Method Article

Физическая характеристика однометаллических наночастиц высокого разрешения

DOI:

10.3791/58257

⸱

June 28th, 2019

 ,  ,  , 
1Physical Measurement Laboratory, National Institute of Standards and Technology, 2Department of Chemical Engineering, Columbia University, 3Department of Applied Physics and Applied Math, Columbia University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол для обнаружения дискретных металлических кислородных кластеров, полиоксометалатов (POMs), на пределе одной молекулы с помощью биологической нанопорной электронной платформы. Метод обеспечивает дополнительный подход к традиционным аналитическим химии инструментов, используемых в изучении этих молекул.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Отдельные молекулы могут быть обнаружены и охарактеризованы путем измерения степени, с помощью которой они уменьшают ионный ток, протекающий через одну нанометровую пору. Сигнал характерен для физико-химических свойств молекулы и ее взаимодействия с порами. Мы демонстрируем, что нанопор, образованный бактериальным белком экзотоксина staphylococcus aureus alpha hemolysin (ЗХЛ), может обнаруживать полиоксометалаты (POMs, анионические металлические кислородные кластеры) на пределе одной молекулы. Кроме того, одновременно измеряются множественные продукты деградации 12-фосфоунгстовой кислоты POM (PTA, H3PW12O40) в растворе. Чувствительность одной молекулы метода нанопор позволяет охарактеризовать POMs при значительно более низких концентрациях, чем требуется для ядерной магнитно-резонансной (ЯМР) спектроскопии. Этот метод может служить новым инструментом для химиков для изучения молекулярных свойств полиоксометалатов или других металлических кластеров, чтобы лучше понять POM синтетических процессов, и, возможно, улучшить их урожайность. Гипотетически, расположение данного атома, или вращение фрагмента в молекуле, и состояние окисления металла может быть исследовано с помощью этого метода. Кроме того, эта новая методика имеет то преимущество, что позволяет в режиме реального времени контролировать молекулы в растворе.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Обнаружение биомолекулярных анализов на уровне одной молекулы может быть выполнено с помощью нанопор и измерения ионных модуляций тока. Как правило, нанопоры делятся на две категории в зависимости от их изготовления: биологические (самособранные из белка или ДНК оригами)1,2,3, или твердотельные(например,изготовленные с полупроводниковые инструменты обработки)4,5. В то время как твердотельные нанопоры были предложены как потенциально более физически надежные и могут быть использованы в широком диапазоне условий раствора, белковые нанопоры до сих пор предлагают большую чувствительность, большую устойчивость к загрязнению, большую пропускную способность, лучшую химическую избирательности и большего соотношения сигнала к шуму.

Разнообразие белковых ионных каналов, таких как те, которые образуются золотистым стафилококком,гемолизин (ЗГл), могут быть использованы для обнаружения одиночных молекул, в том числе ионов (например, Hи D)2,3, полинуклеотиды (ДНК и РНК)6,7,8, поврежденная ДНК9, полипептиды10, белки (сложенные и развернутые)11, полимеры (полиэтиленгликоль и др.)12,13 , 14, золотые наночастицы15,16,17,18,19,и другие синтетические молекулы20.

Недавно мы продемонстрировали, что нанопоры ЗХЛ могут также легко обнаруживать и характеризовать металлические кластеры, полиоксометалаты (POMs), на уровне одной молекулы. POMs являются дискретными наномасштабных кислородных кластеров, которые были обнаружены в 182621, и с тех пор, многие другие типы были синтезированы. Различные размеры, структуры и элементарные композиции полиоксометалатов, которые теперь доступны привело к широкому спектру свойств и приложений, включая химию22,23, катализ24, материаловедение25 ,26, и биомедицинских исследований27,28,29.

