Методическая статья

Эффективная стратегия для генерации двоичного транскрипции ткани конкретных систем у дрозофилы путем изменения генома

DOI:

10.3791/58268

⸱

19 сентября 2018 г.

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем метод для генерации двоичного транскрипции ткани конкретных систем у дрозофилы , заменив первый кодирования экзона генов с драйверами транскрипции. Метод на основе ТРИФОСФАТЫ/Cas9 места transactivator последовательность под эндогенного регулирования сменил гена и следовательно облегчает transctivator выражение исключительно в пространственно-временных структур ген специфического.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Системы Бинарные транскрипции являются мощные генетических инструменты широко используются для визуализации и обработки клеток судьба и ген выражение в конкретных группах клеток или тканей в модельных организмов. Эти системы содержат два компонента как отдельный трансгенных линий. Линии драйвер выражает transcriptional активатор под контролем ткани конкретных промоутеров/усилители и гаваней линии репортер/эффектор, целевого гена размещены ниже по течению на сайт связывания активатор транскрипции. Животные, укрывательство обоих компонентов побудить transactivation ткани конкретного целевого выражения гена. Точное пространственно-временных выражение гена в целевых тканях имеет решающее значение для объективное освещение деятельности клеток/ген. Таким образом разработка метода для создания эксклюзивных клеток/тканей конкретных драйверов линии имеет важное значение. Здесь мы представляем метод для создания системы весьма ткани конкретных целевых выражение, используя «кластерный регулярно Interspaced короткие палиндром Repeat/ТРИФОСФАТЫ связанные» (ТРИФОСФАТЫ/Cas)-основанные геном редактирования технику. В этом методе эндонуклеазы, которую Cas9 является объектом двух химерных руководство РНК (gRNA) на определенных сайтах в первом кодирования экзона гена в геном дрозофилы для создания двухнитевые разрывы (DSB). Впоследствии с помощью внешних доноров плазмида, содержащий последовательность transactivator, клетки автономного ремонт техники позволяет гомологии направленных ремонт (HDR) ОРС, в результате точного удаления и замены экзона с transactivator последовательности. Постучал в transactivator выражается исключительно в клетках где СНГ-регулирующие элементы заменены гена являются функциональными. Подробные пошаговые протокола, представленные здесь для генерации двоичного транскрипционный анализ драйверов, выраженные в ФБП дрозофилы/внеофисного-производящ клетки эпителия/нейронов может быть принят для любого выражения конкретных генов или ткани.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Генетических элементов для экспрессии целевых генов был хорошо развита у дрозофилы, что делает его одним из лучших систем модель для изучения функции генов, вовлеченных в самых разнообразных клеточных процессов. Двоичные выражения систем, таких как дрожжи Gal4/Уан (вверх по течению активации последовательности), впервые был принят для ткани конкретных усилитель треппинга и Джин которое в дрозофилы генетических модель1 (рис. 1). Эта система способствовала развитию большое количество методов, таких как пространственно-временных правил гиперэкспрессия генов, которое, нокаут в отдельных групп клеток, также как и абляции клеток, клеток маркировки, Живая трассировка клеточной и молекулярной процессы в эмбриона и тканей, линии трассировки и мозаика анализов во время разработки. Количество двоичных транскрипции системы, такие как бактериальный LexA/LexAОП системы (рис. 1) и Нейроспора Q-системы, являются мощными инструментами генетических, которые сейчас широко используются в дрозофилы, в дополнение к Оригинальный Gal4/Уан система для целевых генов выражение1,2,3.

