Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Summary

Здесь мы представляем протоколы для идентификации 1) вирус кодировке иммунокорректоров, которые способствуют арбовирусных репликации и 2) эукариотических хост факторы, которые ограничивают арбовирусных репликации. Эти методы на основе флуоресценции и люминесценции позволяют исследователям быстро получить количественные отсчетов арбовирусных репликации в упрощенческой анализов с низкого соотношения сигнал шум.

Abstract

РНК – интерференции и редактирования на основе платформ скрининг генома широко использовались для выявления принимающей ячейки факторов, ограничивающих репликации вируса. Однако эти экраны обычно проводятся в клетках, которые естественно разрешительной для вирусного возбудителя изучается. Таким образом надежную репликацию вирусов в условиях управления может ограничить динамический диапазон этих экранов. Кроме того эти экраны могут быть не в состоянии легко определить пути сотовой обороны, которые ограничивают репликации вируса, если вирус хорошо адаптированы к хосту и способной противостоять противовирусной защиты. В этой статье мы опишем новую парадигму для изучения взаимодействия вируса хост с помощью экранов, которые центр на естественно неудачной инфекций путем арбовирусов например вирус везикулярного стоматита (ВСВ). Несмотря на виллах возможность реплицировать в широком диапазоне dipteran насекомых и млекопитающих хостов VSV проходит после вступления, неудачная инфекции в различных клеточных линий, полученных из спаривающиеся насекомых, таких как непарного шелкопряда (Lymantria dispar). Однако эти неудачной VSV инфекции можно «спасти» когда принимающей ячейки противовирусной защиты оказываются под угрозой. Мы описываем, как VSV штаммов кодирования удобно репортер генов и ограничительной л dispar клеточных линий может быть сопряжено для установки экранов для идентификации узла факторов в арбовирусных ограничение. Кроме того мы также показывают полезность этих инструментов скрининга в идентификации вирусно закодированные факторов, которые спасти VSV репликации при коинфекции или через внематочная выражения, в том числе закодированные млекопитающих вирусов. Природные ограничения VSV репликации в клетках dispar л обеспечивает высокое соотношение сигнал шум при отборе для условий, которые способствуют VSV спасения, таким образом позволяя использовать упрощенный люминесценции и флуоресценции-на основе анализов для мониторинга изменения в виллах репликации. Эти методологии являются ценными для понимания взаимосвязи между принимающей противовирусное ответы и вирусных иммунной уклонение факторов.

Introduction

Способность вируса эффективно реплицировать в конкретный узел регулируется в части наличия принимающей ячейки факторов, поддерживающих вирусный вход и репликации¹. Вирус хозяйского диапазона может быть продиктовано способности вируса для счетчика сотовой противовирусной защиты, которые в противном случае будут препятствовать репликации вируса^2,3. Это результат этих сложных вирусов хост взаимодействий, которые в конечном итоге решить, будет ли вирус смог завершить свой жизненный цикл в конкретный узел. Учитывая потенциально патогенные последствия для принимающей страны, если наступает вирусной репликации, важно разработать экспериментальные стратегии для дальнейшего нашего понимания ключевых вирус хост взаимодействий, которые могут нарушить баланс между неудачной и продуктивной инфекции. Изучение молекулярных особенности взаимодействия вируса хост будет важную роль в разработке новых и альтернативных противовирусное терапевтических стратегий.

