Методическая статья

Резка и плавающий метод для парафин врезанных тканей для разрезания

DOI:

10.3791/58288

⸱

5 сентября 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Life Science, Nanchang University, 2Queen Mary School, Medical Department, Nanchang University, 3School of Life Science, Nanchang University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол для улучшения парафин секционирование. Этот метод сочетает в себе резки и плавающие, используя простую термостатический камеру чтобы избежать процесса передачи требуется обычным методом. В результате эффективность и количество нетронутыми парафиновых срезах были значительно улучшены.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Секционирование парафин врезанных тканей широко используется в гистологии и патологии. Однако это утомительно. Чтобы улучшить этот метод, несколько коммерческих компаний разработали сложные Секции систем перевода с помощью жидкости воды. Для упрощения этой технологии, мы создали простой метод, с помощью домашнего оборудования, которое сочетает в себе резки и плавающей внутри простой термостатический камеры; Таким образом разделы автоматически ввести ванну водой на поверхности воды. Гиппокамп от взрослых мыши мозги, Взрослый мыши почки, мозги эмбриона мыши и взрослых рыбок данио глаза были сокращены с помощью обычных парафин секционирование и представленный метод для сравнения. Статистический анализ показывает, что наш усовершенствованный метод сэкономить время и выше качество секций. Кроме того парафин секционирование всего образца в короткое время легко для младших операторов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Морфологическое исследование имеет важное значение в биологических исследованиях. Хотя новая технология позволила исследователи соблюдать их целей непосредственно из цельной ткани или организмов1,2,3, резка образца в шлифов, следуют окрашивание, остается основным метод fornot только ткани морфологии, но и белка, ориентации непосредственно в ткани. Световой микроскопии использует три типа раздела: парафин, замороженные и полутонкая. Хотя cryosectioning является общим для защиты ткани антигенностью, и подготовка образца простой, морфология сохранить ткани бедных и непригодна для тонкого резания4,5. Секционирование парафин является наиболее часто используемый метод для экспонирования хорошо сохранившиеся морфологии. Как образцы полностью обезвоженной и встроенных в воск, парафиновые блоки могут храниться бессрочно. Кроме того парафин секущей производит шлифов, которые улучшают доступ к биологическим зонд в дальнейших экспериментов и уменьшить наложения слоя клеток в направлении Z.

Однако обычные парафин секционирование является утомительным и требует навыков оператора. Парафиновых срезах проходят фиксацию, обезвоживание, встраивание, резка и плавающей. Важно отметить, что передача разделе ленты из держателя ножа в водяной бане является необходимым, но трудно для младших операторов. Особенно в сухом воздухе раздел ленты будет твист из-за статического электричества и трудно разворачиваться на поверхности теплой воды. Для улучшения раздела качество, смачивая поверхность подвергается ткани между микротом лезвия проходит, охлаждения блоки воск, погружая их в ледяной воде, или повышение влажности с увлажнитель вблизи микротома рекомендуются6,7 . Новые методы для улучшения парафин секционирование включают внедрение гибридных парафин, cryosectioning8и помощи системы передачи коммерческий отдел9. Хотя эти методы частично улучшить парафин секционирование скорость и качество, они делают секционирование гораздо более громоздкими, и коммерческий отдел передачи системы являются дорогостоящими.

В этом протоколе мы показали, как создать простой, дешевой и гибкой оборудование шаг за шагом, который может быть подключен к держателю лезвия микротом роторный. Это оборудование состоит из секции канала, на водяной бане и подогреватель с переключателем обнаружения температуры. После резки, десятки разделов впадают в разделе канал и введите ванну водой непосредственно, таким образом разворачивается автоматически. Это повышает эффективность парафина секционирование и делает эту технологию более удобным. Используя этот метод, более взрослой мыши гиппокампа секции, секции почек взрослых мыши, эмбриональных 15.5 дневных (E15.5) мыши мозга секции и взрослых рыбок данио глаз разделы были собраны в меньше времени и более сохранился морфологически. Этот метод может также использоваться для других образцов тканей, которые требуют ускоренного парафин секционирование избегая потери раздела различия.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все методы, описанные здесь были одобрены животное уход и использование комитета университета Наньчан.

