) что опухолевые клетки являются пятнами красного.

3. анализ опухоли клеточной адгезии к сеткам

  1. Вновь приостановите красных флуоресцентных окрашенных опухолевых клеток (1 x 10-6) в 1 мл RPMI 1640 с 0,1% BSA.
  2. Добавьте опухолевые клетки LDN культуру, которая производится Нетс, как описано в шаге 1.3.
  3. Инкубируйте 5 минут при 37 ° c, что позволяет опухолевых клеток связаться Нетс.
    Примечание: Длительный инкубационный вызывает опухоли клеточной адгезии LDN или пластины.
  4. Удаление среды и осторожно Промыть лунки, добавив 2 мл подогретую СМИ (0,1% BSA + RPMI 1640) и закрученной блюдо.
  5. Повторите процедуру стиральная в шаге 3.4 дважды.
    Примечание: Поскольку сеток слабо прикрепить к пластине, Стиральная должно быть сделано мягко, как можно избежать удаления самих сетей.
  6. Добавьте зеленый флуоресцентные краски для окрашивания ядра и хромосом в конечной концентрации 5 мкг/мл для визуализации сетей.
  7. Наблюдение за сетями и придает опухолевых клеток, используя соответствующие фильтры (зеленый, возбуждения = 504 нм, испуская = 523 Нм; красный, возбуждения = 551 Нм, испуская = 567 Нм).
  8. Слияние цифры, чтобы показать опухолевых клеток, которые оказались в ловушке в сети.
    Примечание: В некоторых экспериментах, фермент деградации ДНК был добавлен в культуре LDN (конечная концентрация 100 ед/мл) 5 мин до совместного инкубации за 5 мин.

4. время Замедленная съемка видео анализ захваченных опухолевых клеток

  1. Культура перитонеальный LDN в 35 мм круглый блюдо с поли L-лизин, как описано в шаге 1.3 покрытием.
  2. Добавьте зеленый флуоресцентные краски для окрашивания ядра и хромосом для визуализации сетей, как описано в шаге 1.3.
  3. После 1 мин инкубации удалите средства массовой информации и добавить 2 мл 0,1% BSA + RPMI 1640.
  4. Удалите средства массовой информации и добавить что безупречная 1 x 10-6 MKN45 клетки приостановлено в 0,1% BSA + RPMI 1640. Инкубируйте 5 мин на RT.
  5. Удалите все неприсоединенные опухолевых клеток, аккуратно мыть как описано в шаге 3.4 и добавьте DMEM с 10% FCS, дополненная 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 100 мкг/мл.
  6. Маунт культуры блюдо в целом представление ячейки наблюдения системы и выберите соответствующее поле, в котором опухоли клетки попали в сети.
  7. Продолжать совместно культура еще 2 дня и непрерывной фотографировать поля каждые 6 мин под нормальный свет и флуоресценции, который обнаруживает клетки MKN45 и сетки, соответственно.
  8. Наложения изображения на каждом timepoint и построить промежуток времени видео с помощью программы просмотра изображений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В 2-х часовой культуре, CD66b(+) LDN, производные от перитонеальный лаваж жидкости показал строку структуры окрашенных с Грин Люминесцентная краска для ядерной и хромосомы (рис. 1B), при этом мононуклеарных клеток не CD66b(-) (рис. 1 c). Однако, когда LDN культур были предварительно обработанных с 100 ед/мл DNase I, характерная структура была разрушена (рис. 1 d), указав, что они состояли из внеклето...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Предыдущие исследования сообщили, что циркулирующих клеток опухоли могут быть захваченных чистой подложки в естественных условиях10,11. Метастатическим груди раковых клеток было показано для стимуляции нейтрофилов и стимулировать формирование сетей, который помогает в рост опухолевых клеток в целевой органа17. Кроме того мы обнаружили, что краткосрочные культур LDN от послеоперационных промывание жидкости производится массивные се...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Благодарности