Здесь мы представляем метод для создания высоконадежных ткани конкретных двоичные выражения системы, используя метод изменения генома. Последние достижения в технологии редактирования генома ТРИФОСФАТЫ/Cas9 позволили беспрецедентные возможности для изменения направлены генома в широком диапазоне организмов. По сравнению с других методов редактирования доступны генома, ТРИФОСФАТЫ/Cas9 система является эффективной, недорогой и надежный. Эта технология использует компоненты бактериальных адаптивной иммунной системы: Cas9 эндонуклеазы Streptococcus pyogenes , который создает двухручьевой перерыв (DSB) и химерных руководство РНК (gRNA), которая направляет на конкретной генома сайт для Cas9 целевые DSB4. Ячейки содержат машины для ремонта DSB, используя различные пути. Non гомологичных конец присоединения (NHEJ) приводит к небольшой вставки или удаления нарушить функции гена, в то время как ориентированные на гомологии ремонт (HDR) вводит определенные направлены/желательно геномной в/стучите нокаут с помощью внешних доноров HDR как шаблон. Стратегии на основе HDR замена эффективно могут быть использованы для создания высоконадежных ткани конкретных двоичные выражения системы, которая может преодолеть все ограничения методов ловушку традиционной усилитель. Мы описываем пошаговые процедуры для использования на основе ТРИФОСФАТЫ/Cas9 HDR ремонта в генерации двоичного транскрипции драйвер линии, которая выражается под контролем эндогенного транскрипционный анализ и post-transcriptional регулирования дрозофила гена. В этом протоколе, мы демонстрируем поколения специфических для драйвера линии внеофисного гена (bnl) кодирования ФБП семьи протеина, который регулирует ветвления морфогенез эпителия трахеи сократимость5. В этом примере первый кодирования экзона гена bnl был заменен последовательность бактериальной Лекса transactivator последовательность без изменения любых эндогенных СНГ-регулирования последовательностей гена bnl . Мы покажем, что стратегия создается линия драйвер Bnl Лекса , spatiotemporally управляет экспрессии гена репортера, размещенных ниже по течению от LexAoperator (LexAop или LexO) исключительно в bnl- выражая эпителиальных/мезенхимальных/нейрональных клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Проектирование и строительство gRNA выражение вектор

