Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Арбовирусных инфекций как скрининг инструменты для выявления вирусной иммуномодуляторов и принимающих противовирусное факторов

6.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58244

⸱

13 сентября 2018 г.

 ,  , 
1Department of Microbiology, University of Texas Southwestern Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протоколы для идентификации 1) вирус кодировке иммунокорректоров, которые способствуют арбовирусных репликации и 2) эукариотических хост факторы, которые ограничивают арбовирусных репликации. Эти методы на основе флуоресценции и люминесценции позволяют исследователям быстро получить количественные отсчетов арбовирусных репликации в упрощенческой анализов с низкого соотношения сигнал шум.

Аннотация

РНК - интерференции и редактирования на основе платформ скрининг генома широко использовались для выявления принимающей ячейки факторов, ограничивающих репликации вируса. Однако эти экраны обычно проводятся в клетках, которые естественно разрешительной для вирусного возбудителя изучается. Таким образом надежную репликацию вирусов в условиях управления может ограничить динамический диапазон этих экранов. Кроме того эти экраны могут быть не в состоянии легко определить пути сотовой обороны, которые ограничивают репликации вируса, если вирус хорошо адаптированы к хосту и способной противостоять противовирусной защиты. В этой статье мы опишем новую парадигму для изучения взаимодействия вируса хост с помощью экранов, которые центр на естественно неудачной инфекций путем арбовирусов например вирус везикулярного стоматита (ВСВ). Несмотря на виллах возможность реплицировать в широком диапазоне dipteran насекомых и млекопитающих хостов VSV проходит после вступления, неудачная инфекции в различных клеточных линий, полученных из спаривающиеся насекомых, таких как непарного шелкопряда (Lymantria dispar). Однако эти неудачной VSV инфекции можно «спасти» когда принимающей ячейки противовирусной защиты оказываются под угрозой. Мы описываем, как VSV штаммов кодирования удобно репортер генов и ограничительной л dispar клеточных линий может быть сопряжено для установки экранов для идентификации узла факторов в арбовирусных ограничение. Кроме того мы также показывают полезность этих инструментов скрининга в идентификации вирусно закодированные факторов, которые спасти VSV репликации при коинфекции или через внематочная выражения, в том числе закодированные млекопитающих вирусов. Природные ограничения VSV репликации в клетках dispar л обеспечивает высокое соотношение сигнал шум при отборе для условий, которые способствуют VSV спасения, таким образом позволяя использовать упрощенный люминесценции и флуоресценции-на основе анализов для мониторинга изменения в виллах репликации. Эти методологии являются ценными для понимания взаимосвязи между принимающей противовирусное ответы и вирусных иммунной уклонение факторов.

Введение

Способность вируса эффективно реплицировать в конкретный узел регулируется в части наличия принимающей ячейки факторов, поддерживающих вирусный вход и репликации1. Вирус хозяйского диапазона может быть продиктовано способности вируса для счетчика сотовой противовирусной защиты, которые в противном случае будут препятствовать репликации вируса2,3. Это результат этих сложных вирусов хост взаимодействий, которые в конечном итоге решить, будет ли вирус смог завершить свой жизненный цикл в конкретный узел. Учитывая потенциально патогенные последствия для принимающей страны, если наступает вирусной репликации, важно разработать экспериментальные стратегии для дальнейшего нашего понимания ключевых вирус хост взаимодействий, которые могут нарушить баланс между неудачной и продуктивной инфекции. Изучение молекулярных особенности взаимодействия вируса хост будет важную роль в разработке новых и альтернативных противовирусное терапевтических стратегий.

