Method Article

Высокоэффективные и масштабируемые направленного дифференцирования клинически совместимый роговицы послабляющие стволовых клеток эпителия от человеческих плюрипотентных стволовых клеток

DOI:

10.3791/58279

⸱

October 24th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1BioMediTech Institute, Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere, 2Department of Ophthalmology, SILK, Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол вводит метод простой двухступенчатый для дифференциации роговицы нейральные стволовые клетки эпителия от человеческих плюрипотентных стволовых клеток xeno - и фидер культуры клеток свободных условиях. Представленные здесь методы культуры клетки позволяют экономически эффективным, крупномасштабного производства клинической качества клеток роговицы клетки терапии применение.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Роговицы нейральные стволовые клетки эпителия (LESCs) несут ответственность за постоянно обновление эпителия роговицы и таким образом поддержание гомеостаза роговицы и четкость. Человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSC)-производных LESCs обеспечивают перспективный источник клеток для роговицы клеточной терапии замены. Неопределенным, культивированная культуры и дифференциации условия вызывают различия в результатах исследования и препятствуют клинический перевод hPSC производные терапии. Этот протокол обеспечивает воспроизводимость и эффективный метод для hPSC-LESC дифференциация xeno - и условиях подачи клеток бесплатно. Во-первых монослойном культивировании недифференцированные hPSC на рекомбинатных Ламинин-521 (LN-521) и определено hPSC средне служит основой для надежного производства высокого качества исходного материала для дифференцирования. Во-вторых быстрый и простой hPSC-LESC метод дифференциации дает LESC населения в всего 24 дней. Этот метод включает в себя четыре дня поверхности эктодермы индукции в подвеску с малых молекул, следуют адэрентных культуры фазы LN-521/коллаген IV сочетание матрицы в среде определенных эпителия роговицы дифференциации. Cryostoring и расширенной дифференциация далее очищает популяции клеток и позволяет банковских ячеек в больших количествах для продуктов терапия ячейки. Результате высокого качества hPSC-LESCs обеспечивают потенциальные стратегии Роман лечения для роговицы поверхности реконструкции для лечения дефицита нейральные стволовые клетки (LSCD).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Прозрачной роговицы в глазной поверхности позволяет свету войти сетчатки и предоставляет большинство преломляющей способности глаз. Внешний слой, пробужденные эпителия роговицы, непрерывно регенерируется путем нейральные стволовые клетки эпителия (LESCs). LESCs находятся в базальный слой послабляющие ниш на Корнеосклеральный перекрестке1,2. LESCs отсутствуют конкретные и уникальные маркеры, поэтому их идентификации требует более широкого анализа ряда putative маркеров. Эпителиальных транскрипционным фактором p63 и особенно N-неизлечимо усеченного Стенограмма альфа изоформы p63 (ΔNp63α), было предложено как соответствующие позитивные LESC маркер3,4. Асимметричным разделением LESCs позволяет им самостоятельно обновить, но и производят потомство, что перенос centripetally и кпереди. Как клетки прогресса к поверхности роговицы, они постепенно теряют свою stemness и наконец неизлечимо дифференцировать в поверхностные клетки плоского эпителия, которые постоянно теряются от поверхности роговицы.

Повреждение в любом из слоев роговицы может привести к тяжелой зрительные нарушения, и дефекты роговицы, таким образом, одной из ведущих причин потери зрения во всем мире. В дефицит нейральные стволовые клетки (LSCD) лимба уничтожается болезнь или травма, которая приводит к conjunctivalization и помутнение роговицы поверхности и последующая утрата зрения5,6. Клеточная терапия замены с помощью аутологичных и аллогенных послабляющие графтов предлагает стратегии лечения для пациентов с LSCD4,,78,9. Однако уборки аутологичных трансплантатов несет риск осложнений для здорового глаза, и донорской ткани не хватает. Человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs), специфически человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs), может служить неограниченный источник типов клинически значимых клеток, включая роговицы эпителиальных клеток. Таким образом hPSC производные LESCs (hPSC-LESCs) представляют собой привлекательный новый источник клеток для глазной клеточной терапии замены.

Традиционно недифференцированные hPSC культура методы и их дифференциация протоколы для LESCs полагаются на использование неопределенных фидер клетки, животных сера, кондиционером СМИ или амниотической мембраны10,11, 12 , 13 , 14 , 15. Недавно, усилия в направлении безопасные продукты терапии клеток побудили Поиск более стандартизированных и бесплатная xeno протоколы культуры и дифференциации. В результате несколько определенных и xeno бесплатные методы для долгосрочного культуры недифференцированные hPSCs в настоящее время коммерчески доступных16,17,18. Как континуум, направленного дифференцирования, протоколы, полагаясь на молекулярные сигналы для руководства hPSCs эпителия роговицы судьбы были недавно представил19,,21,20,22, 23. Еще многие из этих протоколов используется либо неопределенным, hPSCs на основе подачи как начиная материал, или комплекс, культивированная фактор роста коктейли для дифференциации.

