Здесь представлен протокол расследовать раннего воздействия амилоид β (значения) в головном мозге. Это показывает, что значения индуцирует Клатрин опосредованный эндоцитоз и распада аксональное роста шишки. Протокол является полезным при изучении раннего воздействия значения на конусы роста axonal и может способствовать предотвращению болезни Альцгеймера.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Визуализация аксональное роста конуса коллапса и раннего амилоида β эффекты в нейронах культивировали мыши
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Амилоид β (значения) вызывает расстройства памяти в Альцгеймера (AD). Хотя терапии было показано, уменьшить значения уровней в мозгах пациентов AD, они не улучшают функции памяти. Поскольку значения агрегатов в головном мозге до появления нарушениями памяти, ориентации значения может быть неэффективным для лечения больных ад, которые уже проявляют дефицита памяти. Таким образом ниже по течению сигналов из-за значения осаждения должен быть заблокирован до развития AD. Значения индуцирует аксональной дегенерации, ведущие к срыву нейрональных сетей и нарушениями памяти. Хотя существует множество исследований о механизмах значения токсичности, источник значения токсичности остается неизвестным. Чтобы помочь определить источник, мы предлагаем новый протокол, использующий микроскопии, Гене transfection и живой клетки, imaging для исследовать ранние изменения, вызванные значения в конусы роста axonal культивировали нейронов. Этот протокол показало, что значения индуцированной Клатрин опосредованный эндоцитоз в аксональное роста шишки следуют краха конус роста, демонстрируя, что ингибирование эндоцитоза предотвращает значения токсичности. Этот протокол будет полезным при изучении ранних эффектов значения и может привести к более эффективной и профилактическое лечение AD.
Введение
Амилоид β (значения) месторождений находятся в мозге пациентов с болезнью Альцгеймера (AD) и считаются критическим причиной AD1 , нарушить нейрональных сетей, приводит к памяти нарушениями2,,34. Многие клинические наркотиков кандидатов было показано эффективно предотвращать производство амилоид β (значения) или удалить значения месторождений. Однако никто не преуспели в улучшение функции памяти в AD пациентов5. Значения уже сдали на хранение в головном мозге до начала расстройства памяти6; Таким образом у....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами для ухода и использования лабораторных животных на Sugitani кампусе университета Тояма и были утверждены Комитетом для животных ухода и использования лабораторных животных на Sugitani кампусе Университет Тояма (A2014INM-1, A2017INM-1).
1. крах Assay
- Поли-D-лизин покрытие
- Покройте 8-Ну культуры слайды с 400 мкл 5 мкг/мл поли D-Лизин (PDL) фосфат амортизированное saline (PBS) и инкубировать их при 37 ° C на ночь.
- Удаление решения PDL и Промыть лунки 3 раза с дистиллированной водой.
- Нейрон культуры24....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В этом протоколе Aβ1-42 был инкубировали при 37 ° C для 7 дней перед использованием, потому что инкубации Aβ1-42 необходима для производства токсичных форм27,28,30,35. После этого инкубации агрегированной формы значения наблюдались (рис. 1A). Сообщается, что аналогичные инкубации Aβ1-42 производится фибриллярных форме значения
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Наблюдение ранних явлений в конусы аксональное роста после лечения Aβ1-42 включен протокол, описанные в данном исследовании. Aβ1-42 индуцированной эндоцитоза в конусы аксональное роста в течение 20 мин, и крах конус роста наблюдалось в течение 1 ч лечения. Этот эндоцитоза вероятно опосредовано Клатрин. Используя этот протокол, для предотвращения краха конус Aβ1-42-индуцированной роста и аксональной дегенерации в культивированный нейронов27было подтверждено ингибирование Клатрин опосредованный эндо.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Автор не имеет ничего, чтобы раскрыть.
Благодарности
Эта работа частично поддерживается научно-исследовательских грантов от JSP-страницы (KAKENHI 18K 07389), Япония, Такэда научный фонд, Японии и Кобаяси фармацевтическая Co. Ltd., Япония.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| ddY мыши | SLC | ||
| Восьмилуночное культуральное стекло | Falcon | 354108 | |
| поли D лизин | Wako | 168-19041 | |
| Питательная среда, Нейробазальная среда | Gibco | 21103-049 | |
| домашняя сыворотка | Gibco | 26050-088 | |
| глюкоза | Wako | 049-31165 | |
| L-глутамин | Wako | 074-00522 | |
| 0,05% трипсин | Gibco | 25300-054 | |
| DNase I | Worthington | DP | |
| ингибитор соевого трипсина | Gibco | 17075-029 | |
| Фильтр с 70 & микро; м размер ячеек, клеточное сетчатое фильтр | Falcon | 352350 | |
| B-27 добавка | Gibco | 17504-044 | |
| CO2 инкубатор | Astec | SCA-165DS | |
| Amyloid β 1-42 | Sigma-Aldrich | A9810 | |
| параформальдегид | Wako | 162-16065 | |
| сахароза | Wako | 196-00015 | |
| Водный монтажный материал, Aqua-Poly/Mount | polysciences | 18606-20 | |
| Инвертированный микроскоп A | Carl Zeiss | Axio Observer Z1 | Подключается к AxioCam MRm, нагревательному блоку XL S, модулю CO2 S1 и модулю TempModule S1 |
| Объектив План-Апохромат 20x | Carl Zeiss | 420650-9901 | |
| Объектив План-Апохромат 63x | Carl Zeiss | 440762-9904 | |
| Объектив, CFI План Апо Лямбда 40X | Никон | ||
| анти-MAP2 IgG | Abcam | ab32454 | |
| анти-тау-1 IgG | Chemicon | MAB3420 | |
| антиамилоид и бета антитела | IBL | 10379 | клон 11A1 |
| нормальная козья сыворотка | Wako | 143-06561 | |
| бычья сыворотка альбумин | Wako | 010-25783 | |
| t-октилфеноксиполиэтоксиэтанол | Wako | 169-21105 | |
| козий антимышиный IgG конъюгированный с AlexaFluor 594 | Invitrogen | A11032 | |
| козий антикроличьи IgG конъюгированный с AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| Конфорка | NISSIN | NHP-M30N | |
| Крышка стекла | Fisher Scientific | 12-545-85 | |
| 35 мм тарелка | IWAKI | 1000-035 | |
| Силикон | RTV Shin-Etsu | KE42T | |
| ручной перфоратор | Roper Whitney | No. | |
| Флуоресцентный мембранный зонд, FM1-43FX | Invitrogen | F35355 | |
| Ca2+- и Mg2+-free Сбалансированный раствор соли Хэнкса | Gibco | 14175-095 | |
| Трансфекционный раствор, раствор нуклеофлектора | Lonza | VPG-1001 | |
| Электропоратор, Nucleofector I | Amaxa | ||
| Инвертированный микроскоп B | Keyence | BZ-X710 | |
| , ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ |
Ссылки
- Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8 (6), 595-608 (2016).
- Dickson, T. C., Vickers, J. C. The morphological phenotype of beta-amyloid plaques and associated neuritic ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
