Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Создание гомо - и Heterografts между арбуз и бутылка тыквы для изучения холодной отзывчивым микроРНК

7.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58242

⸱

20 ноября 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Vegetables, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, 2State Key Lab Breeding Base for Sustainable Control of Plant Pest and Disease, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, 3Institute of Horticulture, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, 4Shanghai Biozeron Biotechnology Co., Ltd

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем подробный протокол для эффективно гомо - и heterografts между арбуз и бутылка тыквы, помимо методов выборки ткани, генерации данных и анализа данных, для расследования холодной отзывчивым микроРНК.

Аннотация

МикроРНК (интерферирующим) эндогенные малые некодирующих RNAs около 20-24 nt, известно, играют важную роль в развитии растений и адаптации. Существует накапливая доказательства того, что выражения некоторых интерферирующим изменяются при прививке, сельскохозяйственной практики, обычно используется фермерами для улучшения урожая толерантности к биотическим и абиотическим стрессовым. Бутылка тыквы является по своей сути Климат эластичные культур, по сравнению с много других крупных тыквенных, включая арбуз, что делает его одним из наиболее широко используемых Подвои для последнего. Недавнее развитие высокопроизводительного секвенирования технологий предоставляет большие возможности для изучения холодной гибкой адаптивной и их вклад в heterograft преимущества; Тем не менее соответствующие экспериментальные процедуры являются предпосылкой для этой цели. Здесь мы представляем подробный протокол для эффективного создания гомо - и heterografts между холодной чувствительными арбуз и холодной терпимо бутылки тыквы, помимо методов выборки ткани, генерации данных и анализа данных. Представленные методы полезны также для других систем, Прививка растений, допросить Мирна положениям различных экологических стрессов, например тепла, засухи и солености.

Введение

Прививки давно работал как сельскохозяйственной техники для улучшения производства сельскохозяйственных культур и терпимости к биотическим и абиотическим стрессовым1,2,3. В heterografting системах Элитная Подвои может укрепить поглощению воды и питательных веществ растений, усилить сопротивление почвенными патогеннами и ограничить негативные последствия металла токсичности4,5, который может наделять графтов расширение силой роста и повышения терпимости к экологическим стрессам. Во многих случаях heterografting также может повлиять на плод качества в садовых растений, приводит к улучшению фруктовый аромат и повышенное содержание соединений здравоохранения6,7. Было установлено, что дальней передачи фитогормонов, РНК, пептидов и белков между подвоя и scion является основной механизм плавного роста и развития перепрограммирования scion растений8,9 ,10. Прививка широко используется в исследованиях дальнего сигнализации и транспорта по отношению к экологической адаптации11. Прививочных экспериментов особенно сильны для однозначной обнаружения передаваемых молекул в получении ткани или сосудистая sap и активация или подавление молекулярных целей из-за сигнала передачи12.

Non кодирования РНК, большой класс РНК, которые оказывают важные функции регулирования в клетках, поступили играть определенную роль в содействии адаптации растений к абиотическим стрессом13. интерферирующим эндогенные малые некодирующих RNAs около 20-24 nt. исследования показали регулирующей роли интерферирующим в различных аспектах деятельности предприятия, такие как стрелять роста, боковые корень формирования14,,1516, поглощение питательных веществ, сульфат метаболизм и гомеостаза17и ответы к биотическим и абиотическим подчеркнуть18. Недавно выражение адаптивной и их генов-мишеней были связаны с солью стрессу в heterografted огурец саженцы19. В intervariety графтов винограда ответы Мирна выражения к стрессу засухи были найдены в зависимости от генотипа20.

Быстрое развитие и снижение стоимости технологии высокопроизводительного секвенирования предоставили прекрасную возможность для изучения правил микроРНК в агрономической растений. Арбуз (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.), важный cucurbit культур, выращенных в мире, чувствительны к низким температурам. Бутылка тыквы (лагенария siceraria [Молина] (Standl.) является более устойчивыми климата cucurbit обычно используется фермерами для графт с арбузом. Основной целью настоящего исследования является разработать стандарт, эффективный и удобный метод для изготовления heterografts между арбуз (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.) и бутылка тыквы (лагенария siceraria [Молина] Standl). Этот протокол также обеспечивает подробный экспериментальной схемы и аналитических процедур для изучения регуляции Мирна выражений после прививки, что полезно для выявления механизмов лежащих в основе heterografting преимущества.

