Method Article

Высокоэффективные и масштабируемые направленного дифференцирования клинически совместимый роговицы послабляющие стволовых клеток эпителия от человеческих плюрипотентных стволовых клеток

DOI:

10.3791/58279

⸱

October 24th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1BioMediTech Institute, Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere, 2Department of Ophthalmology, SILK, Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол вводит метод простой двухступенчатый для дифференциации роговицы нейральные стволовые клетки эпителия от человеческих плюрипотентных стволовых клеток xeno - и фидер культуры клеток свободных условиях. Представленные здесь методы культуры клетки позволяют экономически эффективным, крупномасштабного производства клинической качества клеток роговицы клетки терапии применение.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Роговицы нейральные стволовые клетки эпителия (LESCs) несут ответственность за постоянно обновление эпителия роговицы и таким образом поддержание гомеостаза роговицы и четкость. Человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSC)-производных LESCs обеспечивают перспективный источник клеток для роговицы клеточной терапии замены. Неопределенным, культивированная культуры и дифференциации условия вызывают различия в результатах исследования и препятствуют клинический перевод hPSC производные терапии. Этот протокол обеспечивает воспроизводимость и эффективный метод для hPSC-LESC дифференциация xeno - и условиях подачи клеток бесплатно. Во-первых монослойном культивировании недифференцированные hPSC на рекомбинатных Ламинин-521 (LN-521) и определено hPSC средне служит основой для надежного производства высокого качества исходного материала для дифференцирования. Во-вторых быстрый и простой hPSC-LESC метод дифференциации дает LESC населения в всего 24 дней. Этот метод включает в себя четыре дня поверхности эктодермы индукции в подвеску с малых молекул, следуют адэрентных культуры фазы LN-521/коллаген IV сочетание матрицы в среде определенных эпителия роговицы дифференциации. Cryostoring и расширенной дифференциация далее очищает популяции клеток и позволяет банковских ячеек в больших количествах для продуктов терапия ячейки. Результате высокого качества hPSC-LESCs обеспечивают потенциальные стратегии Роман лечения для роговицы поверхности реконструкции для лечения дефицита нейральные стволовые клетки (LSCD).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Прозрачной роговицы в глазной поверхности позволяет свету войти сетчатки и предоставляет большинство преломляющей способности глаз. Внешний слой, пробужденные эпителия роговицы, непрерывно регенерируется путем нейральные стволовые клетки эпителия (LESCs). LESCs находятся в базальный слой послабляющие ниш на Корнеосклеральный перекрестке1,2. LESCs отсутствуют конкретные и уникальные маркеры, поэтому их идентификации требует более широкого анализа ряда putative маркеров. Эпителиальных транскрипционным фактором p63 и особенно N-неизлечимо усеченного Стенограмма альфа изоформы p63 (ΔNp63α), было предложено как соо....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Университет Тампере имеет одобрение Национального органа для судебно-медицинская дел Финляндии (Dnro 1426/32/300/05) для проведения исследований по человеческих эмбрионов. Институт также имеет поддержку заявления этического Комитета районной больницы Pirkanmaa, культура, и дифференцировать Госкомсанэпиднадзором линии (Skottman/R05116) и использовать hiPSC линии в офтальмологических исследований (Skottman/R14023). Для этого исследования были получены без новых клеточных линий.

Примечание: Протокол, в описанный основана на конкретных, коммерчески доступных hPSC и СМИ дифференцировки эпителия роговицы. Пожалуйста, обратитесь к Таблице ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

От hPSCs до hPSC-LESCs

Весь процесс от вызывающих дифференциация FF hPSCs для cryostoring hPSC-LESCs занимает около 3,5 недель. Схематический обзор метода дифференциации, подчеркнув его ключевые шаги представлены на рисунке 1A. Рисунок 1B показывает типичный морфологии клеточных популяций в различных фазах протокола. Представленные данные получены с Regea08/017 Госкомсанэп.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ожидаемый результат этого протокола является успешным и надежным поколения LESCs от одной ячейки приостановления FF hPSC в течение приблизительно 3,5 недель. Как эпителий роговицы развивается от поверхности эктодермы29, первый шаг протокола направлена на рулевое hPSCs к этой линии. Короткий 24 h индукции с преобразовывая фактор роста бета (TGF-β) антагонист SB-505124 и bFGF используются побудить эктодермы дифференциации, следуют 48 ч mesodermal БМП-4 Кью подтолкнуть клетки к поверхности эктодермы........

