Методическая статья

Жесткая встраивание фиксированной и витражи, в целом, миллиметр масштаб образцов для секции Бесплатные 3D гистологии, Микро Компьютерная томография

DOI:

10.3791/58293

⸱

17 октября 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Jake Gittlen Laboratories for Cancer Research, Penn State College of Medicine, 2Division of Experimental Pathology, Department of Pathology, Penn State College of Medicine, 3Medical Scientist Training Program, Penn State College of Medicine, 4Center for In Vivo Microscopy, Duke University Medical Center, 5KTM Research

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы разработали протоколы и разработаны пользовательские аппарат для встраивания миллиметр масштаб образцов. Мы представляем пример процедуры подготовки с акцентом на внедрение в акриловой смолы и полиимидные, трубки для достижения жесткой иммобилизации и долгосрочное хранение образцов для допроса морфологии архитектуры и клеток ткани, микро CT.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На протяжении более ста лет гистологическое исследование тканей был золотой стандарт для медицинской диагностики, потому что гистология позволяет все типы клеток в каждой ткани, чтобы быть выявлены и охарактеризованы. Наша лаборатория активно работает, чтобы сделать технологические достижения в рентгеновских Микро Компьютерная томография (микро КТ) в который принесет диагностических сила гистология к изучению полное ткани томов на клеточном резолюции (т.е., рентгеновский Histo-tomography механизм). С этой целью мы сделали целенаправленных улучшений в конвейер подготовки образца. Один из ключевых оптимизации и в центре внимания работе, является простой метод для жесткой встраивания образцов фиксированной и окрашенных миллиметр масштаба. Многие из публикуемых методы для иммобилизации образца и корреляционные микро-КТ полагаться на размещение образцов в парафин, агарозы или жидкостей, таких как алкоголь. Наш подход расширяет эту работу с пользовательскими процедурами и дизайн аппарата 3-мерной печати образцов в акриловой смолы напрямую внедрять в полиимида трубки, который относительно прозрачно для рентгеновских лучей. Здесь для образцов от 0,5 до 10 мм в диаметре, которая подходила бы для всего данио рерио личинок и несовершеннолетних или других животных и образцы тканей аналогичных размеров описаны процедуры подготовки образца. Как доказательство концепции мы внедряли пробах данио, дрозофилы, дафниии эмбриона мыши; показываются представителя изображения с 3-мерной сканирования для трех из этих образцов. Важно отметить, что наша методология приводит к несколько преимуществ, включая жесткие иммобилизации, долгосрочное сохранение кропотливо созданный ресурсов и возможность повторно запросить образцы.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Фенотипов являются наблюдаемые черты организма, которые представляют последствия уникальных взаимодействий между его генетический фон и окружающей среды. Эти характеристики могут включать поведенческие, биохимические, морфологических, развития или физиологические свойства. Важно отметить, что различия в черты одичал тип организмов и генетических мутантов может обеспечить основные понимание механизмов и функций пострадавших генов. Отношении морфологии гистопатология является золотым стандартом для оценки фенотипов на клеточном уровне, но страдает от механических артефактов и не позволяют точных количественных объемный анализ1. Наша лаборатория является мотивирован, чтобы преодолеть препятствия на пути применения диагностики власти гистология полное ткани томов на субмикронном резолюции.

Обзор имеющихся технологий свидетельствует о том, что изображения на рентгеновских микро вычисляемые микро-томография может обеспечить идеальные возможности, необходимые для миллиметровой шкалы целое животное 3-мерные (3D) гистологии. Микро-КТ позволяет неразрушающего, изотропным, 3D визуализация и способности проводить количественный анализ тканей архитектуры1,2. В последние годы 3D визуализации безупречный и металл окрашенных данио рерио, микро CT приобрел увеличение тяги и был использован для объемного анализа нескольких тканей, в том числе мышечной, зубы, кости и жировой ткани3,4 ,5,6,,78,9,10. Другие модели организмов и образцы тканей также поддаются микро-КТ. Например для количественной оценки плотной мезомасштабные нейроанатомия мозг мыши образы через синхротрона микро CT11были введены трубопровода. Аналогичным образом подходит для мягких тканей микро-КТ органов всей мыши12было показано эозина-протокол на основе окрашивание. Морфометрический анализ неокрашенных человека L3 позвонка и визуализация серебра окрашенных человеческих легких с помощью микро CT продемонстрировали полезность этой технологии для человека образцы13,14.

