Method Article

TChIP-Seq: Профилирование конкретного типа ячейки Epigenome

DOI:

10.3791/58298

⸱

January 23rd, 2019

 ,  ,  , 
1RNA Biology Laboratory, RIKEN, 2RNA Systems Biochemistry Laboratory, RIKEN Cluster for Pioneering Research, 3Laboratory for Phyloinformatics, RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research, 4RNA Biology Laboratory, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Hokkaido University, 5Department of Computational Biology and Medical Sciences, Graduate School of Frontier Sciences, University of Tokyo

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы опишем пошаговое протокол для тандем хроматина иммунопреципитации последовательности (tChIP-Seq), который позволяет проводить анализ изменения определенного типа клеток геном wide гистонов.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эпигеномные регулирование играет центральную роль в экспрессии генов. Поскольку изменения гистона был обнаружен в 1960-х, его физиологических и патологических функции были широко изучены. Действительно появление глубоких секвенирование нового поколения и иммунопреципитации chromatin (чип) через конкретные гистона модификации антитела изменил наш взгляд эпигеномные регулирования через генома. И наоборот тканей, как правило, состоят из типов различных клеток, и их сложные смеси создает аналитические проблемы для расследования epigenome в конкретной ячейке тип. Для решения состояния конкретного типа хроматин клеток в геном всей манере, мы недавно разработали тандем хроматина иммунопреципитации последовательности (tChIP-Seq), которая основана на выборочной очистки хроматина тегами ядро гистоны из ячейки виды интересов, следуют чип-Seq. Целью настоящего Протокола является внедрение наилучшей практики tChIP-след Эта технология предоставляет универсальный инструмент для epigenome ткани конкретного расследования гистона различных модификаций и модельные организмы.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ткани животных состоят из клеток различных типов. Ген регулирование в каждой ячейке определяет тип ячейки. Chromatin изменения - ДНК метилирования и гистонов модификации - лежат в основе тип ячейки специфика экспрессии генов. Таким образом необходимости измерения эпигеномные регулирования в каждой ячейке тип, но это был технический вызов.

Расследовать эпигенетики в конкретной ячейке тип, секвенирование иммунопреципитации chromatin тандем (tChIP-Seq) был недавно разработанных ()Рисунок 1)1. В tChIP белка гистонов epitope тегами ядро H2B выражается от промоутера определенного типа клеток. Эта функция позволяет изоляции chromatins из клеток интерес, хотя материал начинается из смеси различных типов клеток. Следующие чип-Seq — хроматина очищение через изменение гистона Марк и глубокие секвенирование нового поколения изолированной ДНК — мы можем контролировать эпигеномные статус тип целевой ячейки в геном всей манере.

Используя эту технику, мы недавно исследовали нейрон конкретных trimethylation гистонов H3 белка на лизина 4 (H3K4me3) знаки. В этом исследовании мы разработали стук в мышь, в котором C-неизлечимо флаг тегами H2B белка была выражена при рекомбинации Cre опосредованной (Rosa26ЦАГ floxed ПА H2B-флаг). Путем скрещивания с помощью мыши, имеющих КРР эндоплазматического ретикулума (ER) гена под контролем промотора CamK2a, полученные мыши линии индуцированной H2B-флаг в активных нейронов на тамоксифен инъекций (Camk2aH2B-флаг)1. Начиная от мозга установленной мыши линии, мы провели tChIP-Seq с анти H3K4me3 антител. Так как H3K4me3 знаки часто соответствуют промоутер регионов, мы могли бы обнаружить сотни мРНК, конкретно выражена в нейроны1.

Здесь мы описываем метод типичный tChIP-Seq, который охватывает шаги от рассечение тканей для библиотеки строительных ()Рисунок 1). Конечная цель настоящего Протокола заключается в том, чтобы поделиться своим передовым опытом для выполнения tChIP-Seq и будущее применение этого метода в другие типы клеток и изменения гистона.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все методы, описанные здесь были утверждены отделом безопасности RIKEN (H27-EP071) и проведены с соответствующими руководящими принципами и правилами.