Завод материалов, используемых в настоящем исследовании включают арбуз сорт и Ландрас бутылка тыквы. Арбуз сорт является коммерческий сорт с высокой урожайностью, но чувствительны к низким температурам. Бутылка тыквы ландрас-это популярный Подвой для прививки с арбузом, огурец и бутылка тыквы, из-за его прекрасную терпимости низких температурах21.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. стерилизация и всхожесть семян

  1. Для поверхности стерилизации Замочите бутылки Тыква семена в 500 мл стакан с водой на 58 ° C, иногда помешивая, до тех пор, пока температура воды снижается до 40 ° C.
  2. Между тем, поставить 3 кг торфа почвы в мешке нейлона и стерилизовать, автоклав на 120 ° C/0.5 МПа для 20 мин.
  3. Держите ванну бутылки Тыква семена для 4-5 h больше не помешивая.
    1. Как только вода достигнет комнатной температуры, сполосните семена 2 x - 3 x с дистиллированной водой.
    2. Слейте лишнюю воду и дать семена прорастают в марлевый мешок на 28 ° C в камере роста в темноте.
    3. После проращивания сеять семена в пластиковые горшки (6 см в диаметре) наполнены стерильный торфяной почве.
  4. Когда сеянцы бутылки Тыква разработали два уплощенных семядоли, повторите шаги 1.1-1.3 с Семена арбуза.
    Примечание: Этот время управления гарантирует совпадение размеров scion и подвое хорошо, для успешной трансплантации.

2. Рассада росту и наращивание

  1. Проращивания в камере роста с циклом темные 16-h света /8-h, сохраняя температуру на 28 ° C в течение дня (свет) и 22 ° C в ночное время (темный). Поливать рассаду, добавляя воду 1 x день в конце дня.
  2. Используйте метод cut прививка22 сделать heterografts когда сеянцы бутылки Тыква (подвой) на одном этапе истина лист и семядоли арбуз (scion) появились (еще не плоский).
    1. Разрезать на 2-3 см ниже двулопастной гипокотиля рассаду арбуз, и листья в верхней части бутылки Тыква саженцев на сайте непосредственно над истинной.
    2. Используйте зубочистку сделать отверстие в верхней части обрезанной бутылки Тыква саженцев. Вставьте подстриженные арбуз саженцев в отверстия бутылки Тыква саженцев сделать heterografts.
  3. Используйте аналогичный метод, представленные в шаге 2.2 сделать homografts.
    Примечание: Гомо - и heterografting комбинаций всегда должно быть сделано одновременно (рис. 1), который, в данном случае, результаты в следующем: арбуз/бутылка тыквы (ВБ, heterograft), арбуз/арбуз (WW, homograft) и /bottle бутылка тыквы Тыква (BB, homograft).

figure-protocol-1
Рисунок 1: Иллюстрация трансплантата комбинаций и привитых растений структур. ВБ = арбуз/бутылка тыквы heterografting; WW = арбуз/арбуз homografting; BB = бутылка тыквы/бутылка тыквы гомо прививка; WB-S = scion листья heterografts арбуз/бутылка тыквы, которые были взяты пробы; WB-R = подвой листья heterografts арбуз/бутылка тыквы, которые были взяты пробы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

3. postgrafting, холодный лечение и отбора проб

  1. Завертывать Привитые саженцы прозрачные полиэтиленовые мешки сохранить относительно высокой влажности и сохранить их для 7 d в экологических условиях 16-h свет/8-h темные циклов, сохраняя температуру на 28 ° C в течение дня (свет) и 22 ° C в течение ночь (темный).
  2. Раскройте прозрачные полиэтиленовые мешки на 7-й день. Пусть растут растения для еще 7-10 дней на тех же условиях.
  3. Здоровых саженцев единообразных делят на две группы, один для холодной лечения (подчеркнуть) и один для элемента управления (не подчеркнул). Для группы управления оставить сеянцы в той же камере роста (на 28 ° C) для дополнительных 48 ч, в то время как для группы подчеркнул холодной, передачи саженцев к камере роста с постоянной температуре 6 ° C, с условиями свет/темно, как описано в шаге 2.1.
  4. Образец листья scion и подвой из графтов (рис. 1). Немедленно заморозить образцы в жидком азоте и хранить их в-70 ° C до использования.