С появлением РНК интерференции (RNAi)^4,5 и геном-инструменты для редактирования (например., ТРИФОСФАТЫ-Cas9, цинковый палец nucleases, Таленс)^6,7, он стал экспериментально целесообразно изменить выражение клеточных факторов на геном общесистемной весы и исследовать влияние этих изменений на репликацию вируса. Действительно были проведены многочисленные RNAi и геном редактирования на основе-экраны в беспозвоночных и позвоночных принимающих типы клеток, которые имеют обнародовал новые грани вирус хост взаимодействия^{8,9,10, 11 , 12}. Эти экраны обычно используют вирусов кодирования репортеров, таких как Светлячок Люцифераза (Люк) или флуоресцентные белки (например., GFP, DsRed), которые обеспечивают удобные средства количественной оценки экспрессии вирусных генов как индикация для репликации вируса^9,12. Эта стратегия позволяет исследователям для идентификации узла факторов, которые либо поощрения или раздражать вирусной репликации, что подтверждается увеличивается или уменьшается, соответственно, в Вирусный репортер сигналов^9,12. Однако в подавляющем большинстве случаев, эти экраны были проведены с использованием вирусов, которые хорошо приспособлены к ячейки тип узла, в котором они изучаются. Хотя эта стратегия может быть важно для понимания coevolutionary отношений между вирусных патогенов и их естественной хостов, он создают глубокую озабоченность относительно их использования в раскрытие узла противовирусное факторов. В этих случаях увеличение в вирус репортер сигнал RNAi нокдаун ищется, или инактивации Сотовые фактор, который обычно препятствует репликации вируса. Во-первых если вирус уже способна надежно реплицировать в рассматривается в контрольных условиях клетки-хозяина, динамический диапазон экрана (то есть, способность различать между цветом фона и расширенной вирусный репортер сигналы) может быть ограничено. Во-вторых эта проблема усугубляется ситуаций, в которых вирус хорошо приспособлены к клетки-хозяина и эффективного противодействия принимающей обороны путей, которые ориентированы на экране.

Из-за выше опасения относительно взаимодействия традиционных вирус хост, методы фильтрации мы разработали новую парадигму для изучения вируса хост взаимодействий, которые использовать естественно неудачной арбовирусных инфекций в спаривающиеся насекомых клеток. Эта стратегия является производным от наблюдения, что хорошо изученных человека арбовирусами, виллах, подвергается неудачной инфекции в клетки, полученные от непарного шелкопряда (L. dispar)¹³. VSV естественно передается dipteran насекомыми (то есть, москитов) млекопитающих узлам и было доказано экспериментально заразить широкий спектр беспозвоночных и позвоночных хозяев в клеточной культуре и в естественных условиях¹⁴. 11-КБ отрицательный смысл одноцепочечной РНК Геном VSV кодирует пять субгеномной мРНК, которые каждый переводятся на белки, которые составляют запечатанная вириона. Однако обратный генетических систем VSV позволили создание репликации компетентных штаммов кодирования Люк или флуоресцентных белков, в дополнение к пяти природных VSV гена продуктов^15,16,17. Потому что эти белки репортер не включаются в виллах вириона, они обеспечивают удобную индикацию VSV экспрессии генов, которое происходит после вступления. С помощью штаммы виллах кодирования GFP или люк, мы ранее показали что VSV экспрессии генов строго ограничены по вступлении LD652 клеток и что VSV титры не увеличить на 72 часа после инфекции (ХПИ). Напротив коинфекции LD652 клеток с VSV и млекопитающих поксвирусных vaccinia вируса (VACV), приводит к логарифмической увеличение экспрессии генов VSV и титры на этот момент времени. VACV проходит ранние экспрессии генов, репликации ДНК и конце экспрессии генов в LD652 клеток инфекции, но цикл репликации VACV в конечном счете неудачной из-за неполной вириона морфогенеза¹⁸. Большой ~ 192 kb ДНК генома VACV кодирует белки > 200, многие из которых отображать иммуномодулирующими свойствами, которые способствуют вирусной репликации через подавление принимающей иммунных реакций¹⁹. Таким образом мы предположили, что «спасение» VSV репликации в LD652 клетках, VACV коинфекции вероятно опосредовано VACV иммуномодуляторами, что препятствует л dispar ответы обычно ограничение VSV репликации. В поддержку этого обращения LD652 клеток с принимающей РНК полимеразой II ингибитор актиномицин Д спасает VSV репликации в LD652 клетках, указав, что ответы транскрипции зависимых хост блокировать VSV репликации после вступления¹³.

Выше наблюдения предполагают, что естественно ограничительный характер LD652 клеток VSV инфекции может обеспечить относительно низких фоновых при отборе для условий, которые повышают репортер VSV-кодированных сигналов (то есть, те, которые препятствуют хост антивирусной защиты). Здесь мы предлагаем методы использования флуоресценции или люк на основе анализов экран для условий, которые облегчают VSV ограничение в спаривающиеся клеток. Во-первых мы показываем, каким образом эти анализы может использоваться для определения факторов вирусно закодированные иммуномодулирующих, которые нарушают VSV ограничение во время экспериментов либо коинфекции или через внематочная выражение кандидат вирусные факторы. В качестве примера мы показываем, как мы использовали эти методы скрининга для выявления кодировке поксвирусных A51R белков как новое семейство иммуномодулирующих факторы спасти VSV репликации в отсутствие других поксвирусных факторы¹³. Во-вторых мы показываем, как RNAi скрининга в ограничительных инфекции клеток VSV-LD652 может использоваться для напрямую идентифицировать эукариотических хост факторов в арбовирусных ограничение¹³.