Для того, чтобы актуализировать большие перспективы микро CT для полной морфологической фенотипирование нетронутыми мелких животных и образцы тканей, ряд препятствий необходимо преодолеть по отношению к пропускной способности, резолюции, поле зрения, всеобъемлющего клеток окрашивание, и долгосрочное хранение. Хотя каждый из этих аспектов имеет критически важное значение, в центре внимания настоящего рукопись является оптимизация внедрения процедур, с дополнительные примечания на образце фиксации и окраски. Хэви-метал пятнать полезно, так как присущие контраст между различными мягких тканей в микро КТ изображений является низким. Потенции различных металла пятна, такие как осмия тетраоксид, йода, фосфорвольфрамовой кислоты (ЗПТ) и gallocyanin-chromalum, для повышения контраста для микро-КТ изучал15,16,17. Уранила ацетат используется также как контрастом для микро-КТ костей и хрящей18,19. ЗПТ, используемые в нашей Протокол ведет к последовательной окрашивания почти всех тканей и клеток в целом данио рерио образцов, уступая изображения, потенциально совместимы с гистология подобных исследований путем полного объема ткани.

Во время захвата изображений в микро CT, двухмерный (2D) проекция берется как образец поворачивается на незначительную степень и повторяется до тех пор, пока образец завершила поворот на 180° или 360°, генерации ряда тысячи 2D прогнозы используются для реконструкция в 3D-объем20. В этом процессе любой возмущений образца вызовет соответствующее 2D прогнозы из выравнивание, что приводит к плохо реконструированный 3D томов. Иммобилизация образец представляет собой способ исправления для этой проблемы и некоторые текущие стратегии связаны с погружаемой образца в спирте или встраивание в агарозы в полипропиленовые трубы или микропипеткой советы3,5,15, 16 , 21 , 22. Жидкие погружения методы не являются идеальными, поскольку образец движения во время загрузки изображений может произойти между визуализации наборов, что приводит к перенесенным реконструкций 3D тома23. Кроме того это хорошо известно, что физическая стабильность образцов хранятся жидкости ткани бедных в масштабах времени месяцев лет, в результате химической нестабильностью и истирания поверхности, связанные с движением контактных пунктов между образцом и (стены контейнера личные наблюдения с образцов фиксированной тканей животных и человека).

Чтобы уменьшить потенциал для образца движения во время визуализации, образцы могут быть встроены в агарозном24,25,26, но эта практика ассоциируется с риском пятно, диффундирующих в агарозы, тем самым уменьшая изображение контраст26. Кроме того жидкости или агарозы препараты подвержены физический ущерб и деградируют с течением времени, что делает их непригодными для долгосрочного хранения проб. Мы полагали, что потенциально успешных и простой пример метода иммобилизации может быть адаптирован от используемого для электронной микроскопии образцов. Полимеризованные смолы например EPON 812 (прекращено и заменено внедрить 812) обычно используются для обеспечения жесткости, необходимые для создания ультратонких разделы для электронной микроскопии27,28. Действительно несколько сравнительных исследований между рентгенография и электронной микроскопии продемонстрировали, что образцы, встроенные в смоле может быть imaged рентгеновской микроскопии29,30. Однако некоторые стандартные методы электронной микроскопии не переводят непосредственно к микро-КТ. Например микро-КТ образцов с квадрат смолы края блоков типичных смолы и образцы, вырезанные из этих блоков ассоциируется с краю дифракции артефакты, которые могут мешать изображений. Сглаживание краев смолы, а возможно, является трудоемким и длительным.

Целый ряд пластиковых вложения смолы используются в электронной микроскопии, высокая предпосылка, связанные с сложнее смол например вставлять 812 привели нас к проверить другие. Мы выбрали белый LR благодаря низкой вязкости, низкой усадкой, низкая склонность к форме пузырей во время полимеризации и Нижняя фон. Чтобы создать край Бесплатные образцы и свести к минимуму количество смолы, окружающих образца, мы разработали протоколы рисовать образцов в жидкой смолы в полиимида труб до полимеризации. Полиимидная был выбран для его высокой термостойкостью и высокими рентгеновского пропускания так, что снятие трубки не является необходимым для воображения. Наконец мы разработали пользовательский микропипеткой адаптер для нашего примера внедрения техники для того, чтобы надежно удерживайте труб и предотвратить загрязнение micropipettes. Адаптер может быть напечатан из файла изображения CAD 3D. Взятые вместе, представленные здесь методы подготовки образца цель сделать вложение малых образцов более простой, добиться расширения окрашивание контраст, жесткой иммобилизации и длительного хранения образцов нетронутыми миллиметр масштаба.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры на живых животных были утверждены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) в университете штата Пенсильвания.

1. день 1: фиксация

  1. Чтобы улучшить фиксацию и уменьшить объем содержимого кишечника, голодать молоди для по крайней мере 24 h для образца 10 мм или больше для более крупных образцов (например., 72 h для образца 14 мм).
  2. Предварительно охладить 10% нейтральных буферизуются формалина (NBF) и 2 x Tricaine-S (MS-222, 400 мг/Л) на льду до 4 ° C.
  3. Двойной рыбы воды объемом охлажденный 2 x MS-222 для быстрого и гуманного эвтаназии.
  4. Подождать 30 s (личинки) до 60 s (несовершеннолетних) после рыба перестает двигаться.
  5. Погружать рыба охлажденная 10% NBF для 10 мин.
  6. Исправьте рыбы в охлажденной NBF 10% раствор на ночь в плоскодонной контейнерах при комнатной температуре.
    Примечание: Плоскодонной контейнеры требуются для сведения к минимуму изгиба образца. Объем фиксатором и решения всех последующих шагов должно быть по крайней мере 20 раз объем пробы, если не указано иное. Для личинок 1-5 данио рерио рекомендуемый объем-по крайней мере 1 мл. Недостаточная фиксирующие результаты в бедных фиксации и излишки реагента тома не негативно результаты описанной процедуры. Для полной фиксации крупных рыб Разрежьте живот, начиная немного впереди анальный поры. Используйте минимальное проникновение ножницами или ножом и нежный усилие от рыб во время резки для сведения к минимуму повреждения внутренних органов. Фиксация протоколы были описаны другие31,32,33.