С появлением РНК интерференции (RNAi)4,5 и геном-инструменты для редактирования (например., ТРИФОСФАТЫ-Cas9, цинковый палец nucleases, Таленс)6,7, он стал экспериментально целесообразно изменить выражение клеточных факторов на геном общесистемной весы и исследовать влияние этих изменений на репликацию вируса. Действительно были проведены многочисленные RNAi и геном редактирования на основе-экраны в беспозвоночных и позвоночных принимающих типы клеток, которые имеют обнародовал новые грани вирус хост взаимодействия8,9,10, 11 , 12. Эти экраны обычно используют вирусов кодирования репортеров, таких как Светлячок Люцифераза (Люк) или флуоресцентные белки (например., GFP, DsRed), которые обеспечивают удобные средства количественной оценки экспрессии вирусных генов как индикация для репликации вируса9,12. Эта стратегия позволяет исследователям для идентификации узла факторов, которые либо поощрения или раздражать вирусной репликации, что подтверждается увеличивается или уменьшается, соответственно, в Вирусный репортер сигналов9,12. Однако в подавляющем большинстве случаев, эти экраны были проведены с использованием вирусов, которые хорошо приспособлены к ячейки тип узла, в котором они изучаются. Хотя эта стратегия может быть важно для понимания coevolutionary отношений между вирусных патогенов и их естественной хостов, он создают глубокую озабоченность относительно их использования в раскрытие узла противовирусное факторов. В этих случаях увеличение в вирус репортер сигнал RNAi нокдаун ищется, или инактивации Сотовые фактор, который обычно препятствует репликации вируса. Во-первых если вирус уже способна надежно реплицировать в рассматривается в контрольных условиях клетки-хозяина, динамический диапазон экрана (то есть, способность различать между цветом фона и расширенной вирусный репортер сигналы) может быть ограничено. Во-вторых эта проблема усугубляется ситуаций, в которых вирус хорошо приспособлены к клетки-хозяина и эффективного противодействия принимающей обороны путей, которые ориентированы на экране.

Из-за выше опасения относительно взаимодействия традиционных вирус хост, методы фильтрации мы разработали новую парадигму для изучения вируса хост взаимодействий, которые использовать естественно неудачной арбовирусных инфекций в спаривающиеся насекомых клеток. Эта стратегия является производным от наблюдения, что хорошо изученных человека арбовирусами, виллах, подвергается неудачной инфекции в клетки, полученные от непарного шелкопряда (L. dispar)13. VSV естественно передается dipteran насекомыми (то есть, москитов) млекопитающих узлам и было доказано экспериментально заразить широкий спектр беспозвоночных и позвоночных хозяев в клеточной культуре и в естественных условиях14. 11-КБ отрицательный смысл одноцепочечной РНК Геном VSV кодирует пять субгеномной мРНК, которые каждый переводятся на белки, которые составляют запечатанная вириона. Однако обратный генетических систем VSV позволили создание репликации компетентных штаммов кодирования Люк или флуоресцентных белков, в дополнение к пяти природных VSV гена продуктов15,16,17. Потому что эти белки репортер не включаются в виллах вириона, они обеспечивают удобную индикацию VSV экспрессии генов, которое происходит после вступления. С помощью штаммы виллах кодирования GFP или люк, мы ранее показали что VSV экспрессии генов строго ограничены по вступлении LD652 клеток и что VSV титры не увеличить на 72 часа после инфекции (ХПИ). Напротив коинфекции LD652 клеток с VSV и млекопитающих поксвирусных vaccinia вируса (VACV), приводит к логарифмической увеличение экспрессии генов VSV и титры на этот момент времени. VACV проходит ранние экспрессии генов, репликации ДНК и конце экспрессии генов в LD652 клеток инфекции, но цикл репликации VACV в конечном счете неудачной из-за неполной вириона морфогенеза18. Большой ~ 192 kb ДНК генома VACV кодирует белки > 200, многие из которых отображать иммуномодулирующими свойствами, которые способствуют вирусной репликации через подавление принимающей иммунных реакций19. Таким образом мы предположили, что «спасение» VSV репликации в LD652 клетках, VACV коинфекции вероятно опосредовано VACV иммуномодуляторами, что препятствует л dispar ответы обычно ограничение VSV репликации. В поддержку этого обращения LD652 клеток с принимающей РНК полимеразой II ингибитор актиномицин Д спасает VSV репликации в LD652 клетках, указав, что ответы транскрипции зависимых хост блокировать VSV репликации после вступления13.