  1. Чтобы точно заменить долго определенную область экзона, используйте двойной gRNA подход6, в котором каждый gRNA можно конкретно два конца выбранной области интереса. Чтобы получить точное выражение пространственно-временных ген специфического драйвера, выберите два gRNA целевых сайтов в пределах первого кодирования экзона гена.
  2. Для Drosophila melanogasterвыберите gRNA целевых сайтов, используя средство оптимального целевого поиска flyCRISPR (http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/). Другие доступные ТРИФОСФАТЫ дизайн инструменты могут использоваться также, включая средство оптимизированный дизайн ТРИФОСФАТЫ (http://crispr.mit.edu), FlyCas9 (https://shigen.nig.ac.jp/fly/nigfly/cas9) и E-Крисп (www.e-crisp.org/E-CRISP).
    Примечание: Следующие протоколы gRNA дизайн и клонирования был принят от методов описано6,7.
    1. Скопируйте фактическая последовательность в соответствующее поле в онлайн-инструмент. Выберите наиболее недавно выпустила Drosophila melanogaster генома аннотации версии, «r_6,» в раскрывающемся меню для «Выберите геном.» В поле «выберите руководство Длина (nt),» input «20.» Выберите «Все ТРИФОСФАТЫ цели» и нажмите «Найти ТРИФОСФАТЫ цели».
    2. Оцените все цели gRNA кандидата, установив «Максимум» для «Жесткости» и «NGG только» для «Пэм». Попробуйте выбрать gRNA сайтов без каких-либо потенциальных от целей или минимальное количество возможных-целей. Использование веб инструмент описано в Doench et al. 2014 8 , чтобы выбрать оформления с потенциальным оценка «хорошо» активности.
    3. Одновременно убедитесь, что есть нет полиморфизм в gRNA целей в геноме родительского летать линии, выбранных для инъекций (Например, нос Cas9 на Х-хромосоме, BL # 54591). Следуйте Протоколу описанные в Грец et al. 20157 для извлечения геномной ДНК из родительского летать линии. PCR усиливает, приблизительно, 500 – 1000 nt регионов с помощью грунтовки, которые обрамляют последовательность интереса и ДНК-полимеразы высокой верности; последовательность проверьте продукты PCR усиливается.
  3. Для создания вектора выражения gRNA тандем, следуйте перевязка независимые клонирования протокол6 представить две последовательности protospacer в pCFD4 РНК выражение вектор. Обратите внимание, что вектор Улучшенный мульти gRNA выражение (pCFD5) теперь доступна, где оба sgRNAs выражаются сильным U6:3 промоутеров9 (https://www.crisprflydesign.org). Используйте метод ДНК Ассамблеи клонировать оформления в pCFD4 вектор.
    1. Дизайн и заказать прямого и обратного Праймеры для введения двух последовательностей protospacer в pCFD4 вектора выражения РНК (Таблица 1а). Как описано выше6вперед Грунтовка содержит первый protospacer последовательность, обрамленная регионов, соответствующих U6-1 промоутер и gRNA ядра в pCFD4; Обратный Грунтовка содержит последовательность обратного дополнением второго protospacer, обрамленная регионов, соответствующее ядро gRNA и промоутер U6-3 в pCDF4.
    2. Ресуспензируйте грунтовки до 100 мкм с дистиллированной водой DNase и свободной РНКазы двойной (ddH2O). Сделайте 10 мкм Рабочая концентрация праймера. Использование pCFD4 плазмиды как шаблон и Настройка реакции PCR с помощью полимеразы высокой точности и рекомендованные параметры для реакции PCR6.
    3. Чтобы клонировать усиливается продукта в pCFD4, дайджест pCFD4 плазмиду с BbsI фермента, создав следующие реакции: 2 – 5 мкг pCFD4 плазмиды, 5 мкл 10 x буфер пищеварение, 1 мкл BbsI фермента и ddH2O довести окончательный объем до 50 мкл. Перемешайте содержимое реакции нежно касания трубку и собирая все отдельные капельки от стенки трубки на дно, краткий спина. Инкубируйте смесь реакции при 37 ° C на 2 ч.
    4. Запуск продукта ПЦР из шага 2 и переваривается продукт из шага 3 на геле агарозы 1%. Провести электрофорез для достаточно времени, чтобы полностью отделить ДНК полос. Вырезать правильного размера ДНК банды под УФ транс осветитель до очистки ожидаемых продуктов с использованием геля элюции столбца после инструкции производителя (см. Таблицу материалы). ПЦР продукта должно быть 600 bp и плазмиды линеаризованного pCFD4 должно быть ~6.4 КБ 6.
    5. Настройка реакции Ассамблеи ДНК в ПЦР-пробирку, в инструкции производителя (см. Таблицу материалы).
    6. Превратить 2 мкл Ассамблея продукта в компетентных бактерий (DH5α или аналогичные штаммы с ΔrecA1, ΔendA1), тарелка на ампициллин (100 мкг/мл) содержащий плиты агара ФУНТ (LB/Amp) и инкубировать при 37 ° C на ночь. Обратите внимание, что ДНК смесь Ассамблеи могут быть токсичными для некоторых штаммов бактерий, но разбавления смеси Ассамблея может снизить токсичность.
    7. Выберите 3 – 4 ампициллин устойчивостью колоний от пластины инкубируют на ночь, прививок колонии в 3 мл LB, содержащие 100 мкг/мл Ампициллин и расти привитых бактерий в шейкере 37 ° C ночь. Экстракт плазмиды от ночлега культивированный бактерий с помощью комплекта мини-prep плазмида после инструкции производителя (см. Таблицу материалы).
    8. Последовательность плазмид универсальным грунтом T3 экран для правильного клоны, содержащий вставки gRNA тандем. Создание глицерин запас бактерий преобразована с проверки последовательности pCFD4-gRNA в 20% глицерина и хранить в морозильной камере-80 ° C для использования в будущем.