2. день 2: Обезвоживание и окрашивания

  1. Промывайте фиксированной образцов 3 раза в 1 x фосфатного буфера физиологический рН 7,4 (PBS) 10 мин.
  2. Опускайте образцы в 35% этилового спирта (EtOH) для 20 мин при комнатной температуре с нежным агитации.
    Примечание: Для всех шагов нежный агитации, используйте Настольный шейкер и набор для смешивания эффект, тщательно избегая натыкаясь и трения на поверхности контейнера образца.
  3. Погружаться в 50% образцов EtOH 20 мин при комнатной температуре с нежным агитации.
  4. Растворите фосфорвольфрамовой кислоты (ЗПТ) порошка в воде подготовить Стоковый раствор 1% w/v.
  5. Разбавить Стоковый раствор 1% ЗПТ в 100% 3:7 EtOH для получения 0,3% ЗПТ окрашивание раствора.
  6. Пятно образцы на ночь в 0,3% раствора ЗПТ при комнатной температуре с нежным агитации.

3. день 3: инфильтрации

  1. Приготовить смесь 1:1 v/v 100% EtOH и LR белой акриловой смолы и отложите в сторону.
  2. Промыть 3 раза в 70% EtOH за 10 мин.
  3. Опускайте образцы в 90% EtOH 30 мин при комнатной температуре с нежным агитации.
  4. Опускайте образцы в 95% EtOH 30 мин при комнатной температуре с нежным агитации.
  5. Опускайте образцы дважды в 100% EtOH 30 мин при комнатной температуре с нежным агитации.
  6. Опускайте образцы в смесь 1:1 EtOH и белый LR акриловой смолы на ночь при комнатной температуре с нежным агитации.

4. день 4: встраивание

  1. Опускайте образцы в 100% белый LR смолы втечение 2 ч при комнатной температуре с нежным агитации.
  2. Заменить смолы в шаге 4.1 свежий LR 100% белый смолы и инкубировать 1 час при комнатной температуре с нежным агитации.
  3. Соберите внедрения аппарат (рис. 1).
  4. Вырежьте полиимида трубы соответствующего диаметра и длины.
    Примечание: Рекомендуется трубки с внутренним диаметром, по крайней мере 0,1 мм больше чем диаметр образца. Для типичных образцов Стандартная длина 30 мм труб используется для каждого образца. При желании, удлиненные образцы могут быть размещены с помощью более труб.
    1. Прикрепите P1000 микропипеткой в широкий конец вложения адаптера и вставьте полиимида труб в узкий конец (рис. 1 c). Если вложения адаптер недоступен, перейдите к шагу 4.3.3. В противном случае продолжайте шаг 4.4.
    2. Клип от конца кончик микропипеткой прямо через такие, что полиимида трубки плотно. Вырезать на 44 мм от конца широкий кончик желтый микропипеткой 200 мкл для 0.0403" НКТ и 59 мм от нижней части 1 мл синий наконечник для 0,105" труб. Обрезка при необходимости.
    3. Прикрепите отрезока микропипеткой к микропипеткой.
  5. Передача образцов в небольшой вес лодки или V-образное решение бассейна и полностью погрузите образцы в 100% белый LR смолы.
  6. С внедрения аппарат от шаг 4.3 цель труб на широком конце фиксированного образца (или сторону головы в случае животных образцы) и медленно Пипетка образца в трубку. Положение образца в середине трубы и убедитесь, что НКТ выше и ниже образец заполнен смолой.
    1. Пипетка образца в трубки, таким образом, чтобы образец движется в направлении естественной, вперед.
      Примечание: Медленное дозирование избегает воздушные пузыри и образца, ущерб от истирания против края трубы. Движение назад в трубке можно легко повредить конечностей (конечностей, крылья, плавники, и т.д.). Рекомендуется разрешить некоторые смолы переполнения в аппарате вложения так, что позднее, воздух не вводить трубку во время удаления.
  7. Сразу же уплотнение открытый конец с масляной основе мягкого моделирования глины.
    1. Придавить глины в лист 1 мм толщиной.
    2. Стабилизации труб между указательным и средним пальцами.
    3. Медленно нажмите глины против конца трубы с пальца.
    4. Удалите излишки глины.
  8. Удаление вложения аппарат из микропипеткой.
  9. Вытяните трубку нежный вращением и уплотнением другой конец с глиной.
    1. Держите палец против запечатанном конца для предотвращения выброса глины.
    2. Медленно вставьте незапечатанных конец трубки в глине.
  10. Место труб по горизонтали и полимеризации смолы для 24 h на 65 ° C.
    Примечание: Горизонтальное расположение избегает образец движения во время полимеризации. Если небольшое количество воздуха был в ловушке в шаге 4.8, конце с воздушный пузырь может слегка повышенных предотвратить воздушный пузырь движение в сторону образца. Важно отметить, что слишком много высоте во время полимеризации может вызвать образец падения в конце низким из-за тяжести. Должным образом встроенного образца показано по сравнению с одним с воздушный пузырь, который следует избегать, поскольку преломления от воздуха/смолы интерфейсов может ухудшить качество изображения (рис. 2).