Protocol

1. Общие Lymantria dispar (LD652) клеток и культура вирусов LD652 ячейка культивирования и покрытие К культуре dispar л-производные LD652 клетки, поддерживать монослоя клеток в рост среднего (Таблица материалов), инкубировали при 27 ° C в нормальной атмосфере. Сохранить клетки в 10 см ткани Культура лечение блюда и проход клетки при достижении 80% confluency. Пластина, выбить адэрентных клеток LD652 от плиты, закупорить СМИ неоднократно на монослое (эти клетки не требуют trypsinization выбить) и разбавления образца в СМИ роста Приблизительная плотность 1 х 105 кл/мл. Пипетка 1 мл разбавленного культуры/хорошо 24-ну плиты. Семя как минимум три реплицировать скважин/лечения типа для каждой точки времени (максимум восьми лечения/плиты). Позволяют клеткам урегулировать как минимум на 1 час. Vaccinia вируса подготовка Подготовить запасов VACV, усиливают вируса в НеЬа клетки20 или африканских Green Monkey почечной клетки (клетки BSC-1 или BSC-40)20,21,22.Примечание: VACV штамм Вестерн Резерв (VACV-WR) хорошо работает в анализов, описанных здесь. Титруйте VACV штамм через assay металлической пластинкы на BSC-1 или BSC-40 клеток20,22.Примечание: Все указали VACV кратности инфекции (МВД) описанные здесь для LD652 клеток инфекции основаны на титры, полученные от налета анализов BSC-40. Подготовка вирус везикулярного стоматита Чтобы подготовить VSV запасов, усиливают вируса в ППА клетки23. Титруйте виллах в assay металлической пластинкы на BSC-40 или ППА клеток монослои13,23.Примечание: Все VSV MOIs описано здесь для LD652 клеток инфекции основаны на титры, полученные от налета анализов BSC-40. 2. на основе флуоресценции VSV спасения Assay используя инфекции и клеток Заполнение и инфекции LD652 клеток Пластина 40000 LD652 клеток/хорошо 8-Ну палаты. На основе флуоресценции клеток изображений, используйте штаммы виллах кодирования флуоресцентных белков. Эксперименты, представленные здесь использовать VSV-DsRed17, рекомбинантных VSV штамм, который выражает свободного DsRed белок, который не сливается с любой другой белок VSV.Примечание: VSV инфекции LD652 клеток не цитопатического по 96 hpi и, таким образом, смерть клетки не является смешанным фактором при оценке VSV репликации в течение этого периода времени. Подготовить VSV-DsRed и VACV-FL-ГФП в сыворотке свободных СМИ (УЛП; Таблица материалов) в МВД 1 и 25 соответственно.Примечание: VACV-FL-GFP-рекомбинантный штамм VACV, который выражает слияние между Люк и GFP-24. Использование MOI 25 или больше для VACV штаммов гарантирует, что все LD652 клетки являются зараженные13. Если с помощью различных coinfecting вирус, МВД будет иметь эмпирически определяемые пользователем. Каждое лечение инфекции следует создать дубликаты скважин и включают макет инфицированных лечения, в которых только УЛП добавляется к клеткам. Инкубировать клетки в 0,2 мл посевным материалом для 2 ч при 27 ° C. Вымойте клетки с 0,5 мл/хорошо роста средств массовой информации. Инкубировать клетки в 25 мкм красителя жизнеспособность клеток (Таблица материалов) в средствах массовой информации роста за 45 мин при 27 ° C. Аспирационная СМИ и Промыть лунки 1 x 0.5 мл/хорошо, чтобы удалить излишки красителя. Сохранить клетки в 0,3 мл/хорошо роста средств массовой информации. Живой клетки образов Заранее включите Конфокальный микроскоп 30 мин и загрузить камеры 8-Ну блюдо.Примечание: LD652 клетки могут быть образы при комнатной температуре, начиная от 20-25 ° C, но для оптимальных условий, температура в помещении должна быть скорректирована с 27 ° C. Настройте параметры возбуждения соответствующую/выбросов для каждого белка флуоресцентные маркер для записи образа, а также этап настройки контрастности изображения. Отрегулируйте интенсивность лазера для каждого канала.Примечание: Может потребоваться запуск эксперимента для определения диапазона интенсивностей флуоресцентного сигнала, наблюдается на протяжении времени для использования в последний эксперимент. С помощью 10 X цель, захватить фазы контраст и флуоресценции изображения каждой хорошо каждые 1 – 5 ч в течение инфекции до желаемого времени точки (например., 48 – 72 ИНН).