Выше наблюдения предполагают, что естественно ограничительный характер LD652 клеток VSV инфекции может обеспечить относительно низких фоновых при отборе для условий, которые повышают репортер VSV-кодированных сигналов (то есть, те, которые препятствуют хост антивирусной защиты). Здесь мы предлагаем методы использования флуоресценции или люк на основе анализов экран для условий, которые облегчают VSV ограничение в спаривающиеся клеток. Во-первых мы показываем, каким образом эти анализы может использоваться для определения факторов вирусно закодированные иммуномодулирующих, которые нарушают VSV ограничение во время экспериментов либо коинфекции или через внематочная выражение кандидат вирусные факторы. В качестве примера мы показываем, как мы использовали эти методы скрининга для выявления кодировке поксвирусных A51R белков как новое семейство иммуномодулирующих факторы спасти VSV репликации в отсутствие других поксвирусных факторы13. Во-вторых мы показываем, как RNAi скрининга в ограничительных инфекции клеток VSV-LD652 может использоваться для напрямую идентифицировать эукариотических хост факторов в арбовирусных ограничение13.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Общие Lymantria dispar (LD652) клеток и культура вирусов

  1. LD652 ячейка культивирования и покрытие
    1. К культуре dispar л-производные LD652 клетки, поддерживать монослоя клеток в рост среднего (Таблица материалов), инкубировали при 27 ° C в нормальной атмосфере. Сохранить клетки в 10 см ткани Культура лечение блюда и проход клетки при достижении 80% confluency.
    2. Пластина, выбить адэрентных клеток LD652 от плиты, закупорить СМИ неоднократно на монослое (эти клетки не требуют trypsinization выбить) и разбавления образца в СМИ роста Приблизительная плотность 1 х 105 кл/мл. Пипетка 1 мл разбавленного культуры/хорошо 24-ну плиты. Семя как минимум три реплицировать скважин/лечения типа для каждой точки времени (максимум восьми лечения/плиты).
    3. Позволяют клеткам урегулировать как минимум на 1 час.
  2. Vaccinia вируса подготовка
    1. Подготовить запасов VACV, усиливают вируса в НеЬа клетки20 или африканских Green Monkey почечной клетки (клетки BSC-1 или BSC-40)20,21,22.
      Примечание: VACV штамм Вестерн Резерв (VACV-WR) хорошо работает в анализов, описанных здесь.
    2. Титруйте VACV штамм через assay металлической пластинкы на BSC-1 или BSC-40 клеток20,22.
      Примечание: Все указали VACV кратности инфекции (МВД) описанные здесь для LD652 клеток инфекции основаны на титры, полученные от налета анализов BSC-40.
  3. Подготовка вирус везикулярного стоматита
    1. Чтобы подготовить VSV запасов, усиливают вируса в ППА клетки23.
    2. Титруйте виллах в assay металлической пластинкы на BSC-40 или ППА клеток монослои13,23.
      Примечание: Все VSV MOIs описано здесь для LD652 клеток инфекции основаны на титры, полученные от налета анализов BSC-40.