5. день 5: коллекция

  1. Сбор образцов для захвата изображений в конце дня 5.
    Примечание: Удаление полиимида труб можно, но не обязательно для обработки изображений. На базе синхротронного микро-КТ для образца данио рерио была исполнена на излучение 2-BM в расширенный Фотон источник (APS) в Аргоннской национальной лаборатории (Лемонт, IL, США). Для окрашенных ЗПТ данио рерио, был определен оптимальный энергии рентгеновского, спектр 5-30 кэВ, и энергию рентгеновского 13,8 кэВ был использован для обработки изображений. 1501 прогнозы были получены на 13,8 кэВ свыше 180 градусов (1 проекция каждый 0.12 градусов) с 2048 на 2048 пикселей камеры. Кроме того были также приобретены два изображения с плоским поле (прибыль) (один в начале) и один в конце приобретения и одно изображение темно поля. Квартира поля и темно корректировки, сокращения кольцо артефакт и реконструкции изображения были сделаны с использованием открытого источника TomoPy инструментарий34. ЗПТ окрашенных дафнии и дрозофилы образцы были образы на рентгеновский Микроскоп12,35. Конкретные параметры микро CT зависит от объекта и качество пятно. Например, образец дрозофилы был отсканирован в 40 kVp, 74 мА и 15 s на разрешение вокселей 3,10 3,10 × × 3.10 мкм3.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол описанных выше детали процедуры подготовки образца для всего данио рерио личинок и несовершеннолетних для микро-КТ. В частности, этот метод легко адаптировать для других типов образцов (например., дрозофилы, дафнии, Arabidopsis, мыши органов). Инкубации раз в различные шаги являются подходящими для данио рерио личинок и образцы аналогичного размера; более крупные выборки может потребовать больше инкубации. Чтобы помочь с образцом внедрения шаги, мы разработали адаптер, который придает 1 мл микропипеткой и могут быть настроены для различных размеров из полиимида трубки (рис. 1). Этот пользовательский адаптер был напечатан из CAD файла, связанного с этой рукописи и доступны для скачивания с http://publications.chenglab.com/LinEtAlJOVE/ 3D. Поскольку не все читатели могут иметь доступ к 3D-принтер, Ассамблея домашнее внедрения аппарата, используя советы микропипеткой описан в протоколе (шаг 4.3). Larva успешно внедренные данио рерио показано по сравнению образца с воздушный пузырь (рис. 2), которая скорее всего будет ухудшать качество изображения. Чтобы продемонстрировать универсальность внедрения процедуры, мы покажем образцы из различных модельных организмов (т.е., данио, дрозофилы, дафнии, эмбриона мыши), прошли через конвейер (Подготовка образца Рисунок 3). Реконструированный 3D тома весь данио, дафнияхи дрозофилы образцов, отображаемого на микро CT показываются (рис. 4). Главное как показано в образце данио , эти образцы можно хранить в течение длительного периода времени и повторно использоваться для нескольких изображений сеансов (рис. 5).

