Методическая статья

Высок объём Люцифераза Assay для оценки протеолиза PCSK9 сингл оборот протеазы

7.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58265

⸱

28 августа 2018 г.

 ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, Zuckerberg San Francisco General and University of California San Francisco, 2Department of Cellular and Molecular Pharmacology and Howard Hughes Medical Institute, University of California San Francisco

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол предоставляет метод для оценки протеолитической активности протеаз неразрывно низкой активности, один оборот в сотовой связи. В частности этот метод применяется для оценки протеолитической активности PCSK9, ключевым фактором липидного обмена, чьи протеолитической активности требуется для его конечной употреблением функции.

Аннотация

Proprotein конвертазы Субтилизин/kexin тип 9 (PCSK9) — сингл оборот протеазы, который регулирует сыворотке крови липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) и, следовательно, сердечно-сосудистых заболеваний. Хотя PCSK9 Протеолиз требуется для его полной повышенным эффектом, оценки его протеолитического функции сложной: PCSK9 известна только само прилепится, проходит только один оборот и после протеолиза, сохраняет ее субстрат в ее активные сайт как auto ингибитора. Представленные здесь методы описывают assay который преодолевает эти проблемы. Assay фокусируется на межмолекулярных протеолиза в ячейки на основе контекста и успешных расщепления ссылки секретируемые Люцифераза деятельности, которые могут быть легко прочитаны в среде с кондиционерами. Через последовательные шаги мутагенеза, переходных transfection и индикация Люцифераза, assay может зонд PCSK9 Протеолиз в условиях либо генетических и молекулярных возмущений в духе высокой пропускной способности. Эта система хорошо подходит для обоих биохимической оценки клинически выявленных Миссенс сингл-полиморфизмы нуклеотидов (ОНП), а также что касается скрининга мелкомолекулярных ингибиторы протеолиза PCSK9.

Введение

PCSK9 цели рецепторов ЛПНП (ЛПНП-R) для деградации, поднимая LDL холестерина (LDL-C) и вождения атеросклеротического заболевания сердца1,2. Терапии таргетинга PCSK9 решительно снизить LDL-C и улучшить сердечно-сосудистые исходы для пациентов, даже при добавлении агрессивный липидов понижая терапии статинами3,4. Однако, в настоящее время утвержденных терапии ограничены подходы на основе антител и страдают от отсутствия экономичности5,6. Чтобы решить эту проблему, необходимы менее дорогостоящим терапевтической альтернативы, средства для выявления больных, скорее всего получить более значительные выгоды, или оба.

Мелкомолекулярных подходы могут целевых внутриклеточных PCSK9, обеспечивают улучшение маршрут администрации и сокращения расходов, что делает их «Святой Грааль» в этой области7. Однако PCSK9 оказалось трудно наркотиков в малых молекул. Как протеазы ориентация протеолитических функция PCSK9 является привлекательной стратегией, как self протеолиза тариф ограничивая шаг PCSK9 созревания8 и является обязательным для максимального эффекта на ЛПНП-R9. На сегодняшний день, однако, эта стратегия не удалось, вероятно из-за PCSK9 в уникальный биохимии: PCSK9 расщепляет только сам10, выполняя один оборот реакции, и после self расщепление, остается связанным на активном узле как PCSK9 prodomain Авто ингибитор11, предотвращая индикация любой дальнейшей активности протеаз.

Эта статья представляет метод для оценки PCSK9 протеолитической функция в высок объём моды8. Через сайт направленного мутагенеза следователи можно использовать этот assay зонда эффекты кодирования ОНП в клинике для оценки их воздействия на протеолиза, тариф ограничивая шаг PCSK9 созревания. Кроме того этот метод будет полезна в разработке экранов высокой пропускной способностью для выявления модуляторы протеолиза PCSK9, которые, как ожидается, в конечном итоге сорвать презентация PCSK9 ЛПНП-r (и модулировать PCSK9 повышенным эффектом) . Наконец этот протокол может быть адаптирована к другим протеаз с неразрывно низкая активность, условии, что i) конкретного субстрата протеазы пара можно найти, и ii) привязку подходящего внутриклеточных могут быть установлены для субстрата.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. сайт Направленный мутагенез протеазы вектора