2. Проектирование и строительство HDR доноров

  1. Для геномной стук в Gal4 или LexA последовательности дизайн двунитевая HDR доноров, содержащий последовательность transactivator, в окружении двух гомологии оружия.
    1. Использование > 1,5 КБ оставил и правый гомологии оружия фланговые gRNA таргетинга сайта. Расширенные гомологии оружия увеличить эффективность HDR во время процесса ремонта 10.
    2. PCR усиливает гомологии оружия от геномной ДНК (геномная ДНК), извлеченные из родительского летать линии, выбранных для инъекций (Например, нос Cas9 (на Х-хромосоме), BL # 54591). Используйте корректорские начало Taq-ДНК полимераза фермент подходит для долго ПЦР расширение (см. Таблицу материалы). Последовательность проверьте.
  2. Чтобы избежать переориентацию gRNA к инженерии локус, Дизайн замена доноров таким образом, что признание сайты gRNA разрушаются экзогенных последовательности представил.
    Примечание: чтобы избежать изменения предполагаемого СНГ регуляторные элементы, всегда выберите gRNA признание сайтов в регионе кодирования экзона.
  3. Для генерации Замена кассеты, планировать стратегию ДНК Ассамблеи объединиться четырех сегментов: 5' и 3' гомологии оружия, последовательности ДНК среднего экзогенных transactivator и линеаризованное клонирования вектор позвоночника (например, pUC19 или других часто используемые клонирования векторов). После производителя ориентиром для Ассамблеи ДНК (см. таблицу материалы), дизайн подходит Праймеры для амплификации PCR и Ассамблеи каждого сегмента. Ресуспензируйте грунтовки до 100 мкм с ddH2O. Make 10 мкм Рабочая концентрация праймера. Используйте высококачественный полимеразы для всех реакций PCR. Выполните следующий протокол:
    1. PCR усиливает Gal4 или LexA выражение кассеты из доступных вектора (например, nls-LexA:p65; идеальное выражение плазмид Gal4/LexA/QF2 могут быть найдены и получены из общих ресурсов, таких как Addgene) с помощью Грунты, перечисленные в таблице 1В.
      1. Чтобы сохранить все оригинальные транскрипционный анализ и post-transcriptional правил заменил экзона на выражение последовательности ДНК transactivator, Дизайн кассету таким образом, что отредактированный геномной аллеля выскажет химерных мРНК из transactivator и ген. Сохраните 5' и 3' концу целевых экзона сохранить любой сплайсинга сигнал.
      2. Включать T2A самостоятельно расщепления пептидов последовательность между остаточной 5' кодирования экзона и transactivator последовательность для предотвращения перевода на химерных белка. Добавьте перевод стоп кодоном после экзогенных transactivator последовательности (рис. 5).
    2. PCR усиливает гомологии оружия от геномной ДНК (геномная ДНК), извлеченные из родительского летать линии, выбранных для инъекций (Например, нос Cas9 (на Х-хромосоме), BL # 54591) используя праймеры, перечисленные в таблице 1В. Используйте высококачественный полимеразы для всех реакций ПЦР, с использованием систем следующим: 5 мкл 5 x буфер реакции, 0.5 мкл 10 мм дНТФ, 1,25 мкл 10 мкм вперед грунт, 1,25 мкл 10 мкм вспять грунт, 0.5 мкл шаблон ДНК, 0,25 мкл высокой верности ДНК-полимераза , 16.25 мкл ddH2O.
    3. Использование линеаризованного клонирования вектор, например pUC19. Ряд доноров векторов теперь доступны. Посмотреть полный список на следующих веб-сайт http://flycrispr.molbio.wisc.edu.
    4. Запуск продуктов ПЦР на геле агарозы 1%. Провести электрофорез для достаточно времени, чтобы обеспечить четкое разделение нужный диапазон от нежелательных неспецифичных (если таковые имеются). Гель очищайте ожидаемых фрагментов ДНК. Измерьте концентрацию каждого очищенная ДНК фрагмента с помощью спектрофотометра.
    5. Настройка реакции Ассамблеи ДНК после инструкции производителя. Смешать линеаризованного клонирования вектор и целевых фрагментов из шаг 3 и шаг 4 в следующей реакции: 1 мкл линейных клонирования вектор (50 нг/мкл), 2 – 3 раза избыток каждого целевого фрагмента, 10 мкл 2 x ДНК Ассамблеи мастер перемешивают, доводят объем окончательной реакции до 20 мкл с ddH < C21 > 2O. инкубировать реакция смеси на 1 час при температуре 50 ° C.
    6. Трансформировать 2 мкл Ассамблея продукта в компетентных бактерий, плиты на плиты агара LB/Amp, содержащий ампициллина 100 мкг/мл. Кроме того добавьте X-Гал + IPTG на пластину для скрининга синий/белый.
    7. Выберите 3-4 белых колоний от пластины инкубируют на ночь, прививок колонии в 3 мл LB, содержащий ампициллина 100 мкг/мл и расти при 37 ° C ночь в шейкере. Экстракт плазмиды от ночлега культивированный бактерий с помощью комплекта мини-prep плазмида после производитель вручную (см. Таблицу материалы).
    8. Экран положительных колонии PCR или ограничение пищеварение.
    9. Последовательность проверки HDR доноров региона окончательного плазмиды. Сохраните бактериальные запас преобразована с правильным клонов в 20% глицерина в-80 ° C для будущих прививка.