2. на основе флуоресценции VSV спасения Assay используя инфекции и клеток

  1. Заполнение и инфекции LD652 клеток
    1. Пластина 40000 LD652 клеток/хорошо 8-Ну палаты.
    2. На основе флуоресценции клеток изображений, используйте штаммы виллах кодирования флуоресцентных белков. Эксперименты, представленные здесь использовать VSV-DsRed17, рекомбинантных VSV штамм, который выражает свободного DsRed белок, который не сливается с любой другой белок VSV.
      Примечание: VSV инфекции LD652 клеток не цитопатического по 96 hpi и, таким образом, смерть клетки не является смешанным фактором при оценке VSV репликации в течение этого периода времени.
    3. Подготовить VSV-DsRed и VACV-FL-ГФП в сыворотке свободных СМИ (УЛП; Таблица материалов) в МВД 1 и 25 соответственно.
      Примечание: VACV-FL-GFP-рекомбинантный штамм VACV, который выражает слияние между Люк и GFP-24. Использование MOI 25 или больше для VACV штаммов гарантирует, что все LD652 клетки являются зараженные13. Если с помощью различных coinfecting вирус, МВД будет иметь эмпирически определяемые пользователем. Каждое лечение инфекции следует создать дубликаты скважин и включают макет инфицированных лечения, в которых только УЛП добавляется к клеткам.
    4. Инкубировать клетки в 0,2 мл посевным материалом для 2 ч при 27 ° C.
    5. Вымойте клетки с 0,5 мл/хорошо роста средств массовой информации.
    6. Инкубировать клетки в 25 мкм красителя жизнеспособность клеток (Таблица материалов) в средствах массовой информации роста за 45 мин при 27 ° C.
    7. Аспирационная СМИ и Промыть лунки 1 x 0.5 мл/хорошо, чтобы удалить излишки красителя.
    8. Сохранить клетки в 0,3 мл/хорошо роста средств массовой информации.
  2. Живой клетки образов
    1. Заранее включите Конфокальный микроскоп 30 мин и загрузить камеры 8-Ну блюдо.
      Примечание: LD652 клетки могут быть образы при комнатной температуре, начиная от 20-25 ° C, но для оптимальных условий, температура в помещении должна быть скорректирована с 27 ° C.
    2. Настройте параметры возбуждения соответствующую/выбросов для каждого белка флуоресцентные маркер для записи образа, а также этап настройки контрастности изображения.
    3. Отрегулируйте интенсивность лазера для каждого канала.
      Примечание: Может потребоваться запуск эксперимента для определения диапазона интенсивностей флуоресцентного сигнала, наблюдается на протяжении времени для использования в последний эксперимент.
    4. С помощью 10 X цель, захватить фазы контраст и флуоресценции изображения каждой хорошо каждые 1 – 5 ч в течение инфекции до желаемого времени точки (например., 48 – 72 ИНН).
      Примечание: Важно захватить несколько полей зрения в каждой скважине точно оценить показатели инфицирования во всем культуры.
  3. Анализ изображений
    1. Использовать программное обеспечение для анализа изображений для анализа автоматизированных изображения флуоресцентных надлежащих каналов (например., 405 нм, 488 нм, 568 Нм).
    2. Чтобы вычислить процент клеток, которые инфицированы, разделите общее количество люминесцентные клеток, указывающее VSV инфекции (например., DsRed положительных клеток для лечения инфекций VSV-DsRed), общее количество жизнеспособных клеток, помечены краситель жизнеспособность клеток для Каждое поле зрения во всех процедур.

3. Общие вирусные инфекции протокол для анализов на основе свечения VSV спасения в LD652 клетках

  1. Подготовка посевным материалом
    1. 30 мин перед инфекцией, оттепель запасы VSV-Люк16 (рекомбинантной VSV напрягаться, что выражает свободного Светлячок Люцифераза белка не сливается с любой другой белок VSV). Если опробование VSV-Люк спасения при коинфекции VACV, также оттепели VACV-WR вирус на льду.
      Примечание: Другие вирусы (кроме VACV-WR) может спасти VSV-Люк при коинфекции, но это будет нужно будет определить эмпирически каждым пользователем.
    2. Подготовьте посевным материалом путем разбавления VSV-люк в наличие или отсутствие VACV-WR в УЛП, таким образом, что мои 10 и 25, соответственно, достигается при добавлении всего посевным материалом объемом 0,2 мл/хорошо.
  2. Заражение клетки
    1. Аспирационная зрелых LD652 СМИ тщательно, чтобы не мешать монослоя и прививать с 0,2 мл вирус/скважины. Это время определяется как 0 ХПИ. Добавление дополнительных скважин, чтобы служить в качестве «МОК инфицированных» отрицательный контроль лечения стерильные УЛП.
    2. Инкубировать клетки в посевным материалом для 2 ч при 27 ° C.
    3. На 2 hpi удалите посевным материалом, аспирации и заменить 1 мл/хорошо LD652 роста средств массовой информации.
    4. Разрешить инфекции приступить 24 – 72 Инн.