Примечание: Важно захватить несколько полей зрения в каждой скважине точно оценить показатели инфицирования во всем культуры. Анализ изображений Использовать программное обеспечение для анализа изображений для анализа автоматизированных изображения флуоресцентных надлежащих каналов (например., 405 нм, 488 нм, 568 Нм). Чтобы вычислить процент клеток, которые инфицированы, разделите общее количество люминесцентные клеток, указывающее VSV инфекции (например., DsRed положительных клеток для лечения инфекций VSV-DsRed), общее количество жизнеспособных клеток, помечены краситель жизнеспособность клеток для Каждое поле зрения во всех процедур. 3. Общие вирусные инфекции протокол для анализов на основе свечения VSV спасения в LD652 клетках Подготовка посевным материалом 30 мин перед инфекцией, оттепель запасы VSV-Люк16 (рекомбинантной VSV напрягаться, что выражает свободного Светлячок Люцифераза белка не сливается с любой другой белок VSV). Если опробование VSV-Люк спасения при коинфекции VACV, также оттепели VACV-WR вирус на льду.Примечание: Другие вирусы (кроме VACV-WR) может спасти VSV-Люк при коинфекции, но это будет нужно будет определить эмпирически каждым пользователем. Подготовьте посевным материалом путем разбавления VSV-люк в наличие или отсутствие VACV-WR в УЛП, таким образом, что мои 10 и 25, соответственно, достигается при добавлении всего посевным материалом объемом 0,2 мл/хорошо. Заражение клетки Аспирационная зрелых LD652 СМИ тщательно, чтобы не мешать монослоя и прививать с 0,2 мл вирус/скважины. Это время определяется как 0 ХПИ. Добавление дополнительных скважин, чтобы служить в качестве «МОК инфицированных» отрицательный контроль лечения стерильные УЛП. Инкубировать клетки в посевным материалом для 2 ч при 27 ° C. На 2 hpi удалите посевным материалом, аспирации и заменить 1 мл/хорошо LD652 роста средств массовой информации. Разрешить инфекции приступить 24 – 72 Инн. 4. Люцифераза Assay Подготовка lysates клетки Тщательно удалить супернатант и добавьте 1 mL Дульбекко фосфат амортизированное saline (DPBS) / хорошо. С помощью поршень 1 мл шприц, скрип клетки в DPBS. Передача клетки пробки microcentrifuge и центрифуги на 400 x g 20 мин при 4 ° C. Тем временем Подготовьте 1 x разрежения 5 x репортер литического буфера (RLB), в стерильной H2O. После центрифугирования аспирационная DPBS не нарушая Пелле ячейки. Ресуспензируйте каждой гранулы в 150 мкл 1 x RLB. Замораживания оттаивания образцов 1 x с использованием 5-мин инкубации в морозильной камере-80 ° C, после быстрого потепления в ванну водой комнатной температуры. Храните лизатов-80 ° c до готовности для анализа. Люцифераза пробирного Оттепель лизатов на льду. Пипетка 20 мкл lysate в колодец сплошной черный или белый 96-луночных микропланшетов. Добавьте 100 мкл Реагента assay Люцифераза в каждой скважине. Сразу же измерения интенсивности света, с помощью люминометра (соответствующие параметры для конкретных luminometers придется эмпирически определяемые пользователем). Люцифераза пробирного анализа Нормализовать Лу сигналы для каждого лечения Лу показания, полученные от управления лечения (Представитель результаты). После по меньшей мере три независимые эксперименты, означает, что Лу полученные от каждой группы управления обработки могут быть проанализированы на соответствующих статистических тестов. 5. Immunoblot Используйте лизатов извлек для анализов люк для SDS-PAGE и последующим immunoblotting, используя соответствующие реагенты и оборудование. 6. титр VSV от LD652 клеточных культур Пластина LD652 ячеек в зависимости от шага 1.1. Вирусные заразить клетки согласно шаг 3. В точках желаемое время соберите supernatants в стерильных microcentrifuge трубы. Пелле клетки, используя 1000 x g 10 мин при температуре 4 ° C и передачи supernatants новые трубы. Хранить supernatants-80 ° c или продолжить титрование, assay металлической пластинкы на BSC-40 клеток.Примечание: Если титрования VSV от LD652 клеточных культур, которые содержали VACV, рекомендуется добавить средства массовой информации культуры BSC-40 в течение 2 hpi, чтобы предотвратить формирование бляшек на BSC-40 монослои13остаточных частиц VACV цитозин арабинозид 100 мкг/мл (AraC). AraC является ингибитор вирусной ДНК-полимеразы, который блокирует репликацию ДНК VACV25 , но не влияет на виллах репликации. 