4. Библиотека подготовка и высокопроизводительного секвенирования

  1. Передача замороженных образцов microcentrifuge 2-мл пробирку в жидком азоте.
  2. Добавьте из нержавеющей стальной шарик (5 мм в диаметре) каждая трубка, содержащая тканей.
  3. Однородный ткани в мелкий порошок, с использованием гомогенизатора мельница шарик для 30 s.
  4. Для каждой комбинации прививочных Возьмите равные суммы (0,1 г) землю образца от десять саженцев и смешивать их в 10-мл пластиковых пробирок. Добавьте соответствующее количество guanidium гидрохлорид реагента (Таблица материалов) на основании предложений производителя, соответствующий вес ткани.
    1. Удаление загрязнений геномной ДНК путем добавления РНК бесплатно DNase I-150 ед/мл при 37 ° C в течение 1 ч.
  5. Определение общего количества РНК на микрокапиллярной электрофорез системе для обеспечения целостности РНК номер > 7.0.
    Примечание: RIN > 7.0 обеспечивает высокую целостность образцов РНК.
  6. Подготовьте небольшие библиотеки РНК с помощью коммерческих kit (Таблица материалов) согласно инструкциям производителя. Для запуска, используйте 1 мкг всего РНК на сэмпл.
    1. Оттепель библиотека нормализации реагентов и адаптеры согласно рекомендациям производителя. Перевязать малых РНК с 5 ' и 3 ' адаптеры и элюировать и очистить их. Затем, реверс транскрибировать 5′ и 3' лигируют малых РНК после рекомендации производителя.
    2. Выполняйте амплификации PCR согласно протоколу производителя. Оценить качество и количество cDNA библиотек с помощью системы электрофореза микрокапиллярной.
    3. Загрузить 1 мкл библиотеки РНК на систему электрофореза микрокапиллярной для обеспечения RIN > 7.0.
  7. Последовательности малых РНК библиотек на инструмент высокопроизводительного секвенирования, как описано в других разделах23.

5. Мирна и прогнозирования целевого гена

  1. Для каждой комбинации прививочных используйте открытым исходным кодом UEA Срна верстак версия 2.4-завод24 для удаления некачественных последовательности и обрезать адаптер последовательности из сырья читает. Отменить последовательностей, которые меньше, чем 18 nt или больше, чем 32 nt.
  2. Сравните «чистой» последовательностей высокого качества в базу открытым исходным Rfam 11.0, чтобы распознать и удалить читает рРНК и тРНК, snoRNA, другие промотор.
  3. Выровняйте остальные читает для ведения геномов, с помощью короткого чтения последовательности выравнивание инструмент25. Несоответствие не допускается в этом шаге.
    Примечание: Арбуз «97103» генома Ассамблеи26 был использован для выравнивания с чтением из scion V1 и бутылка тыквы «HZ» генома Ассамблеи V127 был использован для чтения из корневища.
  4. Сравните оставшиеся читает против известных Зрелые интерферирующим открытым исходным miRBase 22,028. Читает, которые гомологичных известных интерферирующим классифицируются как сохраняется адаптивной.
  5. Сравнение последовательности, которые не соответствуют известные Мирна прекурсоров с последовательности генома. MIREAP29 алгоритм используйте для выявления потенциальных Роман интерферирующим параметры по умолчанию.

6. Дифференциальные выражение и онтология гена анализ

  1. Сравните уровни выражения адаптивной, основанный на их чтения графов. интерферирующим с P-значение (точный тест Фишера) < 0,05 и абсолютной журнала2 значение > 2 считаются дифференциально выражаться.
  2. Используйте инструмент (TargetFinder) выбор сайта целевой антисмысловых олигонуклеотидов30 для прогнозирования потенциальных дополнительных mRNAs (Мирна целевых генов) в различной степени выраженной интерферирующим под параметры по умолчанию.
  3. Используйте онтология гена (GO) обогащение аналитического инструмента31 раскрыть Мирна целевых генов онтологии (GO) моделей под P- пороговое значение 0,05 на статистическую значимость.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