  1. Дизайн и порядок обычай синтезированных олигонуклеотиды для установки мутация интерес с помощью модификации стандартного сайта Направленный мутагенез протоколы12. Стандартный обессоленной грунтовки (без дополнительной очистки) вполне приемлемо.
    Примечание: Общий подход к конструкции праймера предполагает создание частично перекрывающихся грунты, как указано в таблице 1, на калькуляторе плавления температура (Tm) для полимеразы интерес.
  2. Настройка цепной реакции полимеразы (PCR) для сайта Направленный мутагенез на льду, как указано в таблице 2.
  3. Цикл PCR, как указано в таблице 3.
  4. Запустить 2-5 мкл каждого ПЦР на геле агарозы 1% и визуализировать продукции для подтверждения успешного амплификации.
    Примечание: Успешного PCR покажет один, видные группы ДНК на приблизительный размер маркера шаблона (~7.8 kB).
  5. 0.5 мкл (за 25 мкл реакции) ДПНИ и Проинкубируйте образцы при 37 ° C в течение 1 ч.
  6. Преобразуйте 2 мкл реакции в химически сведущее Escherichia coli.
    Примечание: Быстро растущий штамм E. coli уменьшит время инкубации, но любой клонирования штамм будет приемлемым.
  7. Пластина преобразований на агар Бертани Лурия (LB), содержащие 50-100 мкг/мл carbenicillin. Инкубировать пластины на ночь при 37 ° C.
  8. Выберите 2-4 колонии растут в небольших культуры (2-5 мл среды фунтов с carbenicillin 50-100 мкг/мл). Инкубируйте культуры при 37 ° C на 220 об/мин, до тех пор, пока это мутная.
  9. Изолируйте плазмидной ДНК из клеток с использованием комплекта плазмида ДНК очистки (то есть, «алкалический») согласно инструкциям производителя. Количественно определить концентрацию eluted используя спектрофотометр microvolume ДНК.
  10. Последовательность плазмидной ДНК, широко используя Сэнгер службы виртуализации (например, ядро или коммерческого объекта). Подготовка образцов ДНК согласно спецификации службы. Праймеры успешно используется в предыдущих последовательности реакций отмечены в таблице 4.
    Примечание: Из-за ПЦР-амплификации всего плазмида, последовательность всего региона кодирования PCSK9 рекомендуется для каждого мутант.