1. рассечение тканей

  1. Вскрыть тканях интерес на мелкие кусочки (примерно < 3 мм2) с помощью тонкой весной ножницы.
    Примечание: Большие фрагменты тканей занять больше времени, чтобы заморозить, и более мелкие куски будут перенесены больший объем буфера, оба из которых могут повлиять на результаты.
  2. Добавить фрагменты Иссеченную ткань в чистый контейнер с жидким азотом и собирать их в 2 мл пробирки (1 штука в трубку) заполнены с жидким азотом.
    Примечание: Трубы с гидрофильной поверхностью рекомендуются для этого шага.
  3. Место труб при температуре-80 ° C > 5 мин с крышкой, открытым для испарения оставшиеся жидкого азота.
    Примечание: После закрытия крышки, фрагменты тканей может храниться при температуре-80 ° C на один месяц перед использованием.

2. ячейки фиксации

Примечание: Мы использовали удобный криогенных дробилка для этого шага. Альтернативные аппарат может быть использован.

  1. Место 2 мл белок низкой привязки пробирки, содержащие образцы тканей на шкаф металлический льда охлажденной в жидком азоте.
  2. Место металлическая пуля в 1,5 мл трубки и холод с жидким азотом. Поместите его на решетку металла льда.
  3. Откройте 2 мл и место prechilled металлическая пуля в трубу. Закройте крышку, установите 2 мл трубы в Трубодержатель удобный криогенных точильщика и сразу окунуть собрал Трубодержатель в жидком азоте за 1 мин.
  4. Вставьте держатель замороженные трубы в наружной кассеты удобный криогенных точильщика и встряхнуть 60 раз за 30 s.
  5. Разбирать держателя трубки, удалите металлические пули и место 2 мл на образец охладителя prechilled при-20 ° C.
  6. Поместите образец охладителя при-20 ° C на 15 минут предотвратить замораживание фиксатором на следующем шаге.
  7. Привести пример кулер на скамейке, откройте крышку трубки и сразу же капать 900 мкл 1% формальдегида в него. После закупорить несколько раз, перевести подвеска на новый 2 мл трубка, содержащая 900 мкл 1% формальдегида и исправления для 10 мин с нежным вращение в инкубаторе в 23 ° C.
    Предупреждение: Формальдегид токсичных и вредных.
  8. Чтобы остановить реакции фиксации, добавьте 100 мкл 2,5 метров глицина каждой трубки и центрифуги для 5 мин на 3000 x g при 4 ° C. Выбросите супернатант.
  9. Добавьте 1 mL ледяной фосфат амортизированное saline (PBS), центрифуги для 5 мин на 3000 x g при 4 ° C и отбросить супернатант. Повторите этот шаг два раза (3 стирок в общей сложности).
    Примечание: Фиксированная образцов может быть флэш заморожены жидким азотом и хранятся при температуре-80 ° C.
  10. Добавьте 500 мкл буфера Lysis 1 (50 мм 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic кислота (HEPES)-Кох (рН 7,5), 140 мм NaCl, 1 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) (рН 8,0), 10% w/v глицерина, 0,5% w/v NP-40, ингибитор протеазы X-100 и 0,1 x 0,25% w/v Тритон коктейль) Пелле, накапайте несколько раз и поворот на 10 мин при 4 ° C.
    Примечание: Буфера Lysis 1 следует фильтровать и хранить при 4 ° C перед использованием.
  11. Центрифуга для 5 мин на 3000 x g при 4 ° C и удалить супернатант.
  12. Добавьте 1 mL 2 буфера Lysis (10 мм трис-HCl (рН 8,0), 200 мм NaCl, 1 мм ЭДТА (рН 8,0), 0,5 мм EGTA и 0.1 x коктейль ингибитор протеазы) Пелле, вихрь и поворот на 10 мин при 4 ° C.
    Примечание: Буфера Lysis 2 следует фильтровать и хранить при 4 ° C перед использованием.
  13. Центрифуга для 5 мин на 3000 x g при 4 ° C и удалить супернатант.
  14. Добавить 800 мкл аналитического (RIPA) буфера radioimmunoprecipitation с ингибитором протеазы 1 x коктейль гранулы и Ресуспензируйте гранулы, закупорить.
  15. Центрифуга для 5 мин на 3000 x g при 4 ° C и удалить супернатант.
  16. 500 мкл буфера РИПА с 1 x ингибитор протеазы коктейль.
  17. Центрифуга для 5 мин на 3000 x g при 4 ° C и удалить супернатант.
  18. Добавьте 1 mL Буфер RIPA с 1 x ингибитор протеазы коктейль. Сразу же переходите к следующему шагу.