4. Люцифераза Assay

  1. Подготовка lysates клетки
    1. Тщательно удалить супернатант и добавьте 1 mL Дульбекко фосфат амортизированное saline (DPBS) / хорошо.
    2. С помощью поршень 1 мл шприц, скрип клетки в DPBS.
    3. Передача клетки пробки microcentrifuge и центрифуги на 400 x g 20 мин при 4 ° C.
    4. Тем временем Подготовьте 1 x разрежения 5 x репортер литического буфера (RLB), в стерильной H2O.
    5. После центрифугирования аспирационная DPBS не нарушая Пелле ячейки.
    6. Ресуспензируйте каждой гранулы в 150 мкл 1 x RLB.
    7. Замораживания оттаивания образцов 1 x с использованием 5-мин инкубации в морозильной камере-80 ° C, после быстрого потепления в ванну водой комнатной температуры. Храните лизатов-80 ° c до готовности для анализа.
  2. Люцифераза пробирного
    1. Оттепель лизатов на льду.
    2. Пипетка 20 мкл lysate в колодец сплошной черный или белый 96-луночных микропланшетов.
    3. Добавьте 100 мкл Реагента assay Люцифераза в каждой скважине.
    4. Сразу же измерения интенсивности света, с помощью люминометра (соответствующие параметры для конкретных luminometers придется эмпирически определяемые пользователем).
  3. Люцифераза пробирного анализа
    1. Нормализовать Лу сигналы для каждого лечения Лу показания, полученные от управления лечения (Представитель результаты). После по меньшей мере три независимые эксперименты, означает, что Лу полученные от каждой группы управления обработки могут быть проанализированы на соответствующих статистических тестов.

5. Immunoblot

  1. Используйте лизатов извлек для анализов люк для SDS-PAGE и последующим immunoblotting, используя соответствующие реагенты и оборудование.

6. титр VSV от LD652 клеточных культур

  1. Пластина LD652 ячеек в зависимости от шага 1.1.
  2. Вирусные заразить клетки согласно шаг 3.
  3. В точках желаемое время соберите supernatants в стерильных microcentrifuge трубы.
  4. Пелле клетки, используя 1000 x g 10 мин при температуре 4 ° C и передачи supernatants новые трубы.
  5. Хранить supernatants-80 ° c или продолжить титрование, assay металлической пластинкы на BSC-40 клеток.
    Примечание: Если титрования VSV от LD652 клеточных культур, которые содержали VACV, рекомендуется добавить средства массовой информации культуры BSC-40 в течение 2 hpi, чтобы предотвратить формирование бляшек на BSC-40 монослои13остаточных частиц VACV цитозин арабинозид 100 мкг/мл (AraC). AraC является ингибитор вирусной ДНК-полимеразы, который блокирует репликацию ДНК VACV25 , но не влияет на виллах репликации.

7. вариации на основе свечения VSV спасти анализов в LD652 клетках: RNAi и плазмиды Transfection экспериментов