7. вариации на основе свечения VSV спасти анализов в LD652 клетках: RNAi и плазмиды Transfection экспериментов Подготовка dsRNA опосредованного системой РНК-интерференции нокдаун вирусной или принимающих стенограммы Джин специфические праймеры дизайн хвост конце 5′ с последовательностью промоутер T7 (TAATACGACTCACTATAGGG), либо целевой coinfecting вируса (например, VACV) или стенограммы л dispar mRNA интереса. Эти грунты следует производить продукт PCR 400 – 600 ВР для эффективного нокдаун, опосредованного системой РНК-интерференции. Смотреть “Гаммон” и др. 13 для последовательностей праймера используется ниже нокдаун VACV или L. dispar стенограммы к малым интерферирующим РНК опосредованной РНК-интерференции в клетках LD652.Примечание: L. dispar мРНК, которые стенограммы могут быть определены из опубликованных л dispar транскриптом баз данных26,27,28. Генерировать ДНК шаблон через RT-PCR (синтез cDNA: 1 цикл 50 ° C за 30 мин.; PCR: 40 циклов 94 ° c 15 s, 50 ° C за 30 s и 68 ° C на 45 s каждый). Очищайте продукт PCR, используя комплект для очистки ПЦР. Использование очищенного продукта PCR как шаблон, в пробирке транскрибировать и очистить двуцепочечной ДНК с помощью в vitro транскрипция и очистка kit. Трансфекция двуцепочечной ДНК или плазмидной ДНК в клетки LD652 Семян 1 х 105 клеток/также плиты 24-Ну и пусть клетки останавливаться на по крайней мере 1 час. Для каждой скважины, котор нужно transfected разбавляют в 100 мкл УЛП 4 мкл Реагента transfection. Инкубируйте до 15 мин при комнатной температуре. Это могут быть расширены чтобы сделать главный микс для всех transfections должны быть выполнены. Разбавляют до 1 мкг с 100 мкл УЛП для каждой скважины, котор нужно transfected двуцепочечной ДНК или всего плазмидной ДНК. Инкубируйте до 15 мин при комнатной температуре.Примечание: Ранее нашли что трансфекции 1 мкг двуцепочечной ДНК/105 LD652 клеток является достаточным для > 80% нокдаун либо вирусной или принимающих стенограммы13, но dsRNA дозы необходимо для изменения экспериментальный набор ups/условия придется определяться эмпирически. Сочетают Трансфекция реагента и малым интерферирующим РНК/плазмида ДНК разведений с соотношением 1:1 (например, 100 мкл разбавленного dsRNA смешивается с 100 мкл разбавленного трансфекции реагента) и проинкубируйте втечение 20 мин при комнатной температуре. Тем временем, Промыть лунки с 1 мл/хорошо УЛП, а затем добавьте 500 мкл УЛП в каждой скважине. Медленно добавьте трансфекции реагент двуцепочечной ДНК (или плазмидной ДНК) смесь прикапывают в каждой скважине. Инкубируйте реагент transfection клетки для 5 h. Для RNAi эксперименты с нокдаун стенограммы, закодированные с coinfecting вирусом (например, VACV), заменить трансфекции реагент после инкубационного периода 5-h трансфекции вирус посевным материалом, содержащие VSV-Люк (с или без VACV или еще один coinfecting вирус) (шаг 3). Впоследствии замените посевным материалом вирус, содержащий VSV-люк с hpi СМИ 2 полный рост. Люк анализов (шаг 4) затем может выполняться на извлеченные лизатов в различные моменты времени, чтобы определить, если нокдаун coinfecting вирус стенограммы приводит к потере VSV-Люк спасения. Для RNAi экспериментов с участием RNAi л dispar стенограмм Замените смесь трансфекции полный рост средств массовой информации и позволяют нокдаун наступить за 24 ч до инфекции с VSV-Люк (шаг 4). Люк анализов (шаг 4) затем может выполняться на извлеченные лизатов в различные моменты времени для определения, если нокдаун л dispar стенограммы способствует спасению VSV-люк. Для экспериментов с transfections векторов выражения плазмида, выражая кандидат иммуномодуляторы заменить трансфекции реагента и позволяют выражение протеина за 24 ч до инфекции с VSV-Люк (шаг 4). Люк анализов (шаг 4) затем может выполняться на извлеченные лизатов в различные моменты времени, чтобы определить, если выражение кандидата иммуномодулирующих белков способствует спасению VSV-люк.Примечание: Трансфекции условий, описанных здесь, используя 1 мкг/хорошо плазмида ДНК результата в эффективность трансфекции 40 – 60.

Representative Results

В качестве примера клеток графических приложений для мониторинга VSV спасения при коинфекции VACV, LD652 клетки были покрытием в камерных блюдо 8-Ну и затем макет зараженных или зараженных с VSV-DsRed (MOI = 1) в наличие или отсутствие VACV-FL-GFP (MOI = 25). Потому что VSV DsRed выражает DsRed как св…

Discussion

Здесь мы описали простой флуоресценции и люминесценция-на основе анализов для условий, которые спасти VSV репликации в ограничительных спаривающиеся клеточных культур. Неудачная инфекции VSV спаривающиеся клеток создает отличное соотношение сигнал шум при опробование для выражения ге?…

Materials

6-well tissue culture plates	CELLTREAT	229106
24-well tissue culture plates	CELLTREAT	229124
10 cm tissue culture dishes	Corning	C430167
Grace’s Insect Medium	Sigma	G8142
EX-CELL 420	Sigma	14420C
Fetal Bovine Serum – Optima	Atlanta Biologicals	S12450
Growth medium			1:1 mixture of Grace's Insect Medium and EX-Cell 420 Serum-Free Medium also containing 1 % antibiotic-antimycotic solution and 10 % Fetal bovine serum
Antibiotic-Antimycotic Solution (100×)	Sigma	A5955
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Sigma	D8662
Serum Free Media (SFM)	Thermo Fisher	10902096
Cytosine arabinoside	Sigma	C1768
Transfection reagent	Thermo Fisher	10362100
Corning cellgro DMSO (Dimethyl Sulfoxide)	Corning	25950CQC
Reporter lysis buffer 5X	Promega	E3971
Luciferase Assay Reagent	Promega	E1483
96-Well Microplates	Corning	3915
Mouse anti-FLAG antibody	Wako	014-22383
Rabbit anti-firefly luciferase antibody	Abcam	ab21176
Mouse anti-actin antibody	Sigma	A2066
Mouse anti-VSV M	N/A	N/A	Dr. John Connor (Boston University)
Mouse anti-VACV I3L	N/A	N/A	Dr. David Evans (University of Alberta)
8-well Chambered dish	Lab-Tek II	155409
Cell viability dye	Thermo Fisher	C12881
FLUOstar microplate reader	BMG Labtech	FLUOstar
Confocal microscope	Olympus	FV10i-LIV
Image analysis software	Olympus	v1.18	cellSens software
Eppendorf 5702 ventilated centrifuge	Eppendorf	22628102
Odyssey Fc Infrared Imaging System	Li-COR Biosciences	Odyssey Fc
LD652 cells	N/A	N/A	Dr. Basil Arif (Natural Resources Canada)
BSC-40 cells	ATCC	CRL-2761
BHK cells	ATCC	CCL-10
HeLa cells	ATCC	CCL-2
BSC-1 cells	ATCC	CCL-26
in vitro transcription and purification kit	Thermo Fisher	AM1626
PCR purification kit	Qiagen	28104