Синтез POM представляет собой процесс самосборки, обычно осуществляемый в воде путем смешивания стойхиометрически требуемого количества мономерных металлических солей. После образования, POMs обладают большим разнообразием размеров и форм. Например, структура полианиона Keggin, XM12O40q- состоит из одного гетероатома (X) окруженного четырьмя кислородами для формирования тетраэдра (q является зарядом). Гетероатом расположен в центральной части клетки, образованной 12 октахедральными MO6 единицами (где M й переходных металлов в их высоком состоянии окисления), которые связаны друг с другом соседними общими атомами кислорода. В то время как вольфрама polyoxometalates структура стабильна в кислых условиях, гидроксидидные ионы приводят к гидролитической расщепления металл-кислород (М-О) облигаций30. Этот сложный процесс приводит к потере одного или нескольких OCTahedral подразделений MO 6, что приводит к образованию моносвободных и трехобезбынных видов и в конечном итоге к полному разложению POMs. Наше обсуждение здесь будет ограничено продуктами частичного разложения 12-фосфоунгстовой кислоты при рН 5,5 и 7,5.

Целью этого протокола является обнаружение дискретных металлических кислородных кластеров на пределе одной молекулы с помощью биологической электронной платформы нанопор. Этот метод позволяет обнаруживать металлические кластеры в растворе. Несколько видов в растворе можно дискриминировать с большей чувствительностью, чем обычные аналитические методы33. С его помощью можно выяснить тонкие различия в структуре POM, причем при концентрациях заметно ниже, чем для спектроскопии ЯМР. Важно отметить, что такой подход даже позволяет дискриминации изомерных форм Na8HPW9O341.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: Протокол ниже специфичен для системы Нанопатч DC Electronic BioSciences (EBS). Тем не менее, он может быть легко адаптирован к другим электрофизиологическим аппаратом, используемым для измерения тока через планарные липидные двухслойные мембраны (стандартная липидная двухслойная мембранная камера, геометрия U-трубки, вытянутые микрокапилляры и т.д.). Для описания экспериментальных результатов дается определение коммерческих материалов и их источников. Ни в коем случае эта идентификация не подразумевает рекомендации Национального института стандартов и технологий, равно как и не означает, что материалы являются наилучшими доступными.

1. Решение и подготовка к аналитам

  1. Подготовьте все электролитные растворы с 18 МЗ-см воды из системы очистки воды типа-1, чтобы удалить следы органических видов, а затем фильтровать все электролитные растворы через вакуумный фильтр 0,22 мкм непосредственно перед записью ионного канала.
    Примечание: Качество воды является критическим фактором для стабильности и долговечности мембранной нанопорной системы.
  2. Дикий тип ХЛ.
    1. Следуйте мерам предосторожности MSDS при обращении с токсином «HL».
    2. Смешайте лиофилизированный мономерный s. aureus S. aureus s-Hemolysin (HL) с 18 МЗ-см воды при 1 мг/мл. Распределите от 10 до 30 аликотов образца в криобезопасные центрифуги, быстро заморозьте жидкий азот, а затем храните при -80 градусов по Цельсию. Кроме того, используйте очищенную очищенную гептамерику NoHL 31.
  3. Растворите липид 1,2-Diphytanoyl-sn-Glycero-3-Фосфохолин (DPhyPC) до 0,2 мг/мл в n-декан в 4 мл стеклянной сцинтилляции флакон с политетрафторороэтиленефлефлоновы крышкой. Храните раствор при 4 градусах Цельсия для повторного использования в течение одного месяца.
  4. Подготовка фосхотунгстовой кислоты решений.
    1. Следуйте мерам предосторожности MSDS при обработке фосфотунгстовкислотного порошка и подготовить 2 ММ фосфотунгстовой кислоты бульон решение путем растворения 57,6 мг H3PW12O40 в 10 мл 1 M NaCl и 10 мм2PO4 решение, которое представляет собой акционерное решение.
    2. Возьмите 5 мл этого раствора и отрегулируйте рН до 5,5 с 3 М НаОХ. Отрегулируйте рН других 5 мл на складе раствора до 7,5 с 3 M NaOH.
      Примечание: При рН 5,5, 12-фосхотунгстовой кислоты(PTA, H3PW12O40) разлагается в первую очередь в моносвободный анион No PW11O39.