2. высокой пропускной способностью на основе Люцифераза протеолиза Assay

  1. Мобильный покрытие (день 0)
    1. Используйте низкий проход HEK293T клетки для экспериментов и культуры в Дульбекко изменение средних орла (DMEM) с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС). Выполнить все ячейки работу в стерильных условиях в культуре ткани капюшоном до готовности к assay Люцифераза деятельности. Оцените количество скважин и пластин, необходимых для проведения эксперимента, ожидая, что transfections будет выполняться в трех экземплярах для каждого условия испытания.
    2. Отделить HEK293T клеток из родительского колбу, рассматривая их с минимальным объемом 0,05% трипсина Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) для покрытия клетки. Инактивирует трипсина ЭДТА с 2 тома DMEM, дополненная 10% FBS и передачи ячеек в стерильную пробирку. Подсчитать количество ячеек с использованием автоматизированных ячейки счетчика (и окрашивание с Трипановый синий). Центрифуга трубки на 500 x g 5 минут для восстановления клеток.
    3. Аспирационная трипсина содержащих среднего и воссоздания клетки в культуре средне концентрации 2 x 105 кл/мл. С помощью многоканальных дозаторов, передачи 100 мкл клеток в каждой скважине белый (непрозрачный внизу) 96-луночных плиты, которая дает окончательного заполнения концентрации 2 х 104 клетки/хорошо.
      Примечание: Для первоначальных экспериментов, он может быть полезным дополнительно семян сестра, 96-луночных ясно-днище, с тем чтобы контролировать соблюдение протокола и руководство будущих неполадок и рост клеток.
    4. Инкубируйте клетки при 37 ° C и 5% CO2 на 24 часа.
    5. Подготовка мастер плита плазмид в 96-луночных формате. Развести каждого плазмида в Элюирующий буфер (Tris-HCl, рН 8,5) до 50 нг/мкл в индивидуальных хорошо 96-луночных плиты.
      1. Подготовьте 4 скважины для положительный контроль (WT) плазмида8, плазмида отрицательного контроля (S386A)8и плазмида бесплатная буфер (для макет transfections). Если наркотики или другие процедуры, основанные на сотовых планируются, а затем подготовить основной пластины с плазмида положительный контроль (WT) в каждой скважине, наряду с 4 скважины каждый из плазмида отрицательного контроля (S386A) и плазмиды бесплатная буфер.
  2. Трансфекция (1 день)
    1. Подготовьте смесь трансфекции в формате 96-луночных пластины с использованием глубокой скважины 96-луночных пластины. Выполните transfections в трех экземплярах, будучи уверенным, чтобы подготовить достаточное количество реагентов для учета потерь закупорить и передачи.
      Примечание: Следующие вычисления подготовить достаточно реагент для запуска одну плиту 96-луночных в трех экземплярах (по консервативным оценкам 420 скважин).
      1. Сделайте мастер смеси разреженных липидов трансфекции реагента, добавив 50.4 мкл реагента к 2050 мкл сокращение сыворотке среды. Сделайте мастер смесь ДНК precomplexation реагент, добавив 33,6 мкл реагента в 1730 мкл сокращение сыворотке среды.
      2. С помощью многоканальные пипетки, аликвота 16.8 мкл разбавленные смеси реагентов precomplexation ДНК в каждой скважине штанхглубинных пластины.
      3. С помощью многоканальных дозаторов, аликвота 3.2 мкл (160 нг) из каждого плазмиды от главной пластины в каждой скважине штанхглубинных пластины.
      4. С помощью многоканальных дозаторов, аликвота 20 мкл разбавленного липидов трансфекции реагент смеси для каждого хорошо пластины и смешать содержимое каждой хорошо с помощью многоканальных дозаторов. Накладки и пусть они сидят при комнатной температуре (RT) для 10-15 мин до формы липидов: ДНК комплексы.
        Примечание: После трансфекции, окончательный компоненты на хорошо будет следующим: 40 нг ДНК, 0.12 мкл Реагента transfection и 0,08 мкл Реагента pre комплексообразования ДНК и содержание каждого хорошо будет 10 мкл в общем объеме (сокращение сыворотке средний).
    2. Аккуратно обмениваться средство на 293T клетки в 96-луночных пластины с помощью многоканальных дозаторов, стараясь не нарушить клетки. Заменить средство без наддува с 95 мкл DMEM дополнена 10% FBS.
      Примечание: Это будет подходящее время для лечения клетки с любой препарат интерес.
    3. 10 мкл трансфекции смеси, для каждого соответствующего хорошо через многоканальные пипетки. Аккуратно водоворот пластину смешать содержимое в скважинах. Инкубируйте пластины при 37 ° C с 5% CO2 на 24 часа.
      Примечание: Окончательный объем лунки доходит до 105 мкл, для учета испарения более 24 ч.
  3. Проба (день 2)
    1. Подготовить раствор для целентеразин реагентов: [растворяют в фосфат амортизированное saline (PBS), свеже] Аскорбат натрия 3 M, 5 M NaCl, 10 мг/мл бычьим сывороточным альбумином (БСА; растворяют в PBS, свеже) и 2 мм Целентеразин (растворяют в Подкисленные метанола, содержащие 200 мкл 3 N HCl 10 мл).
      Примечание: Целентеразин 2 мм могут храниться на 2 недели, когда он хранится при температуре-80 ° C и в отсутствие света.
    2. Готовить 2 x coelenterazine реагенты для считывания Люцифераза, с отдельной реагент каждый для клетки и средних, согласно таблице 5. Смешать все реагенты сохранить целентеразин во-первых, через фильтр шприц 0,22 мкм фильтр смесь, а затем добавьте целентеразин. Защите от света реагентов, до тех пор, пока они готовы быть добавлены к пластинам.
      Примечание: Из-за потери раствора от фильтрации, сделать достаточно реагент для учета обоих потери от фильтрации, а также трансферы. Таблица 5 показывает конечная концентрация реагентов 2 x (а также количество Стоковый раствор добавить зачитать один 96-луночных плита с одной реагента).
    3. Удалите ячейки из инкубатора 24 ч после transfection. С помощью многоканальных дозаторов, передачи 50 мкл кондиционером среды от каждой скважины свежий, белый дном (непрозрачный) 96-луночных пластины.
      1. Ярлык пластины относительно ли они содержат средний или клетки. Если более чем одна пластина 96-луночных был transfected, ярлык пластины с тем чтобы обеспечить, что каждый средне содержащие пластину в паре с ее родительской пластины клеток.
    4. С помощью многоканальных дозаторов, 50 мкл 2 x не литических целентеразин реагента к пластине, содержащие только кондиционером среднего. Мягко рок или встряхнуть пластину в отсутствие света для 5-10 мин на RT.
    5. С помощью многоканальных дозаторов, добавьте 50 мкл реагента 2 x литические целентеразин к пластине, содержащие клетки. Мягко рок или встряхнуть пластину в отсутствие света для 5-10 мин на RT.
    6. После инкубации зачитал люминесценции средне только пластины на пластину читателя. Затем зачитал люминесценции клетки содержащих пластины в же читатель пластины.
    7. Отменить пластины и сохранять файлы для анализа данных.