figure-results-1
Рисунок 1. Встраивание аппарат. (A) адаптер была разработана для облегчения внедрения с использованием общих инструментов лаборатории. (B поперечного сечения Иллюстрация адаптера. (C встраивание аппарат после вставки полиимида труб в точке адаптер () и присоединение микропипеткой точке (c) адаптера. Сегмент адаптера (b) является переполнение камеры, предназначенные для размещения избытков смолы и защитить микропипеткой от загрязнения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2. Успешно внедренных экземпляров лишены воздушные пузыри. (A встроенных 3 день после оплодотворения (dpf) личинок данио рерио без пузырьков воздуха. (B встроенных 3 dpf данио рерио с пузырек воздуха. Воздух, находящийся в процессе внедрения может двигаться в сторону образца, если образец не помещается по горизонтали во время полимеризации. Масштаб баров = 1 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3. Широкий спектр образцов могут быть внедрены с нашими протоколом. (A) 7 dpf данио рерио личинки. (B) взрослых дрозофилы. (C) взрослых дафний. (D) мыши эмбриона. Более крупные выборки например эмбриона мыши размещаются несколько изменений к протоколу. Кратко полиимидные труб был заполнен до 1/3 своей длины смолой и полимеризуется до внедрения. Фиксированной и цветного образца была помещена поверх предварительно полимеризованная смола. Затем трубки был наполнен ООН полимеризованная смола, последовал второй полимеризации. Полиимидная труб был удален до фотографии позволяют лучше визуализации образца на этом рисунке. Удаление труб не является необходимым для успешного образа приобретения микро CT. масштаба бары: образец изображения, 5 мм; расширен вставками, 1 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4. 3-мерной визуализации встроенных образцов. (A) реконструированы 3 dpf данио рерио личинка 0.743 × 0,743 × 0,743 мкм3 voxel разрешением. (B) реконструкции взрослых дафний (3 × 3 × 3 мкм3 voxel резолюции). (C) реконструкции взрослых дрозофилы (Разрешение вокселей мкм3 3.1 × 3.1 × 3.1). Цифровая сечения могут создаваться под любым углом, как показано в левой колонке. Поверхности визуализации отображаются справа, отображаются с использованием коммерческого программного обеспечения. Встраивание смолы можно увидеть в всех проверок за пределами выборки (отмеченные *), но не вмешиваться в образце, сам. Данио рерио личинка было imaged в Аргоннской национальной лаборатории в источнике Фотон Advanced, на основе синхротрона. Дафнии или дрозофилы образцы были образы с помощью коммерческого рентгеновского микроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-5
Рисунок 5. Образцы, внедренные с нашей протокола может быть повторно фотосъемка с микро КТ Же 5 dpf данио рерио личинка было imaged в 2011 (A) и (B) 2013, как прогнозы средней интенсивности сагиттальной зрения. Сравнение изображений между сканированием после хранения показывает сохранение анатомических особенностей. (C) A макро мышцы от обоих сканирования представлены, с сегментированным линии, указывающие соответствующие регионы, используемые для создания профиля интенсивности (D). Интенсивность профили, нормированная на их соответствующие средние показатели по обе линии показывают, пространственно соответствующие местные пики в обоих сканирования. (E) средние значения интенсивности для отдельных регионов в A и B, относящихся к фоновому (Bg, фиолетовый), ядер нейронов (N, зеленый), белого вещества (W, синий) и мышц (М, оранжевый) были разделены в среднем для фона (белый) и используется для создания сигнал шум коэффициенты (SNR), что соответствует хорошо между сканированием. Масштаб баров = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой рукописи мы представляем подробный протокол для жесткой иммобилизации фиксированной и окрашенных миллиметр-масштаба (0,5 – 2,5 мм в диаметре) образцов для микро-КТ. Учитывая стремительное развитие технологий микро CT в отношении резолюции и скорость, метод сохранения постоянного образца с повторно изображений возможности весьма желательно. Традиционно густые внедрения смолы широко используются в электронной микроскопии обеспечить структурную поддержку сократить ультратонких секций и свести к минимуму ущерб для образца. Наш метод адаптировать его использования для жесткой иммобилизации во время неразрушающего изображений. Чтобы свести к минимуму изображений артефакты из наличия избытков смолы, мы внедрили использования рентгеновских прозрачным полиимида труб для создания круглых образцов без края и ограничить объем смолы вокруг образца.

Оптимальный результат внедрения процедуры зависит от тщательного исполнения нескольких критических шагов и внимание к целостности образца на протяжении всей процедуры. Действительно повредив образца приведет к ослабленной окончательное изображение независимо от успеха выполнения изображений. После охлаждения способствует уменьшению боли ответов, и незаписанных тканей снижается более быстрыми темпами при более высоких температурах, мы используем предварительно охлажденные реагентов. Больших образцов может потребоваться сократить чтобы разрешить въезд фиксатор внутрь образца таким образом, чтобы внутренние органы например, печени, поджелудочной железы и кишечника полностью исправлена. Незаписанных тканей ухудшаться и потерять структурной целостности, уничтожив биологические структуры. Еще одним ключевым шагом является поддержание образца в его естественных выравнивания. Поэтому мы выступаем за использование плоскодонной контейнеров, которые мы используем во всей процедуры и особенно важны во время фиксации. Фиксация в полипропиленовые трубы или конические трубы, которые обычно имеют V-образное нижней следует избегать, поскольку они могут вызвать удлиненные образцов на изгиб, который искажает естественный морфологии образца. Кроме того чтобы свести к минимуму использование смолы, внутренний диаметр трубки водоплавающих только немного больше, чем ширина образца для испытаний. Изгиб образца может также привести к повреждению образца как он вводит труб. Он также рекомендовал передать образец в трубке естественным образом вперед во избежание повреждения конечностей. Надлежащего обезвоживание является еще одним критическим шагом. Это достигается с небольшими приращениями увеличения концентрации EtOH медленно заменить воду с EtOH, который является более смешивается со смолой. Значительное увеличение концентрации EtOH связаны с усадка ткани и могут быть смягчены с дополнительным шагом EtOH инкубации, чтобы сделать переход более постепенным. Наконец чтобы свести к минимуму перемещения образца или воздушные карманы, если таковые имеются, образцы помещаются горизонтально в процессе полимеризации смолы (конец 4 дня). Воздушные карманы или герметик рядом с образца приводит оптических артефакты с рентгенография, связанные с краю дифракции, снижения качества изображения.