2. Сборка клеток испытаний

  1. Соберите тестовую ячейку в инструкции производителя.
  2. Замочите один Ag / AgCl провода в отбеливатель (гипохлорит натрия) в течение 10 минут после abrading его с 600 песка наждачной бумагой. Расположите электрод внутри кварцевой нанопоровой мембраны (ЗНМ).
  3. Поместите цилиндрический электрод гранул AgCl, встроенный в серебряную проволоку за пределами ЗНМ.
  4. После настройки тестовой ячейки включите программу питания и сбора данных. Убедитесь, что текущее значение постоянного тока составляет 0 pA при отсутствии раствора в тестовой ячейке.
  5. Используйте шприц, подключенный к испытательной ячейке через линию жидкости, чтобы добавить буферизированный электролитный раствор над лицом ЗНМ и убедиться, что ионный ток насыщает усилитель. В противном случае зНМ может быть засорен. Принесите почтовое напряжение (1 В) и/или давление, превышающее 300 мм рт. ст., чтобы очистить его. Если это работает, уменьшить напряжение и давление.

3. Формирование Липид-Би-Си

  1. Заполните раствор в испытательной ячейке так, чтобы уровень раствора был значительно выше лица ЗНМ. Затем опустите уровень раствора через шприц до уровня ниже лица, так что ток снизится до нуля.
  2. Опустите наконечник пипетки в липидный флакон. Нажмите на заднюю часть кончика пипетки и нажмите его на стороне флакона, чтобы удалить все видимые липиды.
  3. Коснитесь наконечника пипетки на интерфейс еде в испытательной ячейке, когда уровень раствора находится выше лица ЗНМ, и подождите две-пять минут, пока липид равномерно распределится.
  4. Медленно опустите уровень раствора ниже лица ЗНМ до тех пор, пока ток не насытится, а затем медленно поднимите уровень раствора мимо лица ЗНМ, образуя липидную двухслойную мембрану.
    1. Как только образуется двухслойный(т.е. когда ток идет к нулю), попробуйте выталкивать его несколько раз, увеличивая давление и гарантируя, что ЗНМ не засоряется. Чтобы реформировать липидную двухслойную мембрану, опустите уровень раствора ниже лица ЗНМ и медленно поднимите его.
  5. Если липидная двухслойная мембрана не образулась в первый раз, опустите раствор ниже лица и поднимите его снова. Если он не образуется после 3 испытаний, добавить больше липидов, как описано в 3,2 и 3,3.
  6. После формирования мембраны установите ток смещения до нуля, когда прикладной потенциал равен нулю.

4. -Формирование ПО HL

  1. Добавьте 2,5 нг очищенного предварительно сформированного образца гептамеического белка HL (или 250 нг мономерного зХЛ) в тестовую ячейку (объем 200 л), чтобы обеспечить образование канала.
  2. Увеличьте давление на двухслойный с газонепроницаемым шприцем(рисунок 1) после образования двухслойного, чтобы расширить мембрану от ЗНМ и облегчить вставку нанопор. Поднимите прикладное давление спины обычно от 40 до 200 мм рт. с.
    Примечание: Программное обеспечение ЭБШ имеет функцию автоматической вставки, которая применяет более высокую предвзятость (обычно от 200 до 400 мВ), чтобы вызвать образование пор, а затем автоматически снижает желаемое напряжение до смещения измерения, как только формируется один канал.
  3. После формы нанопор, уменьшить давление спины примерно до 1/2 от давления вставки. Если наблюдается несколько каналов, удалите их, значительно снизив давление.

5. Металлическая кластерная разделация в нанопоре

  1. Для учета дисбаланса электродов установите смещенное напряжение ПОСТОЯННОГО КД, которое при нулевом прикладном потенциале не будет измеренным током.
  2. Перед добавлением образца POM, выполнить контрольный эксперимент, чтобыубедиться, что нет загрязняющих веществ (например, след POMs из предыдущего эксперимента) в резервуаре. В частности, приобрести ионный текущий след под прикладным потенциалом от 120 мВдок до -120 мВ в отсутствие каких-либо POMs, чтобы убедиться, что нет спонтанных текущих блокад.
    Примечание: Из-за асимметричной структуры канала ЗХЛ(рисунок1), магнит ионный ток будет отличаться для положительных и отрицательных прикладных потенциалов. Соотношение измеренного тока выше этого прикладного напряжения свидетельствует о ориентации нанопоры HLв мембране.
  3. Добавьте образец POM, промыв резервуар металлическим кластерным раствором при концентрации от 1 до 5 мм. Кроме того, загрузите образец в капилляр до сборки клеток, чтобы изучить раздел POM на другой конец канала ЗХЛ.
  4. Запись ионного тока с помощью программного обеспечения производителя для обнаружения переходных токовых блокад, вызванных разделом отдельных POMs в нанопор. Оцените физические и химические свойства молекулы из ионной текущей глубины блокады, частоты событий и распределения времени проживания блокад.

6. Записи ионных каналов и анализ данных

  1. Приобретайте измерения ионных текущих временных рядов с использованием высокоскоростного усилителя, низкошумного усилителя и системы сбора данных. Выполняйте измерения при прикладном напряжении -120 мВ (относительно стороны канала цис) для каждого рН.
  2. Нанесите на сигнал фильтр с низким проходом 100 кГц 8-полюсный Бессель, который впоследствии оцифровывается на уровне 500 кГц(т.е. 2 м/с)..). Извлекайте события из временных рядов и анализируйте события с помощью алгоритма ADEPT в пакете программного обеспечения MOSAIC 32,33.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

За последние два десятилетия, мембраны связаны белка нанометрового поры были продемонстрированы в качестве универсальных одномолекулярных датчиков. Измерения на основе Nanopore относительно просты в выполнении.  Две камеры, наполненные раствором электролита, разделены нанопором, встроенным в электрически изоляционную липидную мембрану. Либо усилитель патч-зажима, либо внешний источник питания обеспечивает электростатический потенциал через нанопор через электроды Ag/AgCl, погруже...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Из-за их анионического заряда, POMs, вероятно, ассоциируются с органическими противокоестьми через электростатические взаимодействия. Поэтому важно определить надлежащие условия решения и правильные условия электролита (особенно катионы в растворе), чтобы избежать сложного образования с ПОМОЩЬю POMs. Особый удовечно требуется при выборе буфера. Например, скорость улавливания POMs с трис (гидроксиметил)аминометана и лимоно-буферных растворов значительно ниже, чем в фосфатных буферных решений, вероятно, потому, что любой и...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарны за финансовую поддержку со стороны Европейской организации молекулярной биологии для постдокторской стипендии (для J.E.) и гранта от NIH NHGRI (j.J.K.). Мы признательны профессорам Цзинюэ Цзю и Сергею Калачикову (Колумбийский университет) за предоставление гептамической зХЛ, а также за вдохновляющие дискуссии с профессором Джозефом Райнером (Университет Содружества Вирджинии).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Nanopatch DC System ElectronicBiosciences, Inc., EBS
Millipore LC-PAKMillipore вакуумный фильтр
1,2-дифитаноил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DPhPC)Avanti Polar Lipids, алебастр, AL850356P
Decane, ReagentPlus, ≥ 99%,Sigma-AldrichD901
α HLList Биологические лаборатории, Кэмпбелл, Калифорния
Ag проволокаAlfa Aesar
2 мм Ag/AgCl дисковый электродIn Vivo MetricE202
Высокоомная усилительная системаElectronic Biosciences, Сан-Диего, Калифорния
кварцевые капилляры
на заказ поликарбонатная тестовая ячейка
Обработка и анализ данных MOSAIChttps://pages.nist.gov/mosaic/
Гидрат фосфовольфрамовой кислотыSigma-Aldrich455970
Хлорид натрияSigma-AldrichS3014
Моногидрат фосфата натрия моноосновнойSigma-Aldrich71507

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ettedgui, J., Kasianowicz, J. J., Balijepalli, A. Single molecule discrimination of heteropolytungstates and their Isomers in solution with a nanometer-scale pore. Journal of the American Chemical Society. 138 (23), 7228-7231 (2016).
  2. Bezrukov, S., Kasianowicz, J. Current noise reveals protonation kinetics and number of ionizable sites in an open protein ion channel. Physical Review Letters. 70 (15), 2352-2355 (1993).
  3. Kasianowicz, J. J., Bezrukov, S. M. Protonation dynamics of the alpha-toxin ion channel from spectral analysis of pH-dependent current fluctuations. Biophysj. 69 (1), 94-105 (1995).
  4. Please, T. R., Ayub, M. Solid-State Nanopore. Engineered Nanopores for Bioanalytical Applications. , Elsevier Inc. 121-140 (2013).
  5. Dekker, C. Solid-state nanopores. Nature Nanotechnology. 2 (4), 209-215 (2007).
  6. Kasianowicz, J. J., Brandin, E., Branton, D., Deamer, D. W. Characterization of individual polynucleotide molecules using a membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (24), 13770-13773 (1996).
  7. Akeson, M., et al. Microsecond time-scale discrimination among polycytidylic acid, polyadenylic acid, and polyuridylic acid as homopolymers or as segments within single RNA molecules. Biophysical Journal. 77 (6), 3227-3233 (1999).
  8. Singer, A., Meller, A. Nanopore-based Sensing of Individual Nucleic Acid Complexes. Israel Journal of Chemistry. 49 (3-4), 323-331 (2010).
  9. Jin, Q., Fleming, A. M., Burrows, C. J., White, H. S. Unzipping kinetics of duplex DNA containing oxidized lesions in an α-hemolysin nanopore. Journal of the American Chemical Society. 134 (26), 11006-11011 (2012).
  10. Halverson, K. M., et al. Anthrax biosensor, protective antigen ion channel asymmetric blockade. Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 34056-34062 (2005).
  11. Oukhaled, G., et al. Unfolding of proteins and long transient conformations detected by single nanopore recording. Physical Review Letters. 98 (15), 158101(2007).
  12. Reiner, J. E., Kasianowicz, J. J., Nablo, B. J., Robertson, J. W. F. Theory for polymer analysis using nanopore-based single-molecule mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12080-12085 (2010).
  13. Robertson, J. W. F., et al. Single-molecule mass spectrometry in solution using a solitary nanopore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8207-8211 (2007).
  14. Baaken, G., Ankri, N., Schuler, A. -K., Rühe, J., Behrends, J. C. Nanopore-based single-molecule mass spectrometry on a lipid membrane microarray. ACS Nano. 5 (10), 8080-8088 (2011).
  15. Angevine, C. E., Chavis, A. E., Kothalawala, N., Dass, A., Reiner, J. E. Enhanced single molecule mass spectrometry via charged metallic clusters. Analytical Chemistry. 86 (22), 11077-11085 (2014).
  16. Astier, Y., Uzun, O., Stellacci, F. Electrophysiological study of single gold nanoparticle/alpha-Hemolysin complex formation: a nanotool to slow down ssDNA through the alpha-Hemolysin nanopore. Small. 5 (11), 1273-1278 (2009).
  17. Chavis, A. E., Brady, K. T., Kothalawala, N., Reiner, J. E. Voltage and blockade state optimization of cluster-enhanced nanopore spectrometry. Analyst. 140 (22), 7718-7725 (2015).
  18. Campos, E., et al. Sensing single mixed-monolayer protected gold nanoparticles by the α-hemolysin nanopore. Analytical Chemistry. 85 (21), 10149-10158 (2013).
  19. Campos, E., et al. The role of Lys147 in the interaction between MPSA-gold nanoparticles and the α-hemolysin nanopore. Langmuir. 28 (44), 15643-15650 (2012).
  20. Baaken, G., et al. High-Resolution Size-Discrimination of Single Nonionic Synthetic Polymers with a Highly Charged Biological Nanopore. ACS Nano. 9 (6), 6443-6449 (2015).
  21. Berzelius, J. J. Beitrag zur näheren Kenntniss des Molybdäns. Annalen Der Physik. 82 (1), 369-392 (1826).
  22. Long, D. -L., Burkholder, E., Cronin, L. Polyoxometalate clusters, nanostructures and materials: from self assembly to designer materials and devices. Chemical Society Reviews. 36 (1), 105-121 (2007).
  23. Muller, A., et al. Polyoxovanadates: High-nuclearity spin clusters with interesting host-guest systems and different electron populations. Synthesis, spin organization, magnetochemistry, and spectroscopic studies. Inorganic Chemistry. 36 (23), 5239-5250 (1997).
  24. Rausch, B., Symes, M. D., Chisholm, G., Cronin, L. Decoupled catalytic hydrogen evolution from a molecular metal oxide redox mediator in water splitting. Science. 345 (6202), 1326-1330 (2014).
  25. Dolbecq, A., Dumas, E., Mayer, C. R., Mialane, P. Hybrid organic-inorganic polyoxometalate compounds: from structural diversity to applications. Chemical Reviews. 110 (10), 6009-6048 (2010).
  26. Busche, C., et al. Design and fabrication of memory devices based on nanoscale polyoxometalate clusters. Nature. 515 (7528), 545-549 (2014).
  27. Pope, M., Müller, A. Polyoxometalates: From Platonic Solids to Anti-Retroviral Activity. 10, Springer Science & Business Media. Dordrecht. (2012).
  28. Rhule, J. T., Hill, C. L., Judd, D. A., Schinazi, R. F. Polyoxometalates in medicine. Chemical Reviews. 98 (1), 327-358 (1998).
  29. Gao, N., et al. Transition-metal-substituted polyoxometalate derivatives as functional anti-amyloid agents for Alzheimer's disease. Nature Communications. 5, 3422(2014).
  30. Pope, M. T. Heteropoly and Isopoly Oxometalates. 8, Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (1983).
  31. Braha, O., et al. Designed protein pores as components for biosensors. Chemistry & Biology. 4 (7), 497-505 (1997).
  32. Forstater, J. H., et al. MOSAIC: A modular single-molecule analysis interface for decoding multistate nanopore data. Analytical Chemistry. 88 (23), 11900-11907 (2016).
  33. Balijepalli, A., et al. Quantifying Short-Lived Events in Multistate Ionic Current Measurements. ACS Nano. 8, 1547-1553 (2014).
  34. Misakian, M. M., Kasianowicz, J. J. J. Electrostatic influence on ion transport through the alphaHL channel. Journal of Membrane Biology. 195 (3), 137-146 (2003).
  35. Piguet, F., et al. Identification of single amino acid differences in uniformly charged homopolymeric peptides with aerolysin nanopore. Nature Communication. 9 (966), (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Nanopore DetectionAlpha HemolysinPolyoxometalate AnalysisSingle Molecule DetectionIonic Current MeasurementLipid Bilayer FormationElectrophysiology ApparatusPhosphotungstic AcidMembrane FormationReal time Monitoring

Related Articles