figure-results-1
Рисунок 2: фенотипов различных имплантатов при комнатной температуре и холодной подчеркнул условий. () Эта группа показывает гомо - и heterografted саженцев при комнатной температуре как элемент управления. (b) этой панели отображается гомо - и heterografted саженцы после 48 ч холодной лечения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом протоколе мы подробно описал высокоэффективной и воспроизводимый метод, чтобы сделать гомо - и heterografts между арбуз и бутылка тыквы. Этот метод, требующий никакого конкретного оборудования, очень прост в эксплуатации и обычно имеет очень высокую выживаемость приживления. Метод может также использоваться для имплантатов для других тыква, такие как между арбуз, огурцов и тыквы.

Стоит отметить, что относительный размер (лет) подвоя и scion имеет решающее значение для принятия успешных ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать. Малых РНК последовательности данных откладывается в GenBank под номером присоединения SRP136842.

Благодарности

Эта работа была поддержана Фонд национального естественных наук Китая (31772191), исследовательский проект для общественный интерес в провинции Чжэцзян (2017C 32027), ключ науки проект по селекции растений в Чжэцзян (2016C 02051) и национальной программы Поддержка первоклассных молодых специалистов (п).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ТРИзол РеагентИнвитроген15596026
РНК-свободная ДНКаза ITakaraD2270A
Набор для подготовки образцов малой РНК Truseq IlluminaRS-200-0012
2100 BionalyserAgilent5067
ДНК-полимеразаThermo Fisher ScientificF530S
UEA sRNA верстак 2,4-растительная версия  (программное обеспечение)NANAhttp://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/
Rfam 11.0 база данных ( website)NANAhttp://rfam.janelia.org
miRBase 22.0 ( website)NA NAhttp://www.mirbase.org/
MIREAP(software)NANAhttps://sourceforge.net/projects/mireap/
TargetFinder ( программное обеспечение)NANAhttp://targetfinder.org/