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследование было поддержано в Академии Финляндии (Грант № 297886), человека запасных частей программа Tekes, Финское агентство финансирования технологий и инноваций, Финский глаз и фонд банка тканей и финский культурный фонд. Авторы благодарят биомедицинских лаборантов Ути Мелин, Ханна Pekkanen, Эмма Vikstedt и Ути Хейккиля отличную техническую помощь и вклад в культуру клеток. Профессор Katriina Аалто-Сетала признается за предоставление hiPSC линии и BioMediTech Imaging основного фонда для предоставления оборудования для флуоресценции изображений.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Material/Reagent
1x DPBS, содержащий Ca2+ и Mg2+Gibco#14040-091
1x DPBS без Ca2+ и Mg2+Lonza#17-512F/12
100 мм чашка для клеточной культурыCorning CellBIND#3296Формат культурального сосуда для адгезивного hPSC-LESC дифференцировка
12-луночный планшетCorning CellBIND#3336Формат культурального сосуда для образцов IF
24-луночный планшетCorning CellBIND#3337Формат культурального сосуда для образцов IF
2-меркаптоэтанолGibco#31350-010
6-луночный планшет, сверхнизкое вложениеCorning Costar#3471Формат культурального сосуда для индукции в суспензии
культура Alexa Fluor 488 против мыши IgThermoFisher Scientific#A-21202Вторичное антитело для IF
Alexa Fluor 488 против кролика IgThermoFisher Scientific#A-21206Вторичное антитело для IF
Alexa Fluor 568 против козы IgThermoFisher Scientific#A-11057Вторичное антитело для IF
Alexa Fluor 568 против мыши IgThermoFisher Scientific#A-10037Вторичное антитело к
основному фактору роста фибробластов IF (bFGF, человек)PeproTech Inc.#AF-100-18BРекомбинантный человеческий FGF-basic без животного происхождения (154 а.а.з.)
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization solutionBD Biosciences#554722Фиксация и пермеабилизация раствор для проточной цитометрии
BD Perm/Wash BufferBD Biosciences#554723Промывочный буфер для проточной цитометрии
BlebbistatinSigma-Aldrich#B0560
Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4)PeproTech Inc.#120-05A
Бычий сывороточный альбумин (БСА)Sigma-Aldrich#A8022-100G
Антитело к цитокератину 12Santa Cruz Biotechnology#SC-17099Первичное антитело к IF
Антитело к цитокератину 14R& D Systems#MAB3164Первичное антитело к IF
Антитело к цитокератину 15ThermoFisher Scientific#MS-1068-PПервичное антитело к IF
CnT-30CELLnTEC Advanced Cell Systems AG#Cnt-30Питательная среда для адгезивной дифференцировки hPSC-LESC
Коллаген IV типа (человеческий)Sigma-Aldrich#C5533Плацентарный коллаген человека IV типа
CoolCell LX Контейнер для заморозкиSigma-Aldrich#BCS-405
CryoPure TubesSarsted#72.3801,6 мл Cryotube for hPSC-LESC Cryopreservation
Defined Trypsin InhibitorGibco#R-007-100
Essential 8 Flex Medium KitThermo Fisher Scientific#A2858501
GlutaMAXGibco#35050061
Ламинин 521Биоламина#Ln521Человеческий рекомбинантный ламинин 521
&Дельта; Np63α антителоBioCare Medical#4892Первичное антитело для антитела IF
OCT3/4R& D Systems#AF1759Первичное антитело для IF
p63α антителоТехнология клеточной сигнализации#ACI3066AПервичное антитело для IF
p63-α (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate)Технология клеточной сигнализации#56687p63-α PE-конъюгированное антитело для проточной цитометрии
PAX6 антителоSigma-Aldrich#HPA030775Первичное антитело к IF
Penicillin/StreptomycinLonza#17-602E
Параформальдегид (PFA)Sigma-Aldrich#158127Клеточный фиксатор для IF
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPIThermo Fisher Scientific#P36931DAPI монтант для жестких крепление для набора для
криоконсервации IF PSCThermo Fisher Scientific#A2644601
TrypLE Select EnzymeGibco#12563-011
KnockOut Dulbecco' s модифицированный Eagle' s mediumGibco#10829018
KnockOut SR XenoFree CTSGibco#10828028
MEM заменимые аминокислотыGibco#11140050
SB-505124Sigma-Aldrich#S4696
Triton X-100Sigma-Aldrich#T8787Пермеабилизатор для IF
VectaShieldVector Laboratories#H-1200Крепление DAPI для монтажа в жидкости для IF
>Name>CompanyНомер в каталогеComments
Equipment
Cytocentrifuge, e. CellSpin IITharmac
Проточный цитометр, <> например BD Accuri C6BD Biosciences
Флуоресцентный микроскоп, напримерOlympus IX 51Olympus

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. The British Journal of Ophthalmology. 89 (5), 529-532 (2005).
  2. Yazdanpanah, G., Jabbehdari, S., Djalilian, A. R.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Corneal Limbal Epithelial Stem CellsHuman Pluripotent Stem CellsDirected DifferentiationXeno Free CultureFeeder Cell FreeLaminin 521 Collagen IVEmbryoid Body FormationSurface Ectodermal InductionAdherent DifferentiationCryopreservation

Related Articles