1. Монтаж оборудования и подключение микротома

  1. Дизайн параметр согласно требованиям (Дополнительные рис. 1).
  2. Представляет параметр для местной фабрике для производства акриловой доски.
  3. Собрать все части в последовательности: используйте хлороформ объединить 7 коммерческих Акриловые плиты в бак с раздел канала и водой ванну (рис. 1).
    Предупреждение: Хлороформ производит токсичных веществ, когда он встречает света и кислорода. Соберите аппарат в зонта.
  4. Установка трубчатых электронагревательных элементов через отверстие в акриловые Совет #1 (рисунок 2A, стрелки).
  5. Чтобы установить контроллер температуры, создать небольшое отверстие на #2 акриловые доске с помощью электродрели и установить датчик температуры (рисунок 2A, стрелка). Установка цифровой термостат на танк (рис. 2A).
    Примечание: Датчик температуры должна быть в пределах 1 см ниже поверхности воды.
  6. Чтобы обеспечить доступ к власти, отрегулируйте напряжения ниже 24 V до поворота на оборудовании.
  7. Удалите из микротома сборник обрезков.
  8. Свяжите канал разделы с держателя лезвий микротома с нейтральный силиконовый герметик (рис. 2B).
    Примечание: Не мазок любой нейтральный силиконовый герметик выше верхней части лезвия так, чтобы старые лезвие легко заменяется.
  9. Сухая на ночь, чтобы позволить хлороформе и нейтральный силиконовый герметик время закрепить.
  10. Установите лезвие в держатель лезвий. Налейте воду в водяной бане (рис. 2 c). Поверхность воды необходимо просто коснуться верхней части лезвия (голова стрелка2D фигура, ).

2. парафин секционирование

Примечание: Мусора часто накапливаются на верхнего или нижнего края блока воска и поверхности воды. Этот мусор должен регулярно очищаться.

  1. Выполните секционирование10обычных парафина.
    1. Зажим парафин врезанных образца на микротом роторный и поместите лезвие в держатель лезвий.
    2. Поверните маховик и раздел образца.
    3. Передача парафин секционного ленты в ванну теплой водой 38,5 ° С.
    4. Подберите секции на Микроскоп скользить от поверхности воды после разворачивается.
    5. Сухие слайды в духовке при 42 ° C на ночь.
  2. Улучшенная парафин секционирование (рис. 3)
    1. Включите оборудование.
    2. Откройте нагреватель с обнаружения переключатель температуры и задайте целевой температуры между 38,0 ° C до 40.0 ° C для 1 h заранее для теплой воды.
    3. Изменение блока парафин, приобретенного путем встраивания парафин; затем поместите блок парафина на микротом кассетный зажим и зафиксируйте его.
      Примечание: Верхние и нижние границы парафин блока должна быть изменена горизонтально для предотвращения разделе ленты от формирования дуги и становится не в состоянии потока через узких каналов.
    4. Быстро подход образец путем резки толще секций.
    5. Приспособиться к толщине подходящего раздела (10 мкм для взрослых мыши мозги, почки взрослого мыши и мозги эмбриона мыши, 4 мкм для глаз данио рерио). Поверните маховик и разделы автоматически войдет в разделах канала и ванны.
    6. Раздел образца в медленный и единообразных резки инсульта (рис. 3A).
      Примечание: Thethickness первой секции будут изменены после маховичок был остановлен на несколько минут. Одноразовые лезвия должны быть заменены, если секции имеют подряд царапин.
    7. Руководство разделы в зале ванна плавать в линии (рис. 3B, 3 C).
      Примечание: Если раздел head придерживается к стенке камеры, используйте кисть руководство держать его плавающим.
    8. Придерживаться секции на скольжениях микроскопа. После разделов полностью разворачиваться на водяной бане, несколько секций с помощью пинцета. Затем забираете их из водяной бани на скольжениях микроскопа (рис. 3D).
      Примечание: Секции должна быть подобрана из задней водяной бане, как те в разделах канала и передней водяной ванны не еще будет полностью развернута.
    9. Сухие слайды, помещая их в 42 ° C печь на ночь. Слайды можно затем храниться при комнатной температуре на неопределенный срок.
  3. Используйте гематоксилином-эозином (он) пятная ради оценки усовершенствованный метод8.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Улучшенный метод увеличилось количество нетронутыми парафиновых срезах. Мы протестировали этот новый метод на взрослых мыши гиппокампа ткани, взрослых мыши почки, мозги эмбриона мыши и данио рерио глаза. Вода была добавлена в бак, и температура воды поддерживался между 38,0 ° C до 40.0 ° C. После серийно подготовки образцов тканей, они были секционного и по сравнению с обычными секционирование. Новый метод избегать потери секции и увеличению доли нетронутыми секций в взрослых мыши гиппока...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для улучшения парафин раздела морфология и решить проблему потери времени при резании обычных парафин, мы создали более парафин, секционирование метод, который сочетает в себе резки и разворачивается. Этот улучшенный метод основывается на простой оборудования, которое включает раздел канала, на водяной бане и подогреватель с переключателем обнаружения температуры. На ленте в разделе входит водяной бане через канал раздела и автоматически разворачивается во время резки. Таким образом этот метод улучшает парафин, секционир...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы имеют патент на это устройство и объявить не конкурирующие интересы.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Фонд национального естественных наук Китая (Грант № 31400936, 31460260) и естественные науки фонд Цзянси провинции из Китая (20171BAB215020). Мы также благодарим совместной программы университета Наньчан и королевы Марии Лондонского университета за поддержку этой работы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ИнкубаторBoekel Scientific133000-2
ЭтанолSinopharm Chemical Reagent Co., крышка64-17-5
ксилол Sinopharm Chemical Reagent Co., Крышка1330-20-7
ParaplastLeica39601006
Модуль встраивания парафина с подогревомLeica
Коммерческая акриловая плита
ТрихлорметанSinopharm Chemical Reagent Co., Крышка67-66-3
Трубчатый электрический нагревательный элемент (12 В 200 Вт)
Регулятор температуры (12 В 120 Вт)MingsuoXH-W3002
Ротационный микротом Leica
Нейтральный силиконовый герметикСвяжите водяной канал с микротомным держателем ножа
Трансформатор напряженияDearllS-250-12
Одноразовое лезвиеAccu-Edge4689
ГематоксилинBaso Diagnostics Inc.BA-4025
Эозин Басо Диагностик Инк.BA-4025
MicroslideSail Brand7105
Нейтральный бальзамSinopharm Chemical Reagent Co., Крышка10004160
Coverslip Citoglas10212424C
МикроскопCarl Zeiss
Соляная кислотаXilong Chemical7647-01-0
Водяная баня для парафиновых срезовLeica
HistoCore Arcadia C - Холодная пластинаLeica
для парафинового спрея Thermo Scientific9990420