3. chromatin стрижка

  1. Lysate передать трубку sonicator и затем поместите трубку на ultrasonicator.
  2. Наклонить хроматина со следующими параметрами: температура: 4 ° C; инцидент Пиковая мощность: 175 Вт; коэффициент: 10%; циклы/серия: 200; и время: 2400 s.
  3. Передать образец 1,5 мл белок низкой привязка трубки и центрифуги для 5 минут на 20 000 x g при 4 ° C.
  4. Соберите супернатант в новой трубки низкого привязки белка.
    Примечание: Образец может быть флэш замороженные в жидком азоте и хранятся при температуре-80 ° C.

4. качество проверки ДНК (обратный сшивки)

  1. Микс 20 мкл lysate и 180 мкл буфера чип (10 мм трис-HCl (рН 8,0), 300 мм NaCl, 5 мм ЭДТА (рН 8.0) и лаурилсульфат натрия 1% w/v (SDS)) в трубе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Инкубируйте образца при 65 ° C в тепловой cycler для 6 h с открытой крышкой тепловая велосипедист. Держите крышку открыть тепловая велосипедист, чтобы избежать чрезмерной денатурации.
    Примечание: Чип Элюирующий буфер должен фильтруется и хранятся при комнатной температуре перед использованием. Этот инкубации может быть продлен на ночь.
  2. 1 мкл 10 мг/мл РНКазы, вихрь и инкубировать при 37 ° C за 30 мин.
  3. 6,5 мкл 15 mg/ml протеиназы K, вихрь и Инкубируйте на 55 ° C для 60 мин.
  4. Перенесите реакция на трубу ДНК низкой привязки, 4 мкл гликогена 5 мг/мл и вихрь. Затем добавьте 200 мкл фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (25:24:1) и центрифуги для 5 мин на 18,000 x g при комнатной температуре.
  5. Супернатант передать новой трубки низкого привязки ДНК. Добавить 200 мкл буфера Tris-ЭДТА-NaCl (10 мм трис-HCl (рН 8,0), 1 мм ЭДТА (рН 8.0) и 200 мм NaCl) оставшийся раствор фенола/хлороформ/изоамилового спирта и центрифуги для 5 мин на 18,000 x g при комнатной температуре. Собирать супернатант и смешать с первого супернатант.
  6. 900 мкл ледяной этанола и инкубировать 1 час при температуре-20 ° C.
    Примечание: Этот инкубации может продлеваться до 4 - 6 ч.
  7. Центрифуги для 30 мин на 18,000 x g при 4 ° C.
  8. Выбросите супернатант. Добавьте 1 mL ледяной 75% этанола в гранулах и центрифуги для 30 мин на 18,000 x g при 4 ° C. Повторите этот шаг (две автомойки в общей сложности).
  9. Тщательно удалить супернатант и просушите при комнатной температуре 1 мин.
  10. Добавьте 50 мкл буфера Tris-ЭДТА (TE) и растворить ДНК путем инкубации его при комнатной температуре в течение 30 минут или при температуре 4 ° C на ночь. Избегайте vortexing или закупорить. Держите этот ДНК как «входной» и использовать его для приготовления библиотеки при необходимости.
  11. Измерить концентрации ДНК с флуориметр согласно инструкции производителя (см. таблицу материалы) и проверить распределение размеров с машиной microfluidic электрофореза (см. репрезентативных данных, показано в Рисунок 2a). Использование 10 нг или меньше ДНК для этот assay.
    Примечание: Фрагменты 100 – 500 пар оснований (ВР) должен составлять 50% или больше из ДНК.

5. сродства очищения, антитела анти флаг

Примечание: Для tChIP нейрон-Seq, тканях мозга от 8 мышей обычно используются для один образец tChIP-Seq для подготовки 2 нг очищенная ДНК иммунной тандем-очищение (см. шаг 7.1). В наших руках 0.1 нг ДНК, по-прежнему предоставляет высококачественные ДНК библиотеки для чип-Seq (Kadota, неопубликованные). Таким образом в теории, одной мыши может быть достаточно для выполнения нейрон tChIP-Seq. Требуемая сумма должна быть оптимизирована для тканей и клеток типа интереса. Для отрицательного контроля imumuno очистка эксперимента мозговой ткани lysate от мышей без каких-либо H2B-флаг выражение следует подготовить и используется.