3. анализ данных

  1. Выполните анализ исходных данных с использованием программного обеспечения электронной таблицы. Создайте таблицу, содержащую результаты из клетки и средних плит.
  2. Вручную проверяйте данные из ячейки пластины для выявления плохо transfected скважин. Скважины, которые показывают < 5% - 10% индикация плазмида отрицательного контроля (S386A) следует рассматривать как плохо transfected, делая толкованием этих данных подозреваемого.
  3. Рассчитайте средняя фоновая люминесценции каждой пластины с макет transfected скважин. Вычитание фона каждой пластины из значений что пластины.
    Примечание: Это значение может быть незначительным в зависимости от читателя плита используется.
  4. Процесс данных путем вычисления доли Люцифераза активности в среде, по сравнению с общей активности Люцифераза для каждой скважины. Потому что клетки табличка содержит оба кондиционером среднего помимо клетки, и средне только табличка содержит столько же, сколько условных среды пластину ячейки, следует использовать следующее уравнение:
    figure-protocol-1
    Здесь, RLU = относительная люминесценции единиц, фон вычитается Индикация от читателя пластины.
  5. Вычислите среднее секретируемые Люцифераза положительный контроль (WT) и отрицательный контроль (S386A) скважин.
  6. Оценивают общее качество эксперимент путем вычисления Z-фактор13:
    figure-protocol-2
    Примечание: Активные значения берутся из позитивного управления (WT) и неактивные значения берутся из отрицательного контроля (S386A) скважин. Значения ближе к 1 показывают более высокое качество экспериментальной. Попробуйте повторить эксперимент или оптимизации рабочего процесса, если значение меньше 0.
  7. Перенесите данные из программы электронных таблиц в программное обеспечение для анализа научных данных.
  8. Нормализуют деятельность выделяется Люцифераза на средние значения позитивного управления (WT) и отрицательных (S386A), установка положительный контроль как 1 и отрицательный контроль как 0.
  9. Очистка данных для промахов с помощью метода регрессии и выброс удаления (маршрут), установив скорость максимальная ложных обнаружения до 1%.
  10. Оценки для статистически значимых различий путем сравнения данных для каждого мутант условие (или мутант) означает WT активности (нормализованное значение 1). Выполните несколько непарных t-тесты, исправление для нескольких сравнений с использованием метода Holm-Sidak и α = 0,05.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Высок объём протеолиза assay полагается на преодоление три основные проблемы. Во-первых чтобы преодолеть неразрывно низкий выход один оборот PCSK9 протеазы, PCSK9 протеазы, отсутствует ингибирующее prodomain используется, с последовательностью расщепление на хвост prodomain связан с Люцифераза, который может быть выделяется14. Во-вторых чтобы удовлетворить потребность протеазы сложить комплекс с его тормозной prodomain, два полипептидов, coexpressed в транс