Этот протокол предназначен для предоставления надежной, оптимизированный, xeno- и фидер свободный hPSC культуры метода и последующего дифференциации роговицы LESCs. Однослойная культуре плюрипотентных hPSCs на Ламинин-521 (LN-521) матрицы в среде определенных, альбумин бесплатные hPSC (в частности основных Flex 8) позволяет быстрое производство однородной исходным материалом для дифференцирования. После простой, двухступенчатый дифференциации стратегия руководства hPSCs к поверхности эктодермы судьба в суспензии, следуют адэрентных дифференциации в LESCs. Популяции клеток, где > 65% Экспресс ΔNp63α получается в течение 24 дней. Xeno - и фидер свободно протокол был протестирован с несколькими линиями hPSC (ЭСК и hiPSCs), без требования для оптимизации конкретной линии клеток. Протоколы для свободной выходные обслуживания, пассированый, cryostoring и hPSC-LESC фенотип, описанные здесь позволяют производство больших серий LESCs высокого качества для клинических или исследовательских целях.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Университет Тампере имеет одобрение Национального органа для судебно-медицинская дел Финляндии (Dnro 1426/32/300/05) для проведения исследований по человеческих эмбрионов. Институт также имеет поддержку заявления этического Комитета районной больницы Pirkanmaa, культура, и дифференцировать Госкомсанэпиднадзором линии (Skottman/R05116) и использовать hiPSC линии в офтальмологических исследований (Skottman/R14023). Для этого исследования были получены без новых клеточных линий.

Примечание: Протокол, в описанный основана на конкретных, коммерчески доступных hPSC и СМИ дифференцировки эпителия роговицы. Пожалуйста, обратитесь к Таблице материалы для производителя/поставщика информации и Каталог номеров.