Мы благодарим г-жа J. Shinohara и I. Nieda для технического и канцелярской работы. Кроме того мы благодарим Drs. Shiro Мацумото, Hidenori Харута, Кентаро Kurashina и Кадзуя Такахаси за их сотрудничество в целях приобретения образца в операционной комнате. Эта работа была поддержана целевые субсидии для проведения научных исследований от министерства образования, науки, спорта и культуры Японии и японского общества для содействия развитию науки (17K 10606).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare, ШВЕЦИЯ17-1440-02
StraightFrom™ Цельная кровь CD66b МикрогранулыMiltenyi Biotec, Бергиш-Гладбах, Германия130-104-913
Fc-блокMiltenyi Biotec, Бергиш-Гладбах, Германия130-059-901
Раствор для полоскания MACSMiltenyi Biotec, Бергиш-Гладбах, Германия130-091-222
Исходный раствор MACS BSAMiltenyi Biotec, Бергиш-Гладбах, Германия130-091-376
LS ColumnsMiltenyi Biotec, Бергиш Гладбах, Германия130-041-306
Магнитный сепаратор MACSMiltenyi Biotec, Бергиш Гладбах, Германия130-042-501
SYTOX зеленый раствор нуклеиновой кислоты 5 мМ раствор в ДМСОThermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, СШАS7020
PKH26 Красный флуоресцентный набор клеточных линкеров для общего мечения клеточных мембранSigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, СШАP9691
Разбавитель CSigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, СШАCGLDIL
RPMI1640 MediumSigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, СШАR8758
Dulbecco' s Модифицированный Eagle Medium-high glucose (DMEM)Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, СШАD5796
Dulbecco' s Фосфатно-солевой буфер (DPBS)Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, СШАD8537
0,5 моль/л-ЭДТА раствор (pH 8,0)nacalai tesque, Япония06894-14
Фетальная бычья сыворотка, квалифицированная, одобренная Министерством сельского хозяйства США регионыgibco by life technologies, Мексика10437-028
Лиофилизированный порошок лиофилизированного альбумина в бычьей сыворотке, ≥ 96% (электрофорез в агарозном геле)Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, СШАA2153
Пенициллин СтрептомицинLife Technologies Япония15140-122
Плазмоцин профилактическийInvivoGen, Сан-Диего, Калифорния-СШАant-MPP
DNase IWorthington, Lakewood NJ)LS002138
Поли-L-лизиновый покрытый MICROPLATE 6WellIWAKI, Япония4810-040
Микропластина с покрытием из поли-L-лизина 24WellIWAKI, Япония4820-040
флуоресцеиновый стереомикроскопBX8000, Keyence, Осака ЯпонияBZ-X710
Система наблюдения за клетками полного обзораNikon, Канагава, ЯпонияBioStudio (BS-M10)
MKN45 клеточная линия рака желудка человекаRiken, Тукуба ЯпонияН/Д
NUGC-4 клеточная линия рака желудка человекаRiken, Тукуба ЯпонияН/Д
OCUM-1 клеточная линия рака желудка человека OCUM-1Университет города Осака,Япония Н/ДПодарок от доктора М.Ясиро

Ссылки

  1. Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever. Arthritis and Rheumatology. 29 (11), 1334-1342 (1986).
  2. Denny, M. F., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. The Journal of Immunology. 184 (6), 3284-3297 (2010).
  3. Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. The increase of low density subpopulations and CD10 (CALLA) negative neutrophils in severely infected patients. Surgery Today. 22 (4), 322-327 (1992).
  4. Schmielau, J., Finn, O. J. Activated granulocytes and granulocyte-derived hydrogen peroxide are the underlying mechanism of suppression of t-cell function in advanced cancer patients. Cancer Research. 61 (12), 4756-4760 (2001).
  5. Brandau, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties. Journal of Leukocyte Biology. 89 (2), 311-317 (2011).
  6. Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Low-density granulocytes: a distinct class of neutrophils in systemic autoimmunity. Seminars in Immunopathology. 35 (4), 455-463 (2013).
  7. Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).
  8. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  9. Demers, M., et al. Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13076-13081 (2012).
  10. Cools-Lartigue, J., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis. Journal of Clinical Investigation. , (2013).
  11. Tohme, S., et al. Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress. Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).
  12. Monti, M., et al. Integrin-dependent cell adhesion to neutrophil extracellular traps through engagement of fibronectin in neutrophil-like cells. Public Library of Science One. 12 (2), e0171362(2017).
  13. Najmeh, S., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells via beta1-integrin mediated interactions. International Journal of Cancer. 140 (10), 2321-2330 (2017).
  14. Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
  15. Kanamaru, R., et al. Low density neutrophils (LDN) in postoperative abdominal cavity assist the peritoneal recurrence through the production of neutrophil extracellular traps (NETs). Scientific Reports. 8 (1), 632(2018).
  16. Eades-Perner, A. M., Thompson, J., van der Putten, H., Zimmermann, W. Mice transgenic for the human CGM6 gene express its product, the granulocyte marker CD66b, exclusively in granulocytes. Blood. 91 (2), 663-672 (1998).
  17. Park, J., et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps. Science Translational Medicine. 8 (361), 361ra138(2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Itime lapse
Нейтрофильные внеклеточного ловушки, порожденных низкой плотности нейтрофилов получены перитонеальный лаваж жидкости посредником рост опухолевых клеток и вложения
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.