Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Очищение протеина анаэробных и кинетический анализ через электрод кислорода для изучения DesB Dioxygenase деятельность и ингибирование

8.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58307

⸱

3 октября 2018 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Wesleyan University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем собой протокол для очистки белков анаэробных, анаэробные белка концентрацию и последующих кинетические характеристики, с помощью системы электрода кислорода. Этот метод иллюстрируется с помощью фермента DesB, dioxygenase фермента, который является более стабильным и активным, когда очищается и хранятся в анаэробной среде.

Аннотация

Кислород чувствительной белков, включая те ферменты, которые используют кислород как субстрат, можно сократить стабильности, когда очищается с помощью методов традиционной аэробной очистки. Эта рукопись иллюстрирует технических деталей, участвующих в процессе анаэробной очистки, включая подготовку буферов и реагенты, методы для колоночной хроматографии в бардачок и обессоливания белка до кинетики. Также описаны методы для подготовки и использования кислорода электрода для выполнения кинетическая характеристика фермента использования кислорода. Эти методы иллюстрируются с помощью фермента dioxygenase DesB, dioxygenase галлат от бактерии Sphingobium sp. штамм SYK-6.

Введение

Ферменты, которые используют железа или других металлов для активации кислорода часто восприимчивы к инактивации во время процесса очистки из-за их удаление из среды снижение ячейки. Таким образом эти белки должны использоваться в качестве lysates клетки, подвергаться внешней восстановителями или очищаться анаэробно обеспечить, что они имеют оптимальный ферментативную активность1,2,3,4. Для этих ферментов, которые являются кислорода чувствительных (специально железосодержащих ферментов), выполнения всех шагов очистки и характеристик при сохранении анаэробных условий необходимо полностью охарактеризовать их. Это привело исследователей развивать весь лабораторных установок в пределах анаэробные камеры для исследований, начиная от выражения протеина по кристаллографии5,6,,7,8 .

Здесь мы сообщаем методы анаэробной очистки и кинетические характеристики фермента DesB, с помощью системы электрода кислорода. DesB является галлат dioxygenase от бактерии Sphingobium sp. штамм SYK-6, что связано с LigAB, protocatecuate dioxygenase из же организма. Оба ферментов принадлежат к надсемейства dioxygenase (PCAD) protocatechuate II типа, который не были широко изучены Дата9, вероятно, отчасти благодаря ферменты этого надсемейства, быть восприимчивым к инактивации когда очищается с помощью стандарта аэробных методы очистки белков. Поскольку некоторые из ферментов PCAD отображения субстрата распущенность, в то время как другие являются конкретного субстрата2,10, далее характеристика этого надсемейства необходимо выявить факторы, определяющие специфику. Как было отмечено в нескольких фермента superfamilies11,12,13,14,15, малые молекулы могут изменить деятельность через прямой конкурентного ингибирования или связывание молекул, чтобы отделить аллостерический карманы, которые вызывает увеличение или снижение ферментативной активности16. Хотя кинетики в одиночку не может отличить расположение привязки модулятор, определение величины изменения деятельности имеет важное значение для понимания воздействия. Как такие, методы для кинетические характеристики родной DesB деятельности и его активности в присутствии 4-nitrocatechol (4NC), соединение, обычно используется для характеристики и подавляют dioxygenase ферментов2,17, 18, отображаются.

DesB способен сломать галлат, производные лигнина ароматические соединения, через extradiol реакция dioxygenase (Эдо), в котором кольцо открытия является катализатором, используя кислород как один из10,субстратов19. Ферментативная реакция происходит в контексте распада лигнина, ароматических heteropolymer найдены в клеточной стенки растений. Лигнин может быть depolymerized, уступая различных ароматических соединений, которые могут быть разбиты на Центральный метаболиты3,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,,2930,,3132,33 . Extradiol dioxygenases (Эдо) катализировать кольцо открытие реакция на dihydroxylated ароматических соединений, где расщепления происходит рядом с метал координировала диол; в отличие от intradiol dioxygenases расщеплять аналогичных ароматических соединений между двумя группами гидроксила (рис. 1). EDOs, как и многие другие metalloenzymes имеют двухвалентной металла центр для координации Fe(II), состоящий из двух гистидин, один карбоксилатных Триада9,34,35. Эти metalloenzymes стать окисляется, через autoxidation или на основе механизм инактивации, тогда как фермента отображается неактивным2,36,,3738.

В экспериментальной процедуры, описанные в этой рукописи мы используем DesB, членом PCAD отходящий от бактерии Sphingobium sp. SYK-6, чтобы катализировать Добавление кислорода через C4-C5 Бонд галлат (рис. 2A). Regiochemistry этого расщепления является аналогом LigAB, который является protocatechuate-4,5-dioxygenase (рис. 2B). До настоящего времени расследования этой галлат dioxygenase включают в себя никаких сообщений о соединений, которые подавляют DesB10,19,39. С использованием методов аэробной очистки DesB выставлены переменную активность, в то время как с использованием анаэробных методов мы смогли последовательно получить белка с воспроизводимых активностью. Кинетические исследования, описанные здесь показывают методы для анаэробной очистки DesB, кинетические характеристики реакции DesB с галлат, и ингибирование DesB, 4-nitrocatechol (4NC).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Общие материалы и методы

