Method Article

Эффективная стратегия для генерации двоичного транскрипции ткани конкретных систем у дрозофилы путем изменения генома

DOI:

10.3791/58268

⸱

September 19th, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем метод для генерации двоичного транскрипции ткани конкретных систем у дрозофилы , заменив первый кодирования экзона генов с драйверами транскрипции. Метод на основе ТРИФОСФАТЫ/Cas9 места transactivator последовательность под эндогенного регулирования сменил гена и следовательно облегчает transctivator выражение исключительно в пространственно-временных структур ген специфического.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Системы Бинарные транскрипции являются мощные генетических инструменты широко используются для визуализации и обработки клеток судьба и ген выражение в конкретных группах клеток или тканей в модельных организмов. Эти системы содержат два компонента как отдельный трансгенных линий. Линии драйвер выражает transcriptional активатор под контролем ткани конкретных промоутеров/усилители и гаваней линии репортер/эффектор, целевого гена размещены ниже по течению на сайт связывания активатор транскрипции. Животные, укрывательство обоих компонентов побудить transactivation ткани конкретного целевого выражения гена. Точное пространственно-временных выражение гена в целевых тканях имеет решающее значение для объективное освещение деятельности клеток/ген. Таким образом разработка метода для создания эксклюзивных клеток/тканей конкретных драйверов линии имеет важное значение. Здесь мы представляем метод для создания системы весьма ткани конкретных целевых выражение, используя «кластерный регулярно Interspaced короткие палиндром Repeat/ТРИФОСФАТЫ связанные» (ТРИФОСФАТЫ/Cas)-основанные геном редактирования технику. В этом методе эндонуклеазы, которую Cas9 является объектом двух химерных руководство РНК (gRNA) на определенных сайтах в первом кодирования экзона гена в геном дрозофилы для создания двухнитевые разрывы (DSB). Впоследствии с помощью внешних доноров плазмида, содержащий последовательность transactivator, клетки автономного ремонт техники позволяет гомологии направленных ремонт (HDR) ОРС, в результате точного удаления и замены экзона с transactivator последовательности. Постучал в transactivator выражается исключительно в клетках где СНГ-регулирующие элементы заменены гена являются функциональными. Подробные пошаговые протокола, представленные здесь для генерации двоичного транскрипционный анализ драйверов, выраженные в ФБП дрозофилы/внеофисного-производящ клетки эпителия/нейронов может быть принят для любого выражения конкретных генов или ткани.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Генетических элементов для экспрессии целевых генов был хорошо развита у дрозофилы, что делает его одним из лучших систем модель для изучения функции генов, вовлеченных в самых разнообразных клеточных процессов. Двоичные выражения систем, таких как дрожжи Gal4/Уан (вверх по течению активации последовательности), впервые был принят для ткани конкретных усилитель треппинга и Джин которое в дрозофилы генетических модель1 (рис. 1). Эта система способствовала развитию большое количество методов, таких как пространственно-временных правил гиперэкспрессия генов, которое, нокаут в отдельных групп....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Проектирование и строительство gRNA выражение вектор

  1. Чтобы точно заменить долго определенную область экзона, используйте двойной gRNA подход6, в котором каждый gRNA можно конкретно два конца выбранной области интереса. Чтобы получить точное выражение пространственно-временных ген специфического драйвера, выберите два gRNA целевых сайтов в пределах первого кодирования экзона гена.
  2. Для Drosophila melanogasterвыберите gRNA целевых сайтов, используя средство оптимального целевого поиска flyCRISPR (http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/). Другие доступные ТРИФОСФАТЫ дизайн инструменты могут испо....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол был успешно использован для создания конкретного целевого двоичного выражения системы репортер на bnl , выражая клетки5. СНГ-регуляторных элементов (КРЕС), которые контролируют сложных пространственно-временных bnl выражение не отличаются. Таким образом для достижения пространственно-временных выражение под контролем регулирующих последовательности эндогенного bnl , только первый кодирования экзона bnl был .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Традиционно Drosophila enhancer ловушки были получены двумя различными способами. Один из способов включает случайные вставки водителя (например., Gal4) последовательность в геноме, транспонирования (например., P-элемент транспонирования)1 . Кроме того водитель последовательности могут находиться под контролем транскрипционный анализ предполагаемого усилитель/промоутер региона в конструкцию плазмиды, которые затем будут интегрированы в внематочная сайт генома

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим д-р F. порт, доктор K. о ' Коннор-Джайлс и д-р S. Фэн для обсуждения стратегии ТРИФОСФАТЫ; Д-р т.б. Корнберг и центр фондовой Блумингтон реагентов; UMD изображений основного фонда; и финансирование из низ: R00HL114867 и R35GM124878 в СР.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
X-Gal/IPTGGentrox (Genesee Scientific)18-218клонирование
LB-AgarBD DifcoBD  244520Клонирование
Tris-HClSigma AldrichT3253Молекулярная биология
EDTASigma AldrichE1161Молекулярная биология
NaClSigma AldrichS7653Молекулярная биология
Ультрачистая вода без ДНКазы/РНКазыThermoFisher Scientific10977-023Молекулярная биология
10% SDSSigma Aldrich71736Молекулярная биология
KOAcFisher-ScientificP1190Молекулярная биология
EtOHFisher-Scientific04-355-451Молекулярная биология
GeneJET MiniprepThermoFisher ScientificK0503Miniprep
PureLink HiPure Plasmid Maxipep наборыThermoFisher ScientificK210006Maxiprep
BbsINEBR0539SПраймеры фермента рестрикции
IDT-DNAPCR
pCFD4Kornberg LabDNA шаблон и вектор для гРНК
KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems)Kapa biosystemsKK2601PCR
Q5-высокая точность TaqNEBNEB #M0491PCR
Gibson Assembly Master MixNEB#E2611Сборка ДНК
pBPnlsLexA:p65UwAddgeneДНК-матрица для амплификации
LexA Proteinase KThermoFisher Scientific25530049Molecular Biology
2x PCR PreMix, с красителем (красный)SydlabMB067-EQ2Rгеля Molecular Biology
Zymo Research (Genesee Scientific)11-300Реактив
TRI для молекулярной биологииSigma-AldrichMolecular Biology
Наборы для очистки РНК Direct-zolZymo Research (Genesee Scientific)11-330Molecular Biology
OneTaq One-Step RT-PCR KitNEBE5315SMolecular Biology
lexO-CherryCAAXKornberg LabFly line
UAS-CD8:GFPKornberg labНахлыстовая леска
btl-Gal4Kornberg lab Flyline
MKRS/TB6BKornberg labFly line
Конфокальный микроскоп SP5XLeicaImaging Паттерн экспрессии
CO2 станцияGenesee Scientific59-122WCU
СтереомикроскопOlympusSZ-61Муха
Пестики для гомогенизации микротрубокFisher-Scientific03-421-217выделение геномной ДНК
NanoDrop спектрофотометрThermoFisher ScientificND-1000количественное определение ДНК
Набор для элюирования

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  2. Lai, S. -L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophil....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CRISPR Cas9Binary Transcription SystemTissue specific ExpressionDrosophila Genome EditingHomology directed RepairGuide RNA DesignTransactivator Knock inExon ReplacementSpatiotemporal RegulationGAL4 LexA System

Related Articles