Ссылки

  1. Schwarz, D., Rouphael, Y., Colla, G., Venema, J. H. Grafting as a tool to improve tolerance of vegetables to abiotic stresses: Thermal stress, water stress and organic pollutants. Scientia Horticulturae. 127, 162-171 (2010).
  2. Li, Y., et al. Mechanisms of tolerance differences in cucumber seedlings grafted on rootstocks with different tolerance to low temperature and weak light stresses. Turkish Journal of Botany. 39 (4), 606-614 (2015).
  3. Li, C. H., Li, Y. S., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. Dynamic Expression of miRNAs and Their Targets in the Response to Drought Stress of Grafted Cucumber Seedlings. Horticultural Plant Journal. 2 (1), 41-49 (2016).
  4. Rouphael, Y., Cardarelli, M., Colla, G., Rea, E. Yield, mineral composition, water relations, and water use efficiency of grafted mini-watermelon plants under deficit irrigation. HortScience. 43 (3), 730-736 (2008).
  5. Savvas, D., et al. Interactive effects of grafting and manganese supply on growth, yield, and nutrient uptake by tomato. HortScience. 44 (7), 1978-1982 (2009).
  6. Aloni, B., Cohen, R., Karni, L., Aktas, H., Edelstein, M. Hormonal signaling in rootstock-scion interactions. Scientia Horticulturae. 127, 119-126 (2010).
  7. Rouphael, Y., Caradrelli, M., Rea, E., Colla, G. Improving melon and cucumber photosynthetic activity, mineral composition, and growth performance under salinity stress by grafting onto Cucurbita hybrid rootstocks. Photosynthetica. 50 (2), 180-188 (2012).
  8. Louws, F. J., Rivard, C. L., Kubota, C. Grafting fruiting vegetables to manage soilborne pathogens, foliar pathogens, arthropods and weeds. Scientia Horticulturae. 127 (2), 127-146 (2010).
  9. Asins, M. J., et al. Genetic analysis of rootstock-mediated nitrogen (N) uptake and root-to-shoot signalling at contrasting N availabilities in tomato. Plant Science. 263, 94-106 (2017).
  10. Yin, L. K., et al. Role of protective enzymes in tomato rootstocks to resist root knot nematodes. Acta Horticulturae. 1086 (1086), 213-218 (2015).
  11. Gaion, L. A., Carvalho, R. F. Long-Distance Signaling: what grafting has revealed? Journal of Plant Growth Regulation. 37 (2), 694-704 (2018).
  12. Turnbull, C. G. Grafting as a research tool. Plant Developmental Biology. Hennig, L., Köhler, C. , Humana Press. New York City, NY. 11-26 (2010).
  13. Li, C., et al. Grafting-responsive miRNAs in cucumber and pumpkin seedlings identified by high-throughput sequencing at whole genome level. Physiologia Plantarum. 151 (4), 406-422 (2014).
  14. Lakhotia, N., et al. Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing. BMC Plant Biology. 14 (1), 6(2014).
  15. Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Bartel, B. MicroRNAs and their regulatory roles in plants. Annual Review of Plant Biology. 57, 19-53 (2006).
  16. Puzey, J. R., Kramer, E. M. Identification of conserved Aquilegia coerulea microRNAs and their targets. Genetic. 448 (1), 46-56 (2009).
  17. Matthewman, C. A., et al. miR395 is a general component of the sulfate assimilation regulatory network in Arabidopsis. FEBS Letters. 586 (19), 3242-3248 (2012).
  18. Ali, E. M., et al. Transmission of RNA silencing signal through grafting confers virus resistance from transgenically silenced tobacco rootstocks to non-transgenic tomato and tobacco scions. Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology. 25 (3), 245-252 (2016).
  19. Li, Y. S., Li, C. H., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. MicroRNA and target gene responses to salt stress in grafted cucumber seedlings. Acta Physiologiae Plantarum. 38 (2), 1-12 (2016).
  20. Pagliarani, C., et al. The accumulation of miRNAs differentially modulated by drought stress is affected by grafting in grapevine. Plant Physiology. 173 (4), 2180-2195 (2017).
  21. Liu, N., Yang, J. H., Guo, S. G., Xu, Y., Zhang, M. F. Genome-wide identification and comparative analysis of conserved and novel microRNAs in grafted watermelon by high-throughput sequencing. PLoS One. 8 (2), e57359(2013).
  22. Song, G. Development of 2JC-350 automatic grafting machine with cut grafting method for vegetable seedling. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering. 22 (12), 103-106 (2006).
  23. Kumar, D., et al. Uncovering leaf rust responsive miRNAs in wheat (triticum aestivum l.) using high-throughput sequencing and prediction of their targets through degradome analysis. Planta. 245 (1), 1-22 (2016).
  24. Kohli, D., et al. Identification and characterization of wilt and salt stress-responsive microRNAs in chickpea through high-throughput sequencing. PLoS One. 9 (10), e108851(2014).
  25. Salzberg, S. L. Computational challenges in next-generation genomics. International Conference on Scientific and Statistical Database Management. ACM. 2, (2013).
  26. Guo, S. G., et al. The draft genome of watermelon (Citrullus lanatus) and resequencing of 20 diverse accessions. Nature Genetics. 45, 51-58 (2013).
  27. Wang, Y., et al. Gourdbase: a genome-centered multi-omics database for the bottle gourd (lagenaria siceraria), an economically important cucurbit crop. Scientific Reports. 8 (1), 306(2018).
  28. Wang, X. F., Liu, X. S. Systematic Curation of miRBase Annotation Using Integrated Small RNA High-Throughput Sequencing Data for C. elegans and Drosophila. Frontiers in Genetics. 2, 25(2011).
  29. Mireap: MicroRNA discovery by deep sequencing. , Available from: http://sourceforge.net/projects/mireap/ (2008).
  30. Bo, X. C., Wang, S. Q. TargetFinder: a software for antisense oligonucleotide target site selection based on MAST and secondary structures of target mRNA. Bioinformatics. 21 (8), 1401-1402 (2005).
  31. Tang, H., et al. GOATOOLS: Tools for Gene Ontology. , Available from: https://doi.org/10.5281/zenodo.31628 (2015).
  32. Wang, L. P., Li, G. J., Wu, X. H., Xu, P. Comparative proteomic analyses provide novel insights into the effects of grafting wound and hetero-grafting per se on bottle gourd. Scientia Horticulturae. 200 (8), 1-6 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Создание гомо - и Heterografts между арбуз и бутылка тыквы для изучения холодной отзывчивым микроРНК
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.