1. Создание Xeno - и фидер свободно hPSC культуры

  1. Подготовка
    1. Герб 24-ну пластины с человеческого рекомбинантного Ламинин-521 (LN-521). Для первого прохода фидер бесплатно (FF) используйте LN-521 в концентрации 1.09 мкг/см2и на 0,55 мкг/см2 для следующих отрывков. Предлагаемые концентрации LN-521 служат отправной точкой для успешной культуры FF, но может быть снижена.
      1. Оттепель LN-521 пузырек медленно на 4 ° C, как указано в инструкции изготовителя.
        Примечание: Надлежащим образом обрабатываются пер-521 раствор можно хранить при 4 ° C на срок до 3 месяцев после оттаивания.
      2. Подготовить раствор для нанесения покрытия, разбавляют соответствующее количество LN-521 Стоковый раствор с 1 x Дульбекко Phosphate-Buffered соли (DPBS) содержащий Ca2 + и Mg2 + к общим объемом 300 мкл в колодец.
      3. Накапайте раствор для нанесения покрытия к скважинам, печать также пластины с парафина и инкубировать на ночь при 4 ° C. Пластины с покрытием может храниться при температуре 4 ° C до 2 недель.
        (Необязательно): в качестве альтернативы, для быстрого покрытия протокола, инкубировать также пластины с покрытием решение для 2 ч при 37 ° C, 5% CO2.
    2. Подготовка hPSC питательной среды (специально важным 8 Flex), дополняя базальной среднего условии дополнения, как указано заводом-изготовителем. Добавьте 50 ед/мл пенициллин стрептомицином. Обратите внимание, что формулировка является чувствительной к света и высоких температур. Оттепель дополнения и теплый СМИ при комнатной температуре (RT), защищены от света. Используйте средство дополнено hPSC в течение двух недель от даты добавок.
  2. Передача hPSC FF культуры на LN-521
    1. Предварительно теплой, все необходимые материалы и реагенты для RT в Ламинарный шкаф.
    2. HPSCs проход от стандартных культуры системы подачи слои (например инактивированных человека крайней плоти (hFF) или мыши эмбриональных фибробластов), или других систем культуры FF, с использованием стандартной методологии. Например hPSC колонии, культивируемых на клетки фидера hFF можно расчленены на мелкие кусочки с помощью скальпеля и кусочки, затем отсоединить с кончиком иглы. Человека Чок, культивируемых с использованием систем FF культуры могут быть переданы с помощью кластера, пассированый метод с или без предварительного фермента лечения.
    3. Удаление решения покрытие LN-521 от 24-скважин и добавьте среднего подогретым hPSC 1 мл за хорошо.
      Примечание: Не позволяют скважин для сухой, как LN-521 будут деактивируют при высыхании.
    4. Передавать кластеры штук/клеток колонии LN-521 с покрытием 24-колодцев в hPSC среде с пипеткой. Передача 20 – 30 штук колонии в колодец, избегая переполненности скважин.
    5. Замените носитель 1 мл hPSC среднего день после передачи и каждый день после этого. Культуры готовы пассированый 3 – 4 дня спустя, как hPSCs выросли из колоний с гладкой, недифференцированные морфологии. Для справки, см. Рисунок 1B (первый рисунок). Для первого прохода FF колоний не должно быть позволено расти к полностью вырожденная монослоя, но культур должно быть пассированной когда колонии достигают приблизительный размер 1 мм.
  3. Пассированый и поддержание FF hPSC культуры
    1. Предварительно теплой, все необходимые материалы и реагенты для RT в Ламинарный шкаф.
    2. От второй проход FF начиная проход FF hPSCs, когда культура достигла 80-100% confluency. FF hPSCs проход к новым LN-521 с покрытием 24-ну пластины, используя одну ячейку пассированый два раза в неделю (по понедельникам и четвергам) для поддержания высокого качества культур с недифференцированными морфологии и добиться выходные свободный режим кормления. Для подробной информации пожалуйста, обратитесь к18,24,25.
      1. Промойте FF hPSCs дважды с 1 мл раствора 1 x DPBS без Ca2 + и Mg2 +.
      2. Отсоедините hPSCs FF с xeno бесплатно трипсина ЭДТА (в частности трехкратная выберите фермент), инкубирования 500 мкл в скважину при 37 ° C, 5% CO2. Для оптимальной инкубации время позволяют клеткам для округления, но не для того, чтобы отсоединить. Обычно это занимает 3 мин при 37 ° C, 5% CO2 (не превышает 5 мин).
      3. Удаление свободных xeno трипсина ЭДТА и сразу же добавить 500 мкл на хорошо ингибитора трипсина определенных.
      4. Отсоедините FF hPSCs, тщательное, но тщательно закупорить получить одну ячейку подвеска. Перенесите FF hPSC подвеска через стрейнер клеток 40 мкм в 15 мл конические пластиковых пробирок, содержащие подогретым hPSC среднего.
      5. Промыть лунки с 1 мл hPSC среды и добавьте Стиральная среднего конические пластиковых пробирок 15мл.
      6. Центрифуга одноклеточного подвеска для 5 мин на 300 x g, аспирационная Пелле ячейки и Ресуспензируйте в 1 мл подогретым hPSC среде.
      7. Подсчет количества ячеек с Горяева или счетчик автоматизированных клеток.
      8. Удалите покрытие решение LN-521 (0,55 мкг/см2) из скважин-24 и добавьте среднего hPSC как 1.2.3.
      9. FF hPSCs пластины на 0,55 мкг/см2 LN-521 с покрытием 24-скважины, плотность клеток 40 000 – 50 000 клеток/см2.
      10. Замените средний средний свежие hPSC на следующий день после пассированый и каждый день после этого за исключением воскресенья.
    3. Клетки готовы быть использованы для дифференциации 3-4 дней после пассированый, когда культура достигла > 85% confluency. Для обеспечения высокого качества hPSCs, обратитесь к характеристика методов, подробно описаны в предыдущих работ18,24,-25. Это рекомендуется только культуры hPSCs до прохождения уровня 15 в системе FF, используя одну ячейку, пассированый избежать karyotypic изменений. Используйте только высокого качества, недифференцированные hPSCs как исходный материал для дифференцирования.