3. эмбриона инъекции, летать генетики и отбора для изменения генома

  1. Подготовьте высокой чистоты свободных эндотоксина gRNA выражение вектор, а также HDR доноров плазмида с помощью плазмида maxiprep комплекта (см. Таблицу материалы).
  2. Совместное придать микрофлорой Нос Cas9 эмбрионы6gRNA выражение плазмида (100 нг/мкл) и замена доноров (500 нг/мкл). Примечание: мы используем коммерческой службы для инъекций, но эта процедура может быть выполнена в лаборатории также.
  3. Летите, генетика и скрининга (рис. 2 и рис. 3):
    1. Когда эмбрионы вводят развиваются во взрослых, крест каждый одного G0 летит балансировки мух. Выберите подходящие балансировки для хромосомы, содержащий целевых аллеля.
    2. Анестезировать F1 потомство от каждого G0 крест на площадку CO2 и случайным образом выбрать 10-20 мужчин под стереомикроскопом. Пересекать их индивидуально для балансировки женщин как показано на рисунке 3.
    3. Когда личинки Люк F2, выбрать один отец F1 от каждого Креста и извлечь геномная ДНК, используя один летать геномной ДНК подготовки протокола:
      1. Подготовить геномная ДНК извлечения буфер: 10 мм трис-Cl рН 8,2, 1 мм ЭДТА, 25 мм NaCl, хранить при комнатной температуре. Подготовка 20 мг/мл протеиназы K Стоковый раствор и хранить в холодильнике.
      2. Положите каждый летать в микро пластиковых пробирок 1.5 мл и этикетке трубки. Храните в морозильной камере-80 ° C на ночь.
      3. Подготовьте свежий Рабочий объем геномная ДНК извлечения буфер, содержащий 200 мкг/мл конечная концентрация K. протеиназы
        Примечание: Не используйте старый буфер для этого шага.
      4. Хлюпать каждый летать на 10 – 15 s с кончика пипетки, содержащие 50 мкл squishing буфера без дозирования жидкости. Распределить оставшиеся буфера в трубку и хорошо перемешать. Инкубируйте при 37 ° C для 20-30 мин.
      5. Положите труб в блоке 95 ° C тепла для 1 – 2 мин для инактивации K. протеиназы
      6. Уменьшается на 5 мин на 10000 x g. Храните подготовку на 4 ° C для дальнейшего анализа ПЦР.
  4. Используйте тот же метод для подготовки геномная ДНК от Нос Cas9 Муха, который служит в качестве отрицательного контроля. Выполните три шага ПЦР на основе экранов для определения правильного «концы,» использование HDR (рис. 2, рис. 5) геномная ДНК каждого мужчины F1 как шаблон5. Использовать 1 мкл ДНК prep в системе следующие реакции PCR: 10 мкл 2 x ПЦР Мастер микс с красителем, 1 мкл каждого праймера (10 мкм), 1 мкл шаблона дна и 7 мкл ddH2O.
  5. Как показано на рисунке 5А, выполните PCR используя праймеры fwd1 и rev1 экран для существования вставки или замены; Выполните ПЦР с помощью fwd2 и rev2 Праймеры для проверки вставки или замены из 3' региона; Выполняйте PCR используя праймеры M13F и rev3 проверить «заканчивается в» HDR (Таблица 1 c).
  6. Держите летать линии с подтвержденным HDR концы out и установить сбалансированные запасов от поколения F2. Подмес балансировки мух снова, чтобы удалить любые непреднамеренные мутации на другие хромосомы.
  7. Подготовить высококачественные геномная ДНК из установленных запасов для усиления длинные ПЦР (> 800 – 1000 nt) ампликон последовательность полимеразы Taq высокой точности и полностью проверить ампликонами, полученной геномной инженерии регионов. Кроме того, использовать экстракт сырой геномная ДНК как описано ранее для того чтобы усилить короче (< 800 nt), перекрытия продуктов ПЦР для проверки последовательности отредактированный генома. Чтобы подготовить хорошее качество дрозофилы геномной ДНК используйте следующий протокол:
    1. Положите около 25 взрослых мух в пробки microcentrifuge 1,5 мл и заморозить в морозильной камере-20 ° C или ° C-80 для по крайней мере 1 час.
    2. Добавить 250 мкл раствора A (рН 9,0 Tris-HCl 0,1 М, ЭДТА 0,1 М, SDS 1%).
    3. Однородный мух с помощью гомогенизации бабы в microcentrifuge трубы и положил трубку на льду.
    4. Инкубируйте на 70 ° C за 30 мин.
    5. Добавить 35 мкл KOAc (5 М), дрожание и перемешать хорошо, но делать не вихря.
    6. Инкубируйте на льду за 30 мин.
    7. Спина на 12000 g x 15 мин.
    8. С 1 мл микропипеткой тщательно передавать только ясно супернатант новой трубки, оставляя обратно любой преципитат или межфазное.
    9. Добавьте 150 мкл изопропанола супернатант. Аккуратно перемешать путем инверсии.
    10. Спина на 10000 x g за 5 мин.
    11. Тщательно удалить супернатант и оставить гранулы в трубку.
    12. Помыть лепешка с 1 мл 70% EtOH.
    13. Спина на 12000 x g за 5 мин.
    14. Удалите супернатант. Воздух сухой Пелле за 15-20 мин. Не более сухие гранулы.
    15. Растворяют гранулы в 100 мкл ddH2O.
    16. Используйте высококачественный ДНК-полимеразы, подходит для длительного ампликон (> 800 bp) для того чтобы усилить полный отредактированный региона. В идеале принять двух праймеров вне вставленной кассета для того чтобы усилить геномной региона. Гель очистить продукт PCR, и как было описано ранее, последовательность проверки продукт с нескольких перекрывающихся грунтовки.
  8. Проверьте правильное выражение пространственно-временных моделей из расчлененных тканей/эмбрионы инженерии летать линии:
    1. Выполните RT-PCR от всего РНК для проверки экспрессии мРНК гибридного продукта (Таблица 1 d).
    2. Выполните в situ гибридизация продукта mRNA интереса в личиночной тканей/эмбриона для проверки выражения.
    3. Экран для точное выражение ткани конкретных пространственно-временных структур среди проверить последовательность заканчивается вне линии, крест, каждая из строк редактируемого полученные двоичные выражения драйвера с LexO- GFP или LexO- RFP (для Лекса драйвер) линии (доступно из Блумингтон биржевых центров) и наблюдать за Лекса или Gal4 инициативе экспрессии гена репортера в эмбрион, личинок и взрослых тканях под флуоресцентным микроскопом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол был успешно использован для создания конкретного целевого двоичного выражения системы репортер на bnl , выражая клетки5. СНГ-регуляторных элементов (КРЕС), которые контролируют сложных пространственно-временных bnl выражение не отличаются. Таким образом для достижения пространственно-временных выражение под контролем регулирующих последовательности эндогенного bnl , только первый кодирования экзона bnl был ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Традиционно Drosophila enhancer ловушки были получены двумя различными способами. Один из способов включает случайные вставки водителя (например., Gal4) последовательность в геноме, транспонирования (например., P-элемент транспонирования)1 . Кроме того водитель последовательности могут находиться под контролем транскрипционный анализ предполагаемого усилитель/промоутер региона в конструкцию плазмиды, которые затем будут интегрированы в внематочная сайт генома