В отношении возможных изменений к протоколу, другие вложения смолы и металла пятна может быть использован вместо акрил белый LR и ЗПТ, соответственно. Embed812, эпоксидная смола, широко используется в электронной микроскопии, вязкие, более трудным для передачи, может привести к искажению образцов и связано с выше фона чем акрил или гликоль полибутилметакриловой смолы. Хотя JB4 плюс, гликоль метакрилата, менее вязкой, чем EMbed812 и нижней фон, случайное образование воздушных карманов часто появляются вблизи образца. Как уже упоминалось, воздушные карманы ухудшить качество изображения и особенно проблематичным для ценных образцов. Стоит отметить, что Technovit 7100, другой гликоль метакрилата, вмешивается ЗПТ окрашивание, что приводит к плохой контраст в конечном изображении. Сравнительно акрил белый LR воды как вязкость, низкий фон и не вмешиваться с ЗПТ пятнать. В наших руках больше чем 95% успеха внедрения в LR белый без образца повреждения или воздушные пузыри. По этим причинам мы выступаем за его использование в качестве вложения смолы для ткани микро CT. Что касается пятен итоги различных металла пятна как осмия тетраоксид, йода, и ЗПТ в микро-КТ была по сравнению и других обсуждаемых в15,,1617 и выходит за рамки этого рукопись.

Размер выборки является основным ограничением для нашего нынешнего протокола. Поскольку мы используем всасывания для передачи образцов в трубке, способность видеть образец имеет решающее значение для ориентации и обеспечения того, чтобы это действительно в трубах. В результате, суб миллиметр образцы таких тихоходки (т.е., медведи воды) являются чрезвычайно трудно внедрить потому, что они требуют использования микроскопа для отображения. После того, как применяется всасывания, микроскопические образцы легко теряются от фокальной плоскости и стать сложным для себя, что делает его трудно определить, если они слишком далеко прошли через прилагаемый конца трубопровода. Больше образцов, таких как мыши эмбрионов, (3-10 мм) могут быть внедрены с небольшими изменениями для внедрения протокола (рис. 4 d). В частности полиимидные труб был заполнен до 1/3 с жидкой смолы, которая полимеризуется до внедрения. Фиксированной и цветного образца была помещена поверх предварительно полимеризованная смола. Трубопровод был полностью заполнены с ООН полимеризованная смола и последовал второй полимеризации.

Значимость нашей внедрения протокола коллектор. Жестко иммобилизованных всего животного или ткани образцы желательно по причинам, в том числе: (1) создание долгосрочных хранилищ образцов, которые трудно генерировать или подготовки; (2) повторное приобретение данных; (3) включение серийный изображений с использованием нескольких изображений механизмов; и (4) обеспечение стандартов для калибровки и развития технологии. Образцы, приготовленные нашими внедрения процедуры помещены в твердые смолы, которая устойчива против повреждения и может поэтому легко храниться возможно на неопределенный срок. Долгосрочного хранения особенно полезен для редких или кропотливо созданный образцов, таких как те, которые связаны с проектами, феном. Кроме того в случае, если цифровые данные теряются, данные можно получать из исходного образца. Возможность повторно изображений в течение долгого времени потенциально позволяет того же образца будет допрошен с более расширенный визуализации формы в будущем. Поскольку образцы физически стабильны между экземплярами изображений, изображения приобретаются от же образца в ту же ориентацию, содействия регистрации между наборами данных более ранних и более поздних версий. Например изображения с низким разрешением может разрешать только сегментации тканей в данио рерио личинки. Же личинка может позже быть повторно imaged с более высоким разрешением так, что более подробный анализ вычислительной сотовой разрешением. Эта возможность для прямого сравнения между зарегистрированными сканирования предлагает смолы встроенные образцы как потенциал стандарта для развития технологий микро CT. Последствий любого изменения в метод визуализации может оцениваться изображений из того же образца, так что все переменные в на шаге подготовки образца находятся под контролем. Наконец смола встроенный стандартный образец может использоваться для калибровки инструмента для проверки последовательности изображений.