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
  2. Fujita, S. Analysis of neuron differentiation in the central nervous system by tritiated thymidine autoradiography. Journal of Comparative Neurology. 122 (3), 311-327 (1964).
  3. Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. Organ printing: Computer-aided jet-based 3D tissue engineering. Trends in Biotechnology. 21 (4), 157-161 (2003).
  4. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. Cold Spring Harbor Protocols. 3 (8), (2008).
  5. Viebahn, C., Luttenberg, H. P. A modified anti-roll plate as a remedy for the ill-effects of electrical charge during cryosectioning. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 37 (7), 1157-1160 (1989).
  6. Onozato, M. L., Hammond, S., Merren, M., Yagi, Y. Evaluation of a completely automated tissue-sectioning machine for paraffin blocks. Journal of Clinical Pathology. 66 (2), 151-154 (2013).
  7. Sabaliauskas, N. A., et al. High-throughput zebrafish histology. Methods. 39 (3), 246-254 (2006).
  8. Chen, T. K., et al. Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples. Journal of Visualized Experiments. (117), e54754(2016).
  9. Kucherenko, M. M., et al. Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles. Journal of Visualized Experiments. (46), e2438(2010).
  10. Cornell, W. C., et al. Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196(2018).
  11. Whiteland, J. L., et al. Immunohistochemical detection of T-cell subsets and other leukocytes in paraffin-embedded rat and mouse tissues with monoclonal antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 313-320 (1995).
  12. Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification. Journal of Visualized Experiments. (125), e55796(2017).
  13. Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus. Journal of Visualized Experiments. (82), e50933(2013).
  14. Lau, S. K., Chu, P. G., Weiss, L. M. CD163: A specific marker of macrophages in paraffin-embedded tissue samples. American Journal of Clinical Pathology. 122 (5), 794-801 (2004).
  15. Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. Staining Protocols for Human Pancreatic Islets. Journal of Visualized Experiments. (63), e4068(2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Paraffin SectioningTissue SectioningCutting Floating MethodWater Bath SectioningMicrotome SectioningSection Transfer SystemThermostatic ChamberSection Quality AnalysisHematoxylin Eosin StainingWhole Specimen Sectioning

Похожие статьи