  1. Пипетка 200 мкл магнитные бусы, конъюгированных овец анти мыши иммуноглобулина G (IgG) в трубку низкой связывания белков.
  2. Установите трубу на магнитного стенд и подождите 1 мин для супернатант станет ясно. Отбросить супернатанта, добавьте 1 mL ледяной PBS, и вихрь. Повторите этот шаг (две автомойки в общей сложности).
  3. 20 мкл антител анти флаг 1 мг/мл и вращаться в течение 5 ч при 4 ° C.
    Примечание: Этот инкубации может быть продлен на ночь.
  4. Мыть после шаг 5.2 бусины. Место шарики в 15 мл.
  5. Ресуспензируйте бисер в 1110 мкл Буфер RIPA и затем 900 мкл 10 x блокирование реагента, 180 мкл 50 x Денхардта в раствор, 10 µL 100 x ингибитор протеазы коктейль и 6,8 мл lysate подготовлен на шаге 3. Разделить смесь на 5 белок низкой привязки труб. Вращаться в течение 6 ч при 4 ° C.
    Примечание: Этот инкубации может быть продлен на ночь.
  6. Поместите трубку на магнитную подставку и ждать 1 мин для супернатант станет ясно. Отменить супернатанта, добавляют 1 мл Буфер RIPA и аккуратно перемешать. Повторите этот шаг 5 раз (6 моет в общей сложности). Объединить все бусины в один белок низкой привязки трубку.
  7. Добавить 200 мкл рабочего раствора микросхемы Элюирующий буфер и вращаться в течение 15 минут при комнатной температуре. Проверьте качество ДНК, как описано в шаге 4.11 (см. репрезентативных данных, показано на рисунке 2B и C). Сразу же переходите к следующему шагу.

6. сродства очищения антитела анти H3K4me3 и обратного сшивания

Примечание: Следующие шарик подготовка выполненных шагов (6.1-6.4) до 5,7 шаг.

  1. Пипетка 40 мкл магнитной бусины, конъюгированных овец анти мыши IgG в трубку 2 мл белок низкой привязки.
  2. Поместите трубку на магнитную подставку и ждать 1 мин для супернатант станет ясно. Отбросить супернатанта, добавляют 1 мл ледяной PBS и осторожно перемешать. Повторите этот шаг (две автомойки в общей сложности).
  3. 4 мкл антител анти H3K4me3 1 мг/мл и вращаться в течение 6 ч при 4 ° C.
  4. Мыть после шаг 6.2 бусины. Место шарики в трубку 2 мл белок низкой привязки.
  5. Ресуспензируйте бисер в 1558 мкл RIPA буфера, а затем добавить 200 мкл 10 x блокирование реагента, 40 мкл 50 x Денхардта в раствор, 2 мкл, 100 x ингибитор протеазы коктейль и 200 мкл элюата, подготовлено в 5.7 шаг. Поворот на ночь при 4 ° C.
    Примечание: SDS в чип Элюирующий буфер был разбавлен более чем 10 раз в этом инкубации.
  6. Поместите трубку на магнитную подставку и ждать 1 мин для супернатант станет ясно. Отменить супернатанта, добавляют 1 мл Буфер RIPA и аккуратно перемешать. Повторите этот шаг 4 раза (5 стирок в общей сложности). После последнего мыть передача бисер в ДНК низкой привязки трубку и удалить супернатант.
  7. Добавить 200 мкл рабочего раствора микросхемы Элюирующий буфер и вращаться в течение 15 минут при комнатной температуре. Передача элюата в новой низким bindingTube ДНК.
    Примечание: Элюата может храниться при температуре-80 ° C.
  8. Выполните шаг 4 для decrosslinking ДНК. Ресуспензируйте очищенная ДНК в 20 мкл буфера TE.
  9. Проверьте качество ДНК, как описано в шаге 4.11 (см. репрезентативных данных, показано на рисунке 2D). (необязательно) Выполнить анализ обогащения путем количественного PCR как описано выше2. Десятикратное или большего обогащения должны соблюдаться.

7. Библиотека строительство

  1. Для каждого входа и образец ДНК чип рассчитайте долю ДНК в регионе 100 – 500-bp, используя функцию анализа мазка программного обеспечения для машины microfluidic электрофореза. Оценить объем пробы, необходимые для получения 2 нг 100 – 500 bp ДНК. Используйте 20 нг ДНК в диапазоне 100 – 500-bp образцом «вход».
  2. Пипетка образцы ДНК в пробирки 8-газа ПЦР и добавьте H2O довести объем до 10 мкл. (необязательно) Если объем ДНК превышает 10 мкл, пропорционально шкале вверх следующие реакции конец ремонт и выбор размера.
  3. Подготовьте конец ремонт Мастер микс (см. Таблицу материалы). 4 мкл конец ремонт мастер смеси ДНК и Инкубируйте 30 мин при 20 ° C.
  4. 36 мкл 10 мм трис-Cl, рН 8,5 и объем 0,6 x (30 мкл) твердых этапа реверсивные иммобилизации (ОСПР) магнитные бусы и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
  5. Установите трубку на магнитную подставку и подождите, пока супернатант становится ясно.
  6. Супернатант передать новой трубки, добавьте 1.2 x тома (60 мкл) Спри магнитные бусы и инкубировать 5 мин при комнатной температуре.
  7. Установите трубку на магнитную подставку и подождите, пока супернатант становится ясно.
  8. Вымойте бусины дважды с 200 мкл 80% EtOH, держа трубку до сих пор на магните.
  9. Кратко центрифуга трубка для сбора остаточной EtOH внизу и поместить его обратно на магните. Тщательно удалите остаточную EtOH.
  10. Не закрывайте крышку трубки, для 1-2 мин позволить EtOH испаряться.
  11. Закройте крышкой и держать трубку на льду.
    Примечание: Теперь вы получили выбран размер ДНК 100 – 500 bp на бисер. Более подробная информация о двойной размер выделения можно найти на сайте производителя (www.beckman.com).
  12. Подготовка мастер A-хвостохранилища смесь (см. Таблицу материалы).
  13. Ресуспензируйте бусины (от шаг 7.10) с 10 мкл мастер смесь A-хвостохранилища и Инкубируйте 30 мин при температуре 30 ° C.
  14. Добавить объем 1.8 x (18 мкл) от полиэтиленгликоля (PEG) / раствор NaCl и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
  15. Выполните шаги 7,7-7.11 очистить ДНК.
  16. Подготовить лигирование буферной смеси (см. Таблицу материалы).
  17. Пипетка 8 мкл лигирование буферной смеси на бусины (от шаг 7.14), 1 мкл адаптер 1 мкм и Ресуспензируйте бисер. Используйте 1 мкл 5 мкм адаптер для ввода образца. Рассмотрите различные адаптеры для каждого образца для мультиплексирования.
  18. 1 мкл ДНК лигаза и Инкубируйте 15 мин при 20 ° C.
  19. Добавить 1.0 x тома (10 мкл) раствора ПЭГ/NaCl, Ресуспензируйте бисер и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
  20. Выполните шаги 7,7-7.10 для очистки ДНК.
  21. Пипетка 25 мкл 10 мм трис-Cl, рН 8,5 в трубку и Ресуспензируйте бисер.
  22. Добавьте 1.0 x объем (25 мкл) раствора ПЭГ/NaCl и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
  23. Выполните шаги 7,7-7.10 для очистки ДНК.
  24. Пипетка 11 мкл 10 мм трис-Cl, рН 8,5 в трубку и Ресуспензируйте бисер.
  25. Установите трубку на магнитную подставку и подождите, пока супернатант становится ясно.
  26. Соберите супернатант в новой 8-газа ПЦР-пробирку.
  27. Подготовка в реальном времени PCR главный микс (см. материалы для подробной информации).
  28. Пипетка 8.5 мкл в реальном масштабе времени PCR мастер смеси в 384-ну количественного PCR (ПЦР) плита и добавить 1,5 мкл адаптера лигируют ДНК (от шаг 7.26).
  29. Пипетка 10 мкл каждого флуоресцентные стандарта в пустой скважин.
  30. Выполнять ПЦР в реальном времени с следующие программы: (98 ° C на 45 s) x 1 цикл, (98 ° C 15 сек, 60 ° C за 30 s, 72 ° C для 30 s) x 20 циклов, и (72 ° C для 60 s) x 1 цикл.
  31. Определите количество циклов PCR, необходимых для достижения интенсивности флуоресценции флуоресцентные стандарт 2.
  32. Подготовка мастер ПЦР смесь (см. Таблицу материалы).
  33. Пипетка 11,5 мкл мастер смесь ПЦР в оставшихся лигируют адаптер ДНК (шаг 7.26) и выполнять ПЦР, как указано в шаге 7.30 с циклами PCR определены в шаге 7.31.
  34. Добавьте 1.0 x объем (20 мкл) раствора ПЭГ/NaCl и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
  35. Выполните шаги 7,7-7.10 для очистки ДНК.
  36. Пипетка 20 мкл 10 мм трис-Cl, рН 8,5 в трубку и Ресуспензируйте бисер.
  37. Установите трубку на магнитную подставку и подождите, пока супернатант становится ясно.
  38. Соберите супернатант в новой трубки 1,5 мл ДНК низкой привязки.
  39. Проверьте качество библиотеки, как описано в шаге 4.11 (см. репрезентативных данных, показано на рисунке 2E и F). Используйте 1 мкл пример библиотеки ДНК. (необязательно) Выполните анализ обогащения, ПЦР, как описано выше 2. Десятикратное или большего обогащения должны соблюдаться.

8. секвенирование

  1. Последовательность библиотек в секвенсор следующего поколения (см. репрезентативных данных, показанный на рисунке 3).
    Примечание: Глубина последовательности, достаточно для анализа данных будет отличаться в зависимости от размера геном организма3. Для человека и мыши, мы рекомендуем получить по крайней мере 20-40 миллионов сингл конце читает. По мнению урожайности гласит мультиплексирование может быть экономически эффективным.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем рассечение тканей, фиксации, лизис клеток, тандем очистки хроматина, и подготовка библиотеки ДНК для следующего поколения секвенсорами. Во время процедур один можно проверить качество ДНК, которая является ключом к успешной виртуализации, на несколько шагов (рис. 2). Поскольку один нуклеосома обычно окружена 147 bp ДНК 4, стриженый ДНК не должно быть короче, чем размер. Сразу же после ultrasonication ДНК был изолиров...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наш протокол был оптимизирован для нейронов мозга мыши, в котором выражение с тегами Флаг H2B индуцируется тамоксифен инъекции. Промоутеры, используемые для выражения H2B, исходных материалов ткани и количество тканей являются ключевой параметрами для успешной tChIP след Таким образом оптимизация этих факторов следует рассматривать для каждого типа клеток интереса.

Важнейшим шагом среди процедуры, используемые в настоящем Протоколе является стрижка для достижения хроматина длиной 100-500 bp

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим всех членов Ивасаки лаборатории для критических чтении рукописи. Эта работа была частично поддерживается за счет целевых субсидий для научных исследований в инновационных областях (#26113005 с.н. и JP17H05679 с.и.); субсидий для молодых ученых () (JP17H04998 для с.и.) от министерства образования, науки, спорта и культуры Японии (МПКСНТ); и новаторские проекты всех RIKEN проект «Заболевания и Epigenome «от RIKEN (чтобы с.н. и с.и.) и «Сотовой эволюция».

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Протеин LoBind tube, 2 млEppendorfNo.  0030108132Для лизиса клеток
Protein LoBind tube, 1,5 млEppendorfNo.  0030108116Для ChIP и подготовки библиотеки
DNA LoBind tube, 1,5 млEppendorfNo.  0030108051Для ChIP и подготовки библиотеки
8-полосная ПЦР-пробиркаBIO-BIK3247-00Для подготовки ChIP и библиотеки
SK MillTOKKENSK-200Удобная криогенная мельница для изготовления клеточного порошка для фиксации
Металлическая пуляTOKKENSK-100-DLC10Принадлежность SK Mill
2 мл Трубка из нержавеющей сталиTOKKENTK-AM5-SUSОпция для ячейки лизис
2 мл держатель трубки из нержавеющей сталиTOKKENSK-100-TLОпция для лизиса клеток
16% формальдегида (w/v), без метанолаПирс28906Для фиксации клеток. Перед применением приготовьте 1% раствор.
ГлицинNacalai Tesque17109-35Подготовить 2,5 М бульон
D-PBS (-)(1x)Nacalai Tesque14249-24Для промывки лизата и очищенной ДНК
HEPESNacalai Tesque02443-05Для буфера для лизиса 1. Подготовьте 1 М, pH 7,5 подвоя.
5 M NaCl, класс молекулярной биологииNacalai Tesque06900-14Для буфера для лизиса 1, буфера для лизиса 2, буфера для элюирования ChIP и буфера Tris-EDTA-NaCl
0,5 M EDTA, класс молекулярной биологииWako Pure Chemical Industries, Ltd.311-90075Для буфера для лизиса 1, буфера для лизиса 2, буфера для элюирования ChIP и буфера для глицерина Tris-EDTA-NaCl
Wako Pure Chemical Industries, Ltd.072-04945Для буфера для лизиса 1
NP-40Nacalai Tesque25223-75Для буфера для лизиса 1
Triton X-100, класс молекулярной биологииNacalai Tesque12967-32Для буфера для лизиса 1
TrisNacalai Tesque35406-91Для буфера для лизиса 2, буфера для элюирования ChIP и буфера Tris-EDTA-NaCl. Подготовьте 1 М, pH 8,0 подвоя.
0,1 М EGTA pH нейтральныйNacalai Tesque08947-35Для лизиса Буфер 2
Коктейль ингибиторов протеазы (100x)Nacalai Tesque25955-24Для блокировки деградации белка
RIPA буферThermo Fisher Scientific89900Для лизиса и промывки клеток
milliTUBE 1 мл AFA FiberCovaris520130Sonicator Tube. Принадлежность сфокусированного ультразвука
Сфокусированный ультразвуковойCovarisS220 или E220Для расщепления ДНК в размере, достаточном для ChIP-Seq
UltraPure 10% SDSThermo Fisher Scientific15553-027Для ChIP элюирующий буфер
РНКаза ANacalai Tesque30141-14Для очистки ДНК от лизата
Протеиназа К, рекомбинантная, ПЦР классаSigma-Aldrich3115887001Для очистки ДНК из лизата
этанолакомпания Wako Pure Chemical Industries, Ltd.054-07225Получить 70% раствор
Моноклональное антитело против FLAG M2, полученное у мышейSigma-AldrichF1804Для очистки хроматина, экспрессируемого в клетках, представляющих интерес
Dynabead M-280 Sheep Anti-Mouse IgGThermo Fisher Scientific11201DЭто может быть использовано для анти-FLAG IP и анти-H3K4me3 IP
Анти-три-метилгистона H3 (K4), мышиного моноклонального антителаWako Pure Chemical Industries, Ltd.301-34811Любое другое антитело, которое работает для анализа ChIP, будет работать
10x Блокирующий реагентSigma-Aldrich11096176001Для блокировки во время аффинной очистки
Denhardt' s растворNacalai Tesque10727-74Для блокировки во время аффинной очистки
Гликоген (5 мг/мл)Thermo Fisher ScientificAM9510Для очистки ДНК из лизата
Qubit 2.0 ФлуориметрThermo Fisher ScientificQ32866Для количественного определения выделенной ДНК
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo Fisher ScientificQ32851Для количественного определения выделенной ДНК
0,5 мл пробиркаAxygen10011-830Для количественного определения кубитом
фенола/хлороформа/изоамилового спирта (25:24:1)Nacalai Tesque25970-56Для очистки ДНК от лизата
Бусины AMPure XP BeckmanCoulterA63881SPRI магнитные шарики для подготовки библиотеки
Металлическая решетка для льдаFunakoshiIR-1Для хранения лизата клеток в замороженном
видеОхладитель образцовNew England BiolabsT7771SПомогает исправить клетки с минимальными повреждениями
2100 БиоанализаторAgilent TechnologiesG2939BAДля проверки качества выделенных фрагментов ДНК. Можно использовать еще один анализатор фрагментов.
Биоанализатор 2100 Экспертное программное обеспечениеAgilent TechnologiesG2946CAВ комплекте с биоанализатором
Высокочувствительный набор ДНКAgilent Technologies5067-4626Для проверки качества выделенных фрагментов ДНК
KAPA LTP Library Preparation KitRoche 07961898001Поставляется с 10x буфером для восстановления концов KAPA, смесью ферментов для восстановления концов KAPA, буфером для хвоста KAPA, A-хвостовым ферментом KAPA, буфером для лигирования KAPA, ДНК-лигазой KAPA и раствором ПЭГ/NaCl
NEXTflex ДНК штрих-кодыBIOO ScientificNOVA-514101Адаптер для подготовки библиотеки. Поставляется с адаптерами штрих-кодов ДНК и смесью праймеров.
Набор для амплификации библиотеки KAPA в реальном времениRoche07959028001поставляется с 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, PCR Primer Mix и флуоресцентными стандартами,
2x KAPA HiFi HotStart ReadyMixRocheKM2602для подготовки библиотеки. Кроме того, этот фермент может потребоваться для набора KAPA Real-Time Library Amplification Kit
Buffer EBQiagen1908610 mM Tris-Cl, pH 8,5 для элюирования ДНК
386-луночной кПЦР-планшетомThermo Fisher Scientific4309849Для ПЦР в реальном времени
QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR SystemThermo Fisher Scientific4485701Для количественного определения ДНК
MicroAmp Optical Adhesive FilmThermo Fisher Scientific4311971Для ПЦР в реальном времени
MicroAmp Прозрачная клейкая пленкаThermo Fisher Scientific4306311Для герметизации пластин
Мастер-смесьCombine 1.4 &; л 10x KAPA Буфер для ремонта концов, 1 & микро; л смеси ферментов KAPA End Repair и 1,6 & микро; L из H2O
A-taling master mixCombine 1 µ л хвостового буфера КАПА, 0,6 мк; L фермента хвостового содержания KAPA и 8,4 & микро; L H2O
Лигионная буферная смесьCombine 2 µ L лигирующего буфера KAPA и 6 &микро; L of H2O
для ПЦР в реальном времениCombine 5 µ л 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, 0,35 &; л смеси праймера для ПЦР (10 & микро; М каждый из прямого праймера AATGATACGGCGACCGAG и обратного праймера CAAGCAGAAGGGCATACGAG), и 3.15 &микро; L H2O
PCR master mixCombine 10 µ л 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0.9 & микро; л смеси праймера для ПЦР, и 0,6 & микро; L of H2O
Integrative Genomics ViewerBroad InstituteIGV_2.3.88Браузер генома для визуализации данных секвенирования
ДНК олгионуклеотид: 5′-GCCTACGCAGGTTGCTGAC-3′Eurofins GenomicsПраймер для амплификации промоторной области
олгионуклеотида GAPDH ДНК: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′Eurofins GenomicsПраймер для амплификации промоторной области GAPDH
SYBR Premix Ex TaqTakaraRR420LДля количественного определения ДНК, соответствующей промоторной области GADPH
Thermal Cycler DiceTakaraTP870Для количественного определения ДНК, соответствующей промоторной области GADPH
аппарат для конечного ремонта Мастер-смесь

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mito, M., et al. Cell type-specific survey of epigenetic modifications by tandem chromatin immunoprecipitation sequencing. Scientific Reports. 8 (1), 1143(2018).
  2. Kadota, M., et al. CTCF binding landscape in jawless fish with reference to Hox cluster evolution. Scientific Reports. 7 (1), 4957(2017).
  3. Jung, Y. L., et al. Impact of sequencing depth in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Research. 42 (9), (2014).
  4. Becker, P. B., Workman, J. L. Nucleosome remodeling and epigenetics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (9), a017905(2013).
  5. Kidder, B. L., Zhao, K. Efficient library preparation for next-generation sequencing analysis of genome-wide epigenetic and transcriptional landscapes in embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. , 3-20 (2014).
  6. Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645(2012).
  7. Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
  8. Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
  9. Hornstein, N., et al. Ligation-free ribosome profiling of cell type-specific translation in the brain. Genome Biology. 17 (1), 149(2016).
  10. Zhao, Y., Garcia, B. A. Comprehensive catalog of currently documented histone modifications. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), a025064(2015).
  11. Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. The Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

TChIP SeqChromatin ImmunoprecipitationHistone ModificationCell Type SpecificEpigenome ProfilingTissue DissectionCryogenic GrindingFormaldehyde FixationSonication ChromatinAffinity Purification

Related Articles