Наши предыдущие работы, изучения гистологии мутантов и больной рыбы показали, что сотовой резолюции позволяет обнаружить тонкие аномалий в структуре ткани, которые игнорируются в валовой обследование с использованием рассечения Микроскоп36, или малой мощности стерео Микроскоп. Мы хотим расширить наши разрешением анализ человеческих образцов. Данио рерио личинки, которые составляют основной предмет наших разработок, похожи на человека иглы биопсий в их хрупкость, гетерогенность клеточных и межклеточные ткани, размер (1-3 мм в диаметре) и удлиненную форму. Опираясь на наш многолетний опыт с данио рерио и другую работу, показывая что микро CT успешно витражи и отсканированные тканей человека, хотя и на более низких резолюции37, мы ожидаем наши подходы к принести добавленную стоимость для визуализации и анализа биопсия иглы. Мы подсчитали, что Ассамблея набор достаточно для одного подготовки до 20 образцов же состояния быть потенциально менее 30 долларов США. Образцы, подготовленный нашими внедрения метода устойчивы к физический ущерб и поэтому легко транспортировать. Низкая стоимость и простота транспорта указывают на возможность сбора образцов из по всему миру, особенно областей, в которых сотовой резолюции изображений с микро КТ не является легкодоступной. Наше видение – для цифровых файлов высокого разрешения иглы биопсий (от 0.1 до нескольких терабайт) включить создание цифровой атлас тканях человека и в то же время позволяют исследователям уточнить и повысить текущий анализ трубопроводов для Локализация и количественная характеристика клеточной и тканевой архитектуры в контексте полное 3D сканирование тканей.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все авторы заявляют, что нет конфликтов интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить Roland Myers за любезно предоставление оригинальных протоколов ТЕА. Кроме того мы хотели бы поблагодарить д-р Джон Колборн для предоставления образца дафнии , доктор Santhosh Girirajan для предоставления образца дрозофилы и д-р Фадиа Камаль для предоставления эмбриона мыши. Следователи признают финансовой поддержки от НИЗ (1R24OD18559-01-A2, PI: KCC), Джейк Gittlen лаборатории для исследований рака и из экспериментальных премии финансирования от PSU Гека институтов биологических наук и Института CyberScience.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10X Нейтральный буферизованный формалинFisher ScientificSF100-4
Фосфотунстиновая кислотаVWRMK282402
трикаин-S (MS-222)Western ChemicalMS-222
LRБелая электронная микроскопия Sciences14380
Полиимидная трубка (ID 0.04")Nordson Medical141-0065Точные полиимидные трубки, описанные в рукописи, больше не доступны. Близкий матч предусмотрен здесь. Трубки нестандартного диаметра могут быть изготовлены по запросу.
Этиловый спирт 200 ProofPharmco-Aaper111000200
Мягкая пластилина на масляной основеSculpeyS302 001
Микропипетка P200GilsonF123601
Микропипетка P1000GilsonF123502
Стеклянные флаконыVWR66015-042
V-образный тазVWR89094-676
Весовые катераVWR10803-148
200 μ L желтый наконечник для микропипеткиFisher Scientific02-707-500
1 мл синий наконечник для микропипеткиFisher Scientific02-681-163
Настольный шейкерThermolyneM71735
ФотометрическаякамераCoolSNAP HQ2 CCD
Рентгеновский микроскопZeissXradia 520 Versa