2. дифференциация и криоконсервацию hPSC производные LESCs

  1. Подготовка
    1. Подготовка среднего xeno бесплатно базальной индукции (базальный индукции средний): дополнение Дульбекко изменение средних орла (специально нокаут DMEM) с 15% сыворотки xeno бесплатная замена (spesifically CTS нокаут SR XenoFree), 2 мм L-глютамином, 0,1 мм 2 - меркаптоэтанол, 1% несущественные аминокислот и 50 ед/мл пенициллин стрептомицином. Используйте средство базальной индукции в течение двух недель.
    2. Подготовьте СМИ для роговицы индукции в культуре подвеска.
      1. День 1: Дополнение базальной индукции средний с 5 мкм blebbistatin.
      2. День 2: Дополнение базальной индукции средний с 10 фактор роста фибробластов человека базовых данных мкм SB-505124 и 50 нг/мл (bFGF).
      3. 3-4 день: дополнение базальной индукции средний с 25 нг/мл костный морфогенетический белок 4 (BMP-4).
    3. Подготовка среднего дифференцировки эпителия роговицы (дифференциация средний, специально CnT-30) для адэрентных культуры: добавки в базальной среднего согласно инструкциям производителя и добавить 50 ед/мл пенициллин стрептомицином.
      Примечание: Дифференциации среднего формулировка чувствителен к свету. Используйте дополнение дифференциации среднего в течение 6 недель с даты добавок.
    4. Слой блюда культуры ткани 100 мм для адэрентных дифференциации (см. шаг 2.3) с смесь 5 мкг/см2 человеческого плацентарного коллаген типа IV (col IV) и 0,5 мкг/см2 LN-521 разводят в 1 x DPBS содержащий Ca2 + и Mg2 +, в общей сложности объем покрытия 5 мл на блюдо. Готовить и хранить покрытий с col IV и LN-521, как описано в 1.1.1.3.
  2. Этап I: роговицы индукции в культуре подвеска
    1. Предварительно теплой, все необходимые материалы и реагенты для RT в Ламинарный шкаф.
    2. Отсоедините FF hPSCs в одну ячейку подвеска с xeno бесплатно трипсина ЭДТА, как описано в шагах 1.3.2.1–1.3.2.6. Подсчет количества ячеек и распространять 2-3 х 106 клеток / низким насадку, плита 6-ну ну, в общем объеме 3 мл среды базальной индукции, дополнена 5 мкм blebbistatin побудить EB формирования ночь при 37 ° C, 5% CO2 (1 день).
    3. На следующий день (день 2) удалите среды и замените 3 мл среды базальной индукции, дополнена 10 мкм bFGF SB-505124 и 50 нг/мл.
    4. Следующие два дня (3-4 дней), удалите среды и замените 3 мл среды базальной индукции, дополнена 25 нг/мл BMP-4.
  3. Этап II: Роговицы дифференциации в адэрентных культуре
    1. Предварительно теплой, все необходимые материалы и реагенты для RT в Ламинарный шкаф.
    2. На 5 день плите EBs вниз на 100 мм культуры ткани блюда с 5 мкг/см2 col IV и 0,5 мкг/см2 LN-521 покрытием.
      1. Удалите покрытие решение от 100 мм культуры ткани блюда и добавляют 10 мл подогретым дифференциации среднего за блюдо.
        Примечание: Не позволяют блюда для сухой, как LN-521 будут деактивируют при высыхании.
      2. Передача EBs от одной пластины 6-а также от двух до трех блюд культуры ткани 100 мм (примерно 50 EBs на2см), закупорить. Равномерно распределите EBs мягкий встряхивания.
    3. Сохраняйте клетки адэрентных культуры при 37 ° C, 5% CO2, заменив среды с 10 мл свежего дифференциации среднего три раза в неделю (в понедельник, среду и пятницу) для следующего 2,5-3 недели. Проверьте ячейки регулярно для формирования правильного эпителиальных морфологии, с использованием фазы контраста Микроскоп.
  4. Этап III: Крио банкинг hPSC производные LESCs
    1. Предварительно теплой, все необходимые материалы и реагенты для RT в Ламинарный шкаф, за исключением среднего криоконсервирования, которая должна быть предварительно охлажденным.
    2. Отсоедините hPSC производные LESCs с xeno бесплатно трипсина ЭДТА и подсчитать количество ячеек, как описано для FF hPSCs в 1.3.2.1–1.3.2.6 шаги, но с использованием дифференциации среднего.
      Примечание: Для hPSC производные LESCs, длиннее время оптимальной инкубации с xeno бесплатно трипсина ЭДТА (около 5 минут). Используйте 3 мл xeno бесплатно трипсина ЭДТА и ингибитор трипсина определенных на 100 мм блюдо.
    3. После подсчета клетки, повторите центрифугирования за 5 мин на 300 x g, аспирационная среднего и Ресуспензируйте Пелле клеток в среде криоконсервирования предварительно охлажденные, xeno бесплатные hPSC. Накапайте сингл ячейки подвеска в cryotubes так что каждый cryotube содержит 0,5 до 1 x 106 клеток в 1 мл криоконсервирования среде.
    4. Место труб в заморозки контейнера и передачи немедленно (в течение 5 мин) до-80 ° C на ночь.
    5. На следующий день передачи трубы для жидкого азота для длительного хранения.
  5. Шаг IV: Оттаивания криоконсервированных hPSC-LESCs
    1. До оттаивания, пальто блюда/также пластины с 5 мкг/см2 col IV и 0,5 мкг/см2 LN-521.
    2. Предварительно теплой, все необходимые материалы и реагенты для RT в Ламинарный шкаф.
    3. Удалите покрытие решения из блюда/скважин и добавьте соответствующий объем подогретым дифференциации среднего.
      Примечание: Не позволяют блюда для сухой, как LN-521 будут деактивируют при высыхании.
    4. Оттепель клетки быстро на RT и немедленно передать 15 мл конические пластиковых пробирок, содержащих 5 мл подогретым дифференциации среднего суспензию клеток.
    5. Центрифуга суспензию клеток 5 мин при 300 x g, аспирационная, и Ресуспензируйте гранулы в дифференциации среднего для удаления любой среде криоконсервирования.
    6. Пластина клетки на лунках/блюда с 5 мкг/см2 col IV и 0,5 мкг/см2 LN-521, в среде дифференциация на плотности 40 000 – 50 000 клеток/см2. Сохранить клетки при 37 ° C, 5% CO2, заменив дифференциации среднего три раза в неделю.

3. фенотипа hPSC производные LESCs

  1. Анализ качественного иммунофлуоресценции
    1. Для иммунофлюоресценции, пальто 24 - или 12-ну лунках с 5 мкг/см2 col IV и 0,5 мкг/см2 LN-521 и пластины/оттаивания hPSC-LESCs в среде дифференциация на плотности 40 000 – 50 000 клеток/см2.
    2. Когда культуры достигли confluency, исправить клетки с параформальдегида 4% (PFA): Промыть лунки дважды с 1 x DPBS без Ca2 + и Mg2 +и инкубировать 15-20 мин с 4% ПФА в рт. После этого мыть дважды с 1 x DPBS чтобы удалить любые остатки PFA. Использование 0,5-1 мл растворов в колодец.
      Примечание: Фиксированные клетки могут храниться в 1 x DPBS при температуре 4 ° C до одной недели до окрашивания.
      Предупреждение: PFA, токсичные и коррозионные. Обрабатывать ПФА в зонта и носить защитную одежду, защитные очки и перчатки.
    3. Аспирационная 1 x DPBS и разрушения мембран клеток путем инкубации на 10-15 мин с 0.1% тритон X-100 в 1 x DPBS.
    4. Аспирационная 0,1% тритон X-100 и блок сайтов связывания неспецифических антитела путем инкубации 1 h с 3% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в 1 x DPBS на RT. Prepare основное антитело разведений в 0,5% BSA в 1 x DPBS.
      Примечание: См. таблицу 1 Рекомендуемая первичных антител.
    5. Аспирационная 3% BSA и проинкубируйте с надлежащим образом разреженных основное антитело на ночь при 4 ° C.
    6. Промыть лунки 3 x 5 минут с 1 x DPBS. Готовить вторичные антитела разведений в 0,5% BSA в 1 x DPBS.
      Примечание: См. таблицу 1 Рекомендуемая вторичные антитела.
    7. Аспирационная 1 x DPBS и проинкубируйте с подходящим, надлежащим образом разреженных вторичное антитело для 1 h на RT, защищенном от света.
      Примечание: От этого шага на Держите образцы, защищенном от света, чтобы предотвратить выцветание флуоресцентных красителей.
    8. Промыть лунки 3 x 5 мин с 1 x DPBS и, наконец, изображение ядер с 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) и гора с флуоресценцией монтаж средств массовой информации. DAPI может использоваться отдельно согласно инструкции производителя или включены в среде монтажа. Места вокруг coverslips (диаметр 19 мм, 13 мм для 12 - и 24-ну плиты, соответственно) в каждой скважине. Следуйте инструкциям производителя относительно сушки и хранения установлены образцы.
    9. Изображение окрашенных клеток с флуоресцентный Микроскоп.
  2. Анализ количественных иммунофлуоресценции
    1. Подготовка образцов cytospin hPSC производные LESCs на объект очки.
      1. Отсоедините hPSC производные LESCs с xeno бесплатно трипсина ЭДТА и подсчитать количество ячеек, как описано в шаге 2.4.2.
      2. После подсчета, добавьте предварительно охлажденные 1 x DPBS и центрифуги для 5 мин на 300 x g. Отрегулируйте громкость образца и концентрации клеток согласно инструкциям производителя данного cytocentrifuge, например 50000-100000 клеток в объеме 150 мкл пример.
      3. Спиновые клетки до объекта очки с cytocentrifuge например 5 минут 28 x g и исправить сразу на 15-20 мин с 4% ПФА в 1 x DPBS на RT. За время рекомендованные спиннинг и скорость обратитесь к инструкции по эксплуатации данного cytocentrifuge.
    2. Перейти к пятнать cytospin образцы, как описано в шаги 3.1.3–3.1.8 использования жидкого блокатор перо окружают образцы с гидрофобным круга и провести окрашивание в капли для экономической практики. Моет может осуществляться в контейнерах с держателями слайд, с тем чтобы обеспечить эффективное удаление избыточного антител и минимальным фон окраски. Изображение ядер с DAPI и смонтировать окрашенных образцов с флуоресценцией монтаж средств массовой информации, охватывающих с coverslips. Следуйте инструкциям производителя относительно сушки и хранения установлены образцы.
    3. 5 – 10 снимков на сэмпл из случайно выбранных местоположений с помощью например 10 крат флуоресцентным микроскопом.
    4. Оцените процент положительно окрашенных клеток по отношению к общей (DAPI положительным) клетки, например с ImageJ обработки изображений и анализа инструментов программного обеспечения (https://imagej.nih.gov/ij/). Желательно проанализировать > 500 клеток на сэмпл.
      1. Откройте изображение, будут проанализированы в ImageJ программного обеспечения. Дублировать изображение и фильтр с гауссова размытия по умолчанию для удаления шума.
      2. Создание порог. Настроить пороговые значения для оптимального выбора положительно окрашенных клеточных ядер и применять. Повторяющиеся изображения теперь преобразуется в двоичное представление.
      3. Процесс двоичное изображение с двоичной обработки инструментов «Заполнить дыры» и «Водораздел», который будет автоматически отдельных слияния областей, представляющих одного ядра.
      4. Используйте средство «Анализ частиц» автоматически список областей интересов (ROI) в окне диспетчера ROI, который будет открыт после применения команды. Закройте двоичного образа.
      5. Визуализируйте ROIs в исходное изображение, выбрав «Показать все» в менеджере ROI. Подтверждение правильного выбора окрашенных клеточных ядер и при необходимости вручную удалить и добавить индивидуальный выбор.
  3. Анализ потока цитометрии
    1. Для подтверждения уровня выражение p63α, пятно клетки для проточной цитометрии.
      1. Отсоедините hPSC производные LESCs с xeno бесплатно трипсина ЭДТА и подсчитать количество ячеек, как описано в шаге 2.4.2.
      2. Вымыть клетки дважды с 1 мл раствора предварительно охлажденные 1 x DPBS и центрифуги для 5 мин на 300 x g. исправить и разрушения с готовым фиксация/permeabilization решение для 20 мин при 4 ° C. После этого вымыть клетки дважды с 1 мл раствора предварительно охлажденный 1 x permeabilizing мыть буфера.
        Примечание: Этот шаг на держите клетки на 4 ° C или на льду, если не указано иное.
      3. Предупреждение: Фиксация/permeabilization решение содержит 4,2% формальдегида. Обработка опасных решение в зонта и носить защитную одежду, защитные очки и перчатки.
      4. Разделите образцы на 5 мл полипропиленовые трубы. Каждый образец должен содержать 100 000 – 200 000 клеток и объем образца должна быть скорректирована с приблизительно 100 мкл 1 x мыть буфера.
      5. 2 мкл флюрохром конъюгированных антител СУИМ Р63 α (рекомендуется антитела, см. в таблице оборудования и материалов) в образце трубы. Оставьте один образец незапятнанное в качестве отрицательного контроля. Вихревой образцы и инкубировать 1 час на RT, защищенном от света.
      6. Вымыть клетки дважды с 1 мл раствора предварительно охлажденные 1 x мыть буфера и наконец, Ресуспензируйте окатышей с 300 мкл буфера. Храните трубы на льду, защищенном от света.
    2. Анализ образцов с проточный цитометр. Используйте образец неокрашенных отрицательный контроль для стробирования населения правильные ячейки и исключая флюоресцентный фон сигнала. Анализировать как минимум 10 000 Р63 α-окрашенных клеток. Для детальной технической реализации пожалуйста, обратитесь к руководству пользователя данного проточный цитометр.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

От hPSCs до hPSC-LESCs

Весь процесс от вызывающих дифференциация FF hPSCs для cryostoring hPSC-LESCs занимает около 3,5 недель. Схематический обзор метода дифференциации, подчеркнув его ключевые шаги представлены на рисунке 1A. Рисунок 1B показывает типичный морфологии клеточных популяций в различных фазах протокола. Представленные данные получены с Regea08/017 Госкомсанэп...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ожидаемый результат этого протокола является успешным и надежным поколения LESCs от одной ячейки приостановления FF hPSC в течение приблизительно 3,5 недель. Как эпителий роговицы развивается от поверхности эктодермы29, первый шаг протокола направлена на рулевое hPSCs к этой линии. Короткий 24 h индукции с преобразовывая фактор роста бета (TGF-β) антагонист SB-505124 и bFGF используются побудить эктодермы дифференциации, следуют 48 ч mesodermal БМП-4 Кью подтолкнуть клетки к поверхности эктодермы....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследование было поддержано в Академии Финляндии (Грант № 297886), человека запасных частей программа Tekes, Финское агентство финансирования технологий и инноваций, Финский глаз и фонд банка тканей и финский культурный фонд. Авторы благодарят биомедицинских лаборантов Ути Мелин, Ханна Pekkanen, Эмма Vikstedt и Ути Хейккиля отличную техническую помощь и вклад в культуру клеток. Профессор Katriina Аалто-Сетала признается за предоставление hiPSC линии и BioMediTech Imaging основного фонда для предоставления оборудования для флуоресценции изображений.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Material/Reagent
1x DPBS, содержащий Ca2+ и Mg2+Gibco#14040-091
1x DPBS без Ca2+ и Mg2+Lonza#17-512F/12
100 мм чашка для клеточной культурыCorning CellBIND#3296Формат культурального сосуда для адгезивного hPSC-LESC дифференцировка
12-луночный планшетCorning CellBIND#3336Формат культурального сосуда для образцов IF
24-луночный планшетCorning CellBIND#3337Формат культурального сосуда для образцов IF
2-меркаптоэтанолGibco#31350-010
6-луночный планшет, сверхнизкое вложениеCorning Costar#3471Формат культурального сосуда для индукции в суспензии
культура Alexa Fluor 488 против мыши IgThermoFisher Scientific#A-21202Вторичное антитело для IF
Alexa Fluor 488 против кролика IgThermoFisher Scientific#A-21206Вторичное антитело для IF
Alexa Fluor 568 против козы IgThermoFisher Scientific#A-11057Вторичное антитело для IF
Alexa Fluor 568 против мыши IgThermoFisher Scientific#A-10037Вторичное антитело к
основному фактору роста фибробластов IF (bFGF, человек)PeproTech Inc.#AF-100-18BРекомбинантный человеческий FGF-basic без животного происхождения (154 а.а.з.)
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization solutionBD Biosciences#554722Фиксация и пермеабилизация раствор для проточной цитометрии
BD Perm/Wash BufferBD Biosciences#554723Промывочный буфер для проточной цитометрии
BlebbistatinSigma-Aldrich#B0560
Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4)PeproTech Inc.#120-05A
Бычий сывороточный альбумин (БСА)Sigma-Aldrich#A8022-100G
Антитело к цитокератину 12Santa Cruz Biotechnology#SC-17099Первичное антитело к IF
Антитело к цитокератину 14R& D Systems#MAB3164Первичное антитело к IF
Антитело к цитокератину 15ThermoFisher Scientific#MS-1068-PПервичное антитело к IF
CnT-30CELLnTEC Advanced Cell Systems AG#Cnt-30Питательная среда для адгезивной дифференцировки hPSC-LESC
Коллаген IV типа (человеческий)Sigma-Aldrich#C5533Плацентарный коллаген человека IV типа
CoolCell LX Контейнер для заморозкиSigma-Aldrich#BCS-405
CryoPure TubesSarsted#72.3801,6 мл Cryotube for hPSC-LESC Cryopreservation
Defined Trypsin InhibitorGibco#R-007-100
Essential 8 Flex Medium KitThermo Fisher Scientific#A2858501
GlutaMAXGibco#35050061
Ламинин 521Биоламина#Ln521Человеческий рекомбинантный ламинин 521
&Дельта; Np63α антителоBioCare Medical#4892Первичное антитело для антитела IF
OCT3/4R& D Systems#AF1759Первичное антитело для IF
p63α антителоТехнология клеточной сигнализации#ACI3066AПервичное антитело для IF
p63-α (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate)Технология клеточной сигнализации#56687p63-α PE-конъюгированное антитело для проточной цитометрии
PAX6 антителоSigma-Aldrich#HPA030775Первичное антитело к IF
Penicillin/StreptomycinLonza#17-602E
Параформальдегид (PFA)Sigma-Aldrich#158127Клеточный фиксатор для IF
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPIThermo Fisher Scientific#P36931DAPI монтант для жестких крепление для набора для
криоконсервации IF PSCThermo Fisher Scientific#A2644601
TrypLE Select EnzymeGibco#12563-011
KnockOut Dulbecco' s модифицированный Eagle' s mediumGibco#10829018
KnockOut SR XenoFree CTSGibco#10828028
MEM заменимые аминокислотыGibco#11140050
SB-505124Sigma-Aldrich#S4696
Triton X-100Sigma-Aldrich#T8787Пермеабилизатор для IF
VectaShieldVector Laboratories#H-1200Крепление DAPI для монтажа в жидкости для IF
>Name>CompanyНомер в каталогеComments
Equipment
Cytocentrifuge, e. CellSpin IITharmac
Проточный цитометр, <> например BD Accuri C6BD Biosciences
Флуоресцентный микроскоп, напримерOlympus IX 51Olympus

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. The British Journal of Ophthalmology. 89 (5), 529-532 (2005).
  2. Yazdanpanah, G., Jabbehdari, S., Djalilian, A. R. Limbal and corneal epithelial homeostasis. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 348-354 (2017).
  3. Di Iorio, E., Barbaro, V., Ruzza, A., Ponzin, D., Pellegrini, G., De Luca, M. Isoforms of DeltaNp63 and the migration of ocular limbal cells in human corneal regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9523-9528 (2005).
  4. Rama, P., Matuska, S., Paganoni, G., Spinelli, A., De Luca, M., Pellegrini, G. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. The New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).
  5. Notara, M., et al. In sickness and in health: Corneal epithelial stem cell biology, pathology and therapy. Experimental Eye Research. 90 (2), 188-195 (2010).
  6. Osei-Bempong, C., Figueiredo, F. C., Lako, M. The limbal epithelium of the eye--a review of limbal stem cell biology, disease and treatment. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 35 (3), 211-219 (2013).
  7. Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency. Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).
  8. Sangwan, V. S., et al. Clinical outcomes of xeno-free autologous cultivated limbal epithelial transplantation: a 10-year study. The British Journal of Ophthalmology. 95 (11), 1525-1529 (2011).
  9. Basu, S., Mohan, S., Bhalekar, S., Singh, V., Sangwan, V. Simple limbal epithelial transplantation (SLET) in failed cultivated limbal epithelial transplantation (CLET) for unilateral chronic ocular burns. The British Journal of Ophthalmology. , (2018).
  10. Ahmad, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial-like cells by in vitro replication of the corneal epithelial stem cell niche. Stem Cells. 25 (5), 1145-1155 (2007).
  11. Hanson, C., et al. Transplantation of human embryonic stem cells onto a partially wounded human cornea in vitro. Acta Ophthalmologica. 91 (2), 127-130 (2013).
  12. Hayashi, R., et al. Generation of corneal epithelial cells from induced pluripotent stem cells derived from human dermal fibroblast and corneal limbal epithelium. PLoS ONE. 7 (9), e45435(2012).
  13. Hewitt, K. J., Shamis, Y., Carlson, M. W., Aberdam, E., Aberdam, D., Garlick, J. A. Three-dimensional epithelial tissues generated from human embryonic stem cells. Tissue Engineering. Part A. 15 (11), 3417-3426 (2009).
  14. Shalom-Feuerstein, R., et al. Pluripotent stem cell model reveals essential roles for miR-450b-5p and miR-184 in embryonic corneal lineage specification. Stem Cells. 30 (5), 898-909 (2012).
  15. Cieslar-Pobuda, A., et al. Human induced pluripotent stem cell differentiation and direct transdifferentiation into corneal epithelial-like cells. Oncotarget. 7 (27), 42314-42329 (2016).
  16. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nature Biotechnology. 24 (2), 185-187 (2006).
  17. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  18. Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).
  19. Mikhailova, A., Ilmarinen, T., Uusitalo, H., Skottman, H. Small-molecule induction promotes corneal epithelial cell differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2 (2), 219-231 (2014).
  20. Martinez Garcia de la Torre, R. A., Nieto-Nicolau, N., Morales-Pastor, A., Casaroli-Marano, R. P. Determination of the Culture Time Point to Induce Corneal Epithelial Differentiation in Induced Pluripotent Stem Cells. Transplantation Proceedings. 49 (10), 2292-2295 (2017).
  21. Zhang, C., Du, L., Pang, K., Wu, X. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial progenitor cells under defined conditions. PLoS One. 12 (8), e0183303(2017).
  22. Aberdam, E., Petit, I., Sangari, L., Aberdam, D. Induced pluripotent stem cell-derived limbal epithelial cells (LiPSC) as a cellular alternative for in vitro ocular toxicity testing. PLoS One. 12 (6), e0179913(2017).
  23. Kamarudin, T. A., et al. Differences in the Activity of Endogenous Bone Morphogenetic Protein Signaling Impact on the Ability of Induced Pluripotent Stem Cells to Differentiate to Corneal Epithelial-Like Cells. Stem Cells. 36 (3), 337-348 (2018).
  24. Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, 3195(2014).
  25. Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 4(2017).
  26. Skottman, H. Derivation and characterization of three new human embryonic stem cell lines in Finland. In vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 46 (3-4), 206-209 (2010).
  27. Ahola, A., Kiviaho, A. L., Larsson, K., Honkanen, M., Aalto-Setälä, K., Hyttinen, J. Video image-based analysis of single human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocyte beating dynamics using digital image correlation. Biomedical Engineering Online. 13, 39(2014).
  28. Ojala, M., et al. Mutation-Specific Phenotypes in hiPSC-Derived Cardiomyocytes Carrying Either Myosin-Binding Protein C Or α-Tropomyosin Mutation for Hypertrophic Cardiomyopathy. Stem Cells International. 2016, 1684792(2016).
  29. Ali, R. R., Sowden, J. C. Regenerative medicine: DIY eye. Nature. 472 (7341), 42-43 (2011).
  30. International Stem Cell Initiative,, et al. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
  31. Foster, J. W., Wahlin, K., Adams, S. M., Birk, D. E., Zack, D. J., Chakravarti, S. Cornea organoids from human induced pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7, 41286(2017).
  32. Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Corneal Limbal Epithelial Stem CellsHuman Pluripotent Stem CellsDirected DifferentiationXeno Free CultureFeeder Cell FreeLaminin 521 Collagen IVEmbryoid Body FormationSurface Ectodermal InductionAdherent DifferentiationCryopreservation

Related Articles