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Описанные выше экспериментальной процедуры представляют способ преодолеть неразрывно низкой активности протеаз сингл оборот PCSK9 и оценить его протеолитического функция на надежной основе. Ключевая концепция assay полагается на преобразования одного оборота событий в ферментационно индикация. Сильные стороны assay включают относительно короткие сроки и простота использования Люцифераза репортер, а также его масштабируемость высок объём подходов. Кроме того анализ оценивает протеолиза в его родной, сотовой связи. Кроме т...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Авторы благодарят щедрой финансовой поддержке NHLBI/низ (K08 HL124068 и LRP HMOT1243), NCATS/низ через UCSF клинических и поступательного науки Института катализатор программы (УЛ1 TR000004), UCSF академического Сената, Хеллман фонд, Галааде наук исследования ученый премии, Pfizer ASPIRE сердечно-премии, (все для Джон S. чорба) и Говард Хьюз медицинский институт (до Galvan Adri м. и. м. Шокат Кеван).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ПЦР-пробиркиСША Scientific1402-2900для ПЦР
Q5 горячий стартNew England BiolabsM0493LВысокоточный раствор ДНК-полимеразы
дезоксинуклеотид смесьEngland BiolabsN0447LdNTPs (для ПЦР)
pPCSK9-NLucProteaseAssay-WTавторын/дДоступно у авторов
pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386AАвторын/дДоступны у авторов
Agarose LEGold BiotechnologyA-201-100Для гелей
ДНК E-Gel Imager System with Blue Light BaseThermoFisher Scientific4466612Для визуализации гелей
ДНК SYBR Safe DNA Gel StainThermoFisherScientific S33102Для гелей
ДНК Tris BaseThermoFisher ScientificBP152-1Для ДНК геля бегущий буфер
Ледяная уксусная кислотаThermoFisher ScientificA38-500Для ДНК геля беговой буфер
Этилендиаминтетрауксусная кислота раствор MilliporeSigma3690EDTA, для ДНК геля беговой буфер
1 кб ДНК лестницаGold BiotechnologyD010ДНК лестница
DpnINew England BiolabsR0176SФермент рестрикции
Пластины LB Agar с 100 & микро; г/мл карбенициллинTeknovaL1010LB-Carb пластины
Один выстрел Mach1 T Фагоустойчивый Химически компетентный E. coliThermoFisher ScientificC862003Химически компетентные клетки
LB Бульон, MillerThermoFisher ScientificBP1426-2LB
КарбенициллинГолд БиотехнологияC-103-5Селективный антибиотик
E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit IOmega BioTekD6942-02Мини-набор для очистки ДНК
NanoDrop 2000 СпектрофотомерThermoFisher ScientificND-2000CСпектрофотометр
293T КлеткиАмериканская коллекция тканевых культур (ATCC)CRL-3216HEK 293T клетки
DMEM, высокий уровень глюкозы, пируватThermoFisher Scientific11995065DMEM, клетка млекопитающих, клетка млекопитающих, клетка млекопитающего медиа
Фетальная бычья сывороткаAxenia BiologixF001FBS
Трипсин-ЭДТА (0,05%), фенол красныйThermoFisher Scientific25300062Трипсин, для диссоциации клеток
Фосфатный буферный раствор (PBS)ThermoFisher Scientific10010023PBS
Countess автоматический счетчик клетокThermoFisher ScientificC10227Автоматизированный подсчет клеток
Предметные стекла камеры для подсчета клетокThermoFisher ScientificC10228Слайды для подсчета клеток
CELLSTAR Tissue Culture Plates, белые, с белым дном, с крышкойGrenier Bio-One655083белые, с белым дном 96 лунок TempPlate
без юбки 96-луночные ПЦР-планшеты, натуральныеСША Scientific1402-959696-луночные планшеты для мастер-плазмид
Nunc 2,0 мл DeepWell ПланшетыThermoFisher Scientific27874396 лунок глубокий луночный реагент
Lipofectamine 3000ThermoFisher ScientificL3000008реагент для трансфекции липидов, реагент Lf3K
P3000ThermoFisher ScientificL3000008реагент для предварительного комплексообразования ДНК, в комплекте Lf3K
OptiMEM I Уменьшенная сывороткаСреда ThermoFisher Scientific31985062Восстановленная сыворотка для трансфекции
(+)-L-аскорбат натрияМиллипор SigmaA4034Аскорбат натрия
Хлорид натрияMilliporeSigma S9888NaCl
Альбумин, бычья сыворотка, фракция V, с низким содержанием тяжелых металловMillipore Sigma12659BSA
Метанол (ВЭЖХ)ThermoFisher ScientificA4524MeOH
Соляная кислотаVWRJT9535-2Концентрированный HCl
CoelenterazineGold BiotechnologyCZ2.5Люциферазный субстрат
Шприцевой фильтр, стерильныйThermoFisher Scientific09-720-3Стерильный фильтр, PVDF, 0.22 &; m pore
Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+Rainin17013810Многоканальная пипетка
Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+Rainin17013808Многоканальная пипетка
Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+Rainin17013807Многоканальная пипетка
Резервуар для реагентовCorning4870Корыто для реагентов
Центрифужные пробирки, 15 млThermoFisher Scientific05-539-1215 мл
Центрифужные пробирки, 50 млCorning43082950 мл Spark
Microplate ReaderTecanN/aPlate Reader
ExcelMicrosoft2016 для MacПрограммное обеспечение для работы с электронными таблицами
PrismGraphPad Softwarev7Программное обеспечение для научного анализа данных
New