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheng, K. C., Katz, S. R., Lin, A. Y., Xin, X., Ding, Y. Whole-organism cellular pathology: a systems approach to phenomics. Advances in Genetics. 95, 89-115 (2016).
  2. Cheng, K. C., Xin, X., Clark, D., La Riviere, P. Whole-animal imaging, gene function, and the zebrafish phenome project. Current Opinion in Genetics & Development. 21 (5), 620-629 (2011).
  3. Vågberg, W., Larsson, D. H., Li, M., Arner, A., Hertz, H. M. X-ray phase-contrast tomography for high-spatial-resolution zebrafish muscle imaging. Scientific Reports. 5, 16625(2015).
  4. Bruneel, B., et al. Imaging the zebrafish dentition: from traditional approaches to emerging technologies. Zebrafish. 12 (1), 1-10 (2015).
  5. Charles, J. F., et al. Utility of quantitative micro-computed tomographic analysis in zebrafish to define gene function during skeletogenesis. Bone. 101, 162-171 (2017).
  6. Silvent, J., et al. Zebrafish skeleton development: High resolution micro-CT and FIB-SEM block surface serial imaging for phenotype identification. PLoS One. 12 (12), e0177731(2017).
  7. Hur, M., et al. MicroCT-based phenomics in the zebrafish skeleton reveals virtues of deep phenotyping in a distributed organ system. eLife. 6, e26014(2017).
  8. J, S. Whole-body imaging of a hypercholesterolemic female zebrafish by using synchrotron X-ray micro-CT. Zebrafish. 12 (1), 11-20 (2015).
  9. Hasamura, T., et al. Green tea extract suppresses adiposity and affects the expression of lipid metabolism genes in diet-induced obese zebrafish. Nutrition and Metabolism. 9 (1), 73(2012).
  10. Meguro, S., Hasumura, T., Hase, T. Body fat accumulation in zebrafish is induced by a diet rich in fat and reduced by supplementation with green tea extract. PLoS One. 10 (3), e0120142(2015).
  11. Dyer, E. L., et al. Quantifying mesoscale neuroanatomy using X-ray microtomography. eNeuro. 4 (5), (2017).
  12. Busse, M., et al. Three-dimensional virtual histology enabled through cytoplasm-specific X-ray stain for microscopic and nanoscopic computed tomography. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 115 (10), 2293-2298 (2018).
  13. Perilli, E., Parkinson, I. H., Reynolds, K. J. Micro-CT examination of human bone: from biopsies towards the entire organ. Ann Inst Super Sanita. 48 (1), 75-82 (2012).
  14. Watz, H., Breithecker, A., Rau, W. S., Kriete, A. Micro-CT of the human lung: imaging of alveoli and virtual endoscopy of an alveolar duct in a normal lung and in a lung with centrilobular emphysema - initial observations. Radiology. 236 (3), 1053-1058 (2005).
  15. Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: A versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
  16. Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11(2009).
  17. Pauwels, E., Van Loo, D., Cornillie, P., Brabant, L., Van Hoorebeke, L. An exploratory study of contrast agents for soft tissue visualization by means of high resolution X-ray computed tomography imaging. Journal of Microscopy. 250 (1), 21-31 (2013).
  18. Kün-Darbois, J. D., Manero, F., Rony, L., Chappard, D. Contrast enhancement with uranyl acetate allows quantitative analysis of the articular cartilage by microCT: Application to mandibular condyles in the BTX rat model of disuse. Micro. 97, 35-40 (2017).
  19. Tang, S. Y., Vashishth, D. A non-invasive in vitro technique for the three-dimensional quantification of microdamage in trabecular. Bone. 40 (5), 1259-1264 (2007).
  20. Elliott, J. C., Dover, S. D. X-ray microtomography. Journal of Microscopy. 126 (Pt 2), 211-213 (1982).
  21. Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping). PLoS Genetics. 2 (4), e61(2006).
  22. Larsson, D. H., Vågberg, W., Yaroshenko, A., Yildirim, A. Ö, Hertz, H. M. High-resolution short-exposure small-animal laboratory x-ray phase-contrast tomography. Scientific Reports. 6, 39074(2016).
  23. Pleissis, A., Broeckhoven, C., Guelpa, A., Roux, S. G. Laboratory x-ray micro-computed tomography: a user guideline for biological samples. GigaScience. 5, 1011(2017).
  24. Wong, M. D., Spring, S., Henkelman, R. M. Structural stabilization of tissue for embryo phenotyping using micro-CT with iodine staining. PLoS One. 8 (12), e84321(2013).
  25. Wong, M. D., Maezawa, Y., Lerch, L. P., Henkelman, R. M. Automated pipeline for anatomical phenotyping of mouse embryos using micro-CT. Development. 141 (12), 2533-2541 (2014).
  26. Hsu, C. W., et al. Three-dimensional microCT imaging of mouse development from early post-implantation to early postnatal stages. Developmental Biology. 419 (2), 229-236 (2017).
  27. Luft, J. H. Improvements in epoxy resin embedding methods. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 409-414 (1961).
  28. Hayat, M. A., Giaquinta, R. Rapid fixation and embedding for electron microscopy. Tissue Cell. 2 (2), 191-195 (1970).
  29. Handschuh, S., Baeumler, N., Schwaha, T., Ruthensteiner, B. A correlative approach for combining microCT, light and transmission electron microscopy in a single 3D scenario. Frontiers in Zoology. 10, 44(2013).
  30. Bushong, E. A., et al. X-ray microscopy as an approach to increasing accuracy and efficiency of serial block-face imaging for correlated light and electron microscopy of biological specimens. Microscopy and Microanalysis. 21 (1), 231-238 (2015).
  31. Tsao-Wu, G. S., Weber, C. H., Budgeon, L. R., Cheng, K. C. Agarose-embedded tissue arrays for histologic and genetic analysis. Biotechniques. 25 (4), 614-618 (1998).
  32. Sabaliauskas, N. A., et al. High-throughput zebrafish histology. Methods. 39 (3), 246-254 (2006).
  33. Copper, J. E., et al. Comparative analysis of fixation and embedding techniques for optimized histological preparation of zebrafish. Comparative Biochemistry and Physiology. 208, 38-46 (2018).
  34. Gürsoy, D., De Carlo, F., Xiao, X., Jacobsen, C. TomoPy: a framework for the analysis of synchrotron tomographic data. J Synchrotron Radiat. 21 (Pt 5), 1188-1193 (2014).
  35. Merkle, A. P., Gelb, J. The ascent of 3D X-ray microscopy in the laboratory. Microscopy Today. 21 (2), 10-15 (2013).
  36. Thomas, G. K. A molecular and systems biology analysis of pleiotropic vertebrate phenotypes (Doctoral dissertation). , Retrieved from the Penn State Electronic Theses and Dissertations Database (2009).
  37. Walton, L. A., et al. Morphological characterisation of unstained and intact tissue micro-architecture by X-ray computed micro- and nano- tomography. Scientific Reports. 5, 10074(2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

3D

Похожие статьи