  1. Подготовьте все необходимые средства массовой информации, как описано в таблице 1. Обработайте автоклавированием при температуре 120 градусов на 15 мин стерильными фильтр SOC решение, после добавления MgCl2 и глюкозы, путем передачи его через фильтр 0.2 мкм. Отрегулируйте пэ-аш Миллер Lysogeny бульон (LB СМИ) решения перед автоклавированием. Дополнить LB-Amp СМИ решения после автоклавирования с стерильных растворов 0,2 мм L-цистеина, затем 0,1 мм черных сульфат аммония для укрепления выражение протеина и растворимость.
  2. Подготовьте буфер Лэмли и идущий буфер для электрофореза геля полиакриламида (страница), как описано в таблице 2. Отрегулируйте пэ-аш решения (с помощью 1 М HCl и Tris база подготовки буфера) до разбавления компоненты для их заключительного тома.
  3. Подготовьте буферы для очищение протеина, как описано в таблице 3. Отрегулируйте пэ-аш решения (с помощью 1 М HCl и Tris база подготовки буфера) до разбавления компоненты для их заключительного тома.
  4. Передать подготовленные буферов бутылку, которая может быть опечатаны с одним отверстием резиновой пробкой и содержит стеклянную трубку.
    1. Используйте шланг для подключения к источнику вакуума стеклянная трубка в пробку. Дайте раствору Дега под отрицательным давлением для примерно 30 минут, помешивая на средней скорости.
    2. Разбейте вакуума, которую печать во-первых, затем выключить пылесос. Далее проколоть через резиновую пробку с двумя иглами 20G (один достаточно долго, чтобы добраться до нижней части бутылки и один короче иглы, которая может использоваться как побег газоотвода). Пузырь в устойчивый приток азота помешивая на средней скорости в течение 30 мин.
    3. Удаление иглы и повторите дегазации и восходящей азота для в общей сложности трех циклов. Когда закончите, правильно печать бутылки с твердой резиновой пробкой. Дальнейшего обеспечения пробку с парафином фильм и медный провод (20G) и поместите их в бардачком.
      Примечание: Все материалы размещены в бардачком и подвергается 3 циклов очистки приемной, следуют всасывании из кислорода и Заправка азотом. Буферы, используемые для очищения и концентрации можно максимум и хранятся в перчаточном ящике на неопределенный срок.
  5. Приготовляют раствор dithionate натрия, растворяя приблизительно один шпатель (0.31 "x 2", меньших конце шпателя двусторонний микро конические из нержавеющей стали) с dithionate натрия в приблизительно 1 мл дегазации воды в пробки microcentrifuge 1,5 мл . Уплотнение трубку с парафином фильм до удаления от перчаточного ящика.
    Примечание: Хранить твердых натрия dithionate в перчаточном ящике для предотвращения окисления.

2. Подготовка столбце амилоза очищение протеина

  1. Сделайте навозной жижи с высокой потока амилоза смолы (15 мл) в сочетании с 5 столбец томов (75 мл) амилоза столбца буфера. Перевести раствора смолы на две бутылки 50 мл сыворотки и печатью каждая бутылка с резиновой перегородки. Прокол 20G, 305 мм иглы через перегородками и пузырь азота в суспензии для примерно 1 минуту для удаления кислорода из подвеска. Передача смолы и белковые решения в перчаточном ящике.
  2. В перчаточном ящике залейте смолой в столбец боросиликатное 2 x 30 см, с простой краном, позволяя смолы для урегулирования и создания уровня кровати. Слить буфере столбец и сбалансировать столбец с 3 колонки тома (~ 30 мл всего) дегазацию амилоза столбца буфера с помощью газа под давлением азота добиваться буфер через смолы на примерно 1 капля/с или 5 мл/мин, до тех пор, пока растворитель находится чуть выше ионита.
    Примечание: После белок является этого eluted (см. шаг ниже 3.5), амилоза столбца смола регенерируется путем промывания с объемом 1 колонка (10 мл) воды, затем 1 колонка объем лаурилсульфат натрия 1% (СДП) и, наконец, 3 колонки тома (30 мл) воды. Этот шаг может быть завершена за пределами перчаточный ящик. Смола столбца хранится при температуре 4 ° C в 20% этанола и могут быть восстановлены до 5 раз.

3. белков и анаэробной очистки DesB

Примечание: DesB ген был коммерчески синтезирован, в ПЭТ 15b, ПЭТ 32a и pMAL-c5x векторов с использованием NdeI и BamHI ограничения, клонирование объектов были помещены.

  1. Полное выражение анализы белка согласно рекомендациям производителя чтобы определить правильные условия для больших масштабах выражение (вкратце описано ниже).
    1. Преобразование DesB содержащих плазмид в коммерчески сделал, химически компетентным E. coli BL21 (DE3) клетки, согласно инструкциям производителя. Вкратце, оттепель клетки на льду за 10 мин, добавить примерно 10-50 нг плазмидной ДНК в клетки смесь, теплового шока клетки при 42 ° C 10 s и инкубировать их на льду для дополнительные 5 минут добавить SOC СМИ для получения окончательного объема 1 мл и позволяют клетки, чтобы пожать (~ 200 об/мин) при 37 ° C 60 мин. LB-Amp тарелку добавить и распространение 100 мкл раствора клеток и Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
    2. Выберите единый блок, образуя колонии от пластины после ночи инкубации и использовать этот колонии для инокуляции 10 мл LB-Amp средств массовой информации. Вырасти клетки на ночь, при встряхивании (~ 200 об/мин) при 37 ° C.
    3. 10 мл средства массовой информации 100 мкл раствора ночи роста и поколебать новых средств массовой информации, как описано в шаге 3.1.2 