Ссылки

  1. Park, S. W., Moon, Y. A., Horton, J. D. Post-transcriptional regulation of low density lipoprotein receptor protein by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9a in mouse liver. Journal of Biological Chemistry. 279 (48), 50630-50638 (2004).
  2. Cohen, J. C., Boerwinkle, E., Mosley, T. H., Hobbs, H. H. Sequence variations in PCSK9, low LDL, and protection against coronary heart disease. New England Journal of Medicine. 354 (12), 1264-1272 (2006).
  3. Ridker, P. M., et al. Cardiovascular Efficacy and Safety of Bococizumab in High-Risk Patients. New England Journal of Medicine. 376 (16), 1527-1539 (2017).
  4. Sabatine, M. S., et al. Evolocumab and Clinical Outcomes in Patients with Cardiovascular Disease. New England Journal of Medicine. 376 (18), 1713-1722 (2017).
  5. Kazi, D. S., et al. Cost-effectiveness of PCSK9 Inhibitor Therapy in Patients With Heterozygous Familial Hypercholesterolemia or Atherosclerotic Cardiovascular Disease. Journal of the American Medical Association. 316 (7), 743-753 (2016).
  6. Kazi, D. S., et al. Updated Cost-effectiveness Analysis of PCSK9 Inhibitors Based on the Results of the FOURIER Trial. Journal of the American Medical Association. 318 (8), (2017).
  7. Pettersen, D., Fjellström, O. Small molecule modulators of PCSK9 - A literature and patent overview. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 28 (7), 1155-1160 (2018).
  8. Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. Stepwise processing analyses of the single-turnover PCSK9 protease reveal its substrate sequence specificity and link clinical genotype to lipid phenotype. Journal of Biological Chemistry. 293 (6), 1875-1886 (2018).
  9. Maxwell, K. N., Breslow, J. L. Adenoviral-mediated expression of Pcsk9 in mice results in a low-density lipoprotein receptor knockout phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (18), 7100-7105 (2004).
  10. Benjannet, S., et al. NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the low density lipoprotein (LDL) receptor and LDL cholesterol. Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48865-48875 (2004).
  11. Cunningham, D., et al. Structural and biophysical studies of PCSK9 and its mutants linked to familial hypercholesterolemia. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (5), 413-419 (2007).
  12. Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8, 91(2008).
  13. Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  14. Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).
  15. McNutt, M. C., Lagace, T. A., Horton, J. D. Catalytic activity is not required for secreted PCSK9 to reduce low density lipoprotein receptors in HepG2 cells. Journal of Biological Chemistry. 282 (29), 20799-20803 (2007).
  16. Chorba, J. S., Shokat, K. M. The proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) active site and cleavage sequence differentially regulate protein secretion from proteolysis. Journal of Biological Chemistry. 289 (42), 29030-29043 (2014).
  17. Benjannet, S., Rhainds, D., Hamelin, J., Nassoury, N., Seidah, N. G. The proprotein convertase (PC) PCSK9 is inactivated by furin and/or PC5/6A: functional consequences of natural mutations and post-translational modifications. Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30561-30572 (2006).
  18. Zhao, Z., et al. Molecular characterization of loss-of-function mutations in PCSK9 and identification of a compound heterozygote. American Journal of Human Genetics. 79 (3), 514-523 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

PCSK9HEK293SNP

Похожие статьи