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим д-р F. порт, доктор K. о ' Коннор-Джайлс и д-р S. Фэн для обсуждения стратегии ТРИФОСФАТЫ; Д-р т.б. Корнберг и центр фондовой Блумингтон реагентов; UMD изображений основного фонда; и финансирование из низ: R00HL114867 и R35GM124878 в СР.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
X-Gal/IPTGGentrox (Genesee Scientific)18-218клонирование
LB-AgarBD DifcoBD  244520Клонирование
Tris-HClSigma AldrichT3253Молекулярная биология
EDTASigma AldrichE1161Молекулярная биология
NaClSigma AldrichS7653Молекулярная биология
Ультрачистая вода без ДНКазы/РНКазыThermoFisher Scientific10977-023Молекулярная биология
10% SDSSigma Aldrich71736Молекулярная биология
KOAcFisher-ScientificP1190Молекулярная биология
EtOHFisher-Scientific04-355-451Молекулярная биология
GeneJET MiniprepThermoFisher ScientificK0503Miniprep
PureLink HiPure Plasmid Maxipep наборыThermoFisher ScientificK210006Maxiprep
BbsINEBR0539SПраймеры фермента рестрикции
IDT-DNAPCR
pCFD4Kornberg LabDNA шаблон и вектор для гРНК
KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems)Kapa biosystemsKK2601PCR
Q5-высокая точность TaqNEBNEB #M0491PCR
Gibson Assembly Master MixNEB#E2611Сборка ДНК
pBPnlsLexA:p65UwAddgeneДНК-матрица для амплификации
LexA Proteinase KThermoFisher Scientific25530049Molecular Biology
2x PCR PreMix, с красителем (красный)SydlabMB067-EQ2Rгеля Molecular Biology
Zymo Research (Genesee Scientific)11-300Реактив
TRI для молекулярной биологииSigma-AldrichMolecular Biology
Наборы для очистки РНК Direct-zolZymo Research (Genesee Scientific)11-330Molecular Biology
OneTaq One-Step RT-PCR KitNEBE5315SMolecular Biology
lexO-CherryCAAXKornberg LabFly line
UAS-CD8:GFPKornberg labНахлыстовая леска
btl-Gal4Kornberg lab Flyline
MKRS/TB6BKornberg labFly line
Конфокальный микроскоп SP5XLeicaImaging Паттерн экспрессии
CO2 станцияGenesee Scientific59-122WCU
СтереомикроскопOlympusSZ-61Муха
Пестики для гомогенизации микротрубокFisher-Scientific03-421-217выделение геномной ДНК
NanoDrop спектрофотометрThermoFisher ScientificND-1000количественное определение ДНК
Набор для элюирования

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  2. Lai, S. -L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nature Neuroscience. 9 (5), 703-709 (2006).
  3. Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
  4. Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  5. Du, L., Zhou, A., Patel, A., Rao, M., Anderson, K., Roy, S. Generation of a targeted expression system for branchless and characterization of novel cellular expression patterns of the gene in Drosophila. Developmental Biology. 427 (1), 35-48 (2017).
  6. Port, F., Chen, H. -M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), E2967-E2976 (2014).
  7. Gratz, S. J., Rubinstein, C. D., Harrison, M. M., Wildonger, J., O'Connor-Giles, K. M. CRISPR-Cas9 Genome Editing in Drosophila. Current Protocols in Molecular Biology. 111 (1), 31.2.1-20 (2015).
  8. Doench, J. G., Hartenian, E., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
  9. Port, F., Bullock, S. L. Augmenting CRISPR applications in Drosophila with tRNA-flanked sgRNAs. Nature Methods. 13 (10), 852-854 (2016).
  10. Beumer, K. J., Trautman, J. K., Mukherjee, K., Carroll, D. Donor DNA Utilization During Gene Targeting with Zinc-Finger Nucleases. G3. 3 (4), Bethesda, Md. 657-664 (2013).
  11. Pfeiffer, B. D., Ngo, T. -T. B., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. 186 (2), 735-755 (2010).
  12. Lin, C. -C., Potter, C. J. Editing Transgenic DNA Components by Inducible Gene Replacement in Drosophila melanogaster. Genetics. 203 (4), 1613-1628 (2016).
  13. Li, W., Köster, J., et al. Quality control, modeling, and visualization of CRISPR screens with MAGeCK-VISPR. Genome Biology. 16 (1), 281(2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CRISPR Cas9DrosophilaGAL4 LexA

Похожие статьи