  1. Подготовка dsRNA опосредованного системой РНК-интерференции нокдаун вирусной или принимающих стенограммы
    1. Джин специфические праймеры дизайн хвост конце 5' с последовательностью промоутер T7 (TAATACGACTCACTATAGGG), либо целевой coinfecting вируса (например, VACV) или стенограммы л dispar mRNA интереса. Эти грунты следует производить продукт PCR 400 – 600 ВР для эффективного нокдаун, опосредованного системой РНК-интерференции. Смотреть "Гаммон" и др. 13 для последовательностей праймера используется ниже нокдаун VACV или L. dispar стенограммы к малым интерферирующим РНК опосредованной РНК-интерференции в клетках LD652.
      Примечание: L. dispar мРНК, которые стенограммы могут быть определены из опубликованных л dispar транскриптом баз данных26,27,28.
    2. Генерировать ДНК шаблон через RT-PCR (синтез cDNA: 1 цикл 50 ° C за 30 мин.; PCR: 40 циклов 94 ° c 15 s, 50 ° C за 30 s и 68 ° C на 45 s каждый).
    3. Очищайте продукт PCR, используя комплект для очистки ПЦР.
    4. Использование очищенного продукта PCR как шаблон, в пробирке транскрибировать и очистить двуцепочечной ДНК с помощью в vitro транскрипция и очистка kit.
  2. Трансфекция двуцепочечной ДНК или плазмидной ДНК в клетки LD652
    1. Семян 1 х 105 клеток/также плиты 24-Ну и пусть клетки останавливаться на по крайней мере 1 час.
    2. Для каждой скважины, котор нужно transfected разбавляют в 100 мкл УЛП 4 мкл Реагента transfection. Инкубируйте до 15 мин при комнатной температуре. Это могут быть расширены чтобы сделать главный микс для всех transfections должны быть выполнены.
    3. Разбавляют до 1 мкг с 100 мкл УЛП для каждой скважины, котор нужно transfected двуцепочечной ДНК или всего плазмидной ДНК. Инкубируйте до 15 мин при комнатной температуре.
      Примечание: Ранее нашли что трансфекции 1 мкг двуцепочечной ДНК/105 LD652 клеток является достаточным для > 80% нокдаун либо вирусной или принимающих стенограммы13, но dsRNA дозы необходимо для изменения экспериментальный набор ups/условия придется определяться эмпирически.
    4. Сочетают Трансфекция реагента и малым интерферирующим РНК/плазмида ДНК разведений с соотношением 1:1 (например, 100 мкл разбавленного dsRNA смешивается с 100 мкл разбавленного трансфекции реагента) и проинкубируйте втечение 20 мин при комнатной температуре.
    5. Тем временем, Промыть лунки с 1 мл/хорошо УЛП, а затем добавьте 500 мкл УЛП в каждой скважине.
    6. Медленно добавьте трансфекции реагент двуцепочечной ДНК (или плазмидной ДНК) смесь прикапывают в каждой скважине.
    7. Инкубируйте реагент transfection клетки для 5 h.
      1. Для RNAi эксперименты с нокдаун стенограммы, закодированные с coinfecting вирусом (например, VACV), заменить трансфекции реагент после инкубационного периода 5-h трансфекции вирус посевным материалом, содержащие VSV-Люк (с или без VACV или еще один coinfecting вирус) (шаг 3). Впоследствии замените посевным материалом вирус, содержащий VSV-люк с hpi СМИ 2 полный рост. Люк анализов (шаг 4) затем может выполняться на извлеченные лизатов в различные моменты времени, чтобы определить, если нокдаун coinfecting вирус стенограммы приводит к потере VSV-Люк спасения.
      2. Для RNAi экспериментов с участием RNAi л dispar стенограмм Замените смесь трансфекции полный рост средств массовой информации и позволяют нокдаун наступить за 24 ч до инфекции с VSV-Люк (шаг 4). Люк анализов (шаг 4) затем может выполняться на извлеченные лизатов в различные моменты времени для определения, если нокдаун л dispar стенограммы способствует спасению VSV-люк.
      3. Для экспериментов с transfections векторов выражения плазмида, выражая кандидат иммуномодуляторы заменить трансфекции реагента и позволяют выражение протеина за 24 ч до инфекции с VSV-Люк (шаг 4). Люк анализов (шаг 4) затем может выполняться на извлеченные лизатов в различные моменты времени, чтобы определить, если выражение кандидата иммуномодулирующих белков способствует спасению VSV-люк.
        Примечание: Трансфекции условий, описанных здесь, используя 1 мкг/хорошо плазмида ДНК результата в эффективность трансфекции 40 – 60%13.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В качестве примера клеток графических приложений для мониторинга VSV спасения при коинфекции VACV, LD652 клетки были покрытием в камерных блюдо 8-Ну и затем макет зараженных или зараженных с VSV-DsRed (MOI = 1) в наличие или отсутствие VACV-FL-GFP (MOI = 25). Потому что VSV DsRed выражает DsRed как свободный белок и не сливается с структурных белков VSV (рис. 1A), только обнаруживается после инициирует VSV вход и ген выражение. Затем все клетки были помечены ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы описали простой флуоресценции и люминесценция-на основе анализов для условий, которые спасти VSV репликации в ограничительных спаривающиеся клеточных культур. Неудачная инфекции VSV спаривающиеся клеток создает отличное соотношение сигнал шум при опробование для выражения гена VSV. Например, сигналы Лу, обнаруженные в лизатов от одного VSV-Люк инфекций были ~ Гарибова выше, чем в макет инфицированных лизатов, но эти сигналы только изменилась примерно вдвое за 72-h время курс. В отличие от коинфекции VSV-люк с VA...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Д.г. была поддержана финансирование от Юго-Западного медицинского центра Университета штата Техас наделены ученых программы. Авторы благодарят Майкл Уитт (центра науки здоровья университета Теннесси) и Шон Уилан (Гарвардской медицинской школы) за предоставление VSV-DsRed и VSV-люк. Авторы также поблагодарить Гэри Luker (Мичиганского университета медицинской школы) за любезное дар штамма VACV-FL-GFP.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
6-луночные планшеты для тканевых культурCELLTREAT229106
24-луночные тканевые культуральные планшетыCELLTREAT229124
10 см чашки для тканевых культурCorningC430167
Grace' s Среда для насекомыхSigmaG8142
EX-CELL 420Sigma14420C
Фетальная бычья сыворотка - OptimaAtlanta BiologicalsS12450
Питательная среда1:1 смесь Grace's Insect Medium и EX-Cell 420 Serum-Free Medium, также содержащая 1% раствор антибиотика-антимикотика в сыворотке плода крупного рогатого скота
100&раз ;)SigmaA5955
Dulbecco' s Фосфатно-солевой буфер (DPBS)SigmaD8662
Бессывороточная среда (SFM)Thermo Fisher10902096
Цитозин арабинозидSigmaC1768
Реагент для трансфекцииThermo Fisher10362100
Corning cellgro DMSO (диметилсульфоксид)Corning25950CQC
Репортерный буфер для лизиса 5xPromegaE3971
Реагент для анализа люциферазыPromegaE1483
96-луночные микропланшетыCorning3915
Мышиное антитело против FLAGWako014-22383
Антитело к люциферазе кроликаAbcamab21176
Антитело к антиактину мышиSigmaA2066
Мышиный анти-ВСВ Мн/дн/дД-р Джон Коннор (Бостонский университет)
Мышиный анти-VACV I3LН/ДН/ДД-р Дэвид Эванс (Университет Альберты)
8-луночная камерная чашкаLab-Tek II155409
Краситель жизнеспособности клетокThermo FisherC12881
FLUOstar микропланшетный ридерBMG LabtechFLUOstar
Конфокальный микроскопOlympusFV10i-LIV
Программное обеспечение для анализа изображенийOlympusv1.18cellSens программное обеспечение
Eppendorf 5702 вентилируемая центрифугаEppendorf22628102
Odyssey Fc Инфракрасная система визуализацииLi-COR BiosciencesOdyssey Fc
LD652 клеткин/д/дДоктор Бэзил Ариф (Природные ресурсы Канада)
BSC-40 клеткиATCCCRL-2761
BHK клеткиATCCCCL-10
HeLa клеткиATCCCCL-2
BSC-1 клеткиATCCCCL-26
in vitro набор для транскрипции и очисткиThermo FisherAM1626
Набор для очистки ПЦРQiagenNo 28104
( н

Ссылки

  1. Nomaguchi, M., Fujita, M., Miyazaki, Y., Adachi, A. Viral tropism. Frontiers in Microbiology. 3, 281(2012).
  2. Werden, S. J., McFadden, G. The role of cell signaling in poxvirus tropism: the case of the M-T5 host range protein of myxoma virus. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1784 (1), 228-237 (2008).
  3. McFadden, G., Mohamed, M. R., Rahman, M. M., Bartee, E. Cytokine determinants of viral tropism. Nature Reviews: Immunology. 9 (9), 645-655 (2009).
  4. Silva, J. M., et al. Second-generation shRNA libraries covering the mouse and human genomes. Nature Genetics. 37 (11), 1281-1288 (2005).
  5. Moffat, J., et al. A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Cell. 124 (6), 1283-1298 (2006).
  6. Ma, D., Liu, F. Genome Editing and Its Applications in Model Organisms. Genomics Proteomics Bioinformatics. 13 (6), 336-344 (2015).
  7. Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. Delivery technologies for genome editing. Nature Reviews: Drug Discovery. 16 (6), 387-399 (2017).
  8. Hao, L., et al. Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication. Nature. 454 (7206), 890-893 (2008).
  9. Houzet, L., Jeang, K. T. Genome-wide screening using RNA interference to study host factors in viral replication and pathogenesis. Experimental Biology and Medicine. 236 (8), Maywood, NJ. 962-967 (2011).
  10. Marceau, C. D., et al. Genetic dissection of Flaviviridae host factors through genome-scale CRISPR screens. Nature. 535 (7610), 159-163 (2016).
  11. Savidis, G., et al. Identification of Zika Virus and Dengue Virus Dependency Factors using Functional Genomics. Cell Reports. 16 (1), 232-246 (2016).
  12. Panda, D., Cherry, S. Cell-based genomic screening: elucidating virus-host interactions. Current Opinion in Virology. 2 (6), 784-792 (2012).
  13. Gammon, D. B., et al. A single vertebrate DNA virus protein disarms invertebrate immunity to RNA virus infection. Elife. 3, (2014).
  14. Letchworth, G. J., Rodriguez, L. L., Del cbarrera,, J, Vesicular stomatitis. Veterinary Journal. 157 (3), 239-260 (1999).
  15. Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (18), 8388-8392 (1995).
  16. Cureton, D. K., Massol, R. H., Saffarian, S., Kirchhausen, T. L., Whelan, S. P. Vesicular stomatitis virus enters cells through vesicles incompletely coated with clathrin that depend upon actin for internalization. PLoS Pathogens. 5 (4), e1000394(2009).
  17. Duntsch, C. D., et al. Recombinant vesicular stomatitis virus vectors as oncolytic agents in the treatment of high-grade gliomas in an organotypic brain tissue slice-glioma coculture model. Journal of Neurosurgery. 100 (6), 1049-1059 (2004).
  18. Li, Y., Yuan, S., Moyer, R. W. The non-permissive infection of insect (gypsy moth) LD-652 cells by Vaccinia virus. Virology. 248 (1), 74-82 (1998).
  19. Seet, B. T., et al. Poxviruses and immune evasion. Annual Review of Immunology. 21, 377-423 (2003).
  20. Cotter, C. A., Earl, P. L., Wyatt, L. S., Moss, B. Preparation of Cell Cultures and Vaccinia Virus Stocks. Current Protocols in Microbiology. 39, 11-18 (2015).
  21. Andrei, G., et al. Cidofovir resistance in vaccinia virus is linked to diminished virulence in mice. Journal of Virology. 80 (19), 9391-9401 (2006).
  22. Dascher, C., VanSlyke, J. K., Thomas, L., Balch, W. E., Thomas, G. Preparation of recombinant vaccinia virus for expression of small GTPases. Methods in Enzymology. , 174-188 (1995).
  23. Martin, A., Rex, E. A., Ishidate, T., Lin, R., Gammon, D. B. Infection of Caenorhabditis elegans with Vesicular Stomatitis Virus via Microinjection. Bio-Protocol. 7 (22), (2017).
  24. Luker, K. E., Hutchens, M., Schultz, T., Pekosz, A., Luker, G. D. Bioluminescence imaging of vaccinia virus: effects of interferon on viral replication and spread. Virology. 341 (2), 284-300 (2005).
  25. Rozelle, D. K., Filone, C. M., Dower, K., Connor, J. H. Vaccinia reporter viruses for quantifying viral function at all stages of gene expression. Journal of Visualizes Experiments. (87), e51522(2014).
  26. Cao, C., et al. Characterization of the transcriptome of the Asian gypsy moth Lymantria dispar identifies numerous transcripts associated with insecticide resistance. Pesticide Biochemistry and Physiology. 119, 54-61 (2015).
  27. Sparks, M. E., Blackburn, M. B., Kuhar, D., Gundersen-Rindal, D. E. Transcriptome of the Lymantria dispar (gypsy moth) larval midgut in response to infection by Bacillus thuringiensis. PloS One. 8 (5), e61190(2013).
  28. Sparks, M. E., Gundersen-Rindal, D. E. The Lymantria dispar IPLB-Ld652Y cell line transcriptome comprises diverse virus-associated transcripts. Viruses. 3 (11), 2339-2350 (2011).
  29. Lin, G., Li, G., Granados, R. R., Blissard, G. W. Stable cell lines expressing baculovirus P35: resistance to apoptosis and nutrient stress, and increased glycoprotein secretion. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 37 (5), 293-302 (2001).
  30. Li, W. X., et al. Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).
  31. Kanost, M. R., et al. Multifaceted biological insights from a draft genome sequence of the tobacco hornworm moth, Manduca sexta. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 118-147 (2016).
  32. Paixao, E. S., Teixeira, M. G., Rodrigues, L. C. Zika, chikungunya and dengue: the causes and threats of new and re-emerging arboviral diseases. BMJ Global Health. 3, (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Lepidoptera
Арбовирусных инфекций как скрининг инструменты для выявления вирусной иммуномодуляторов и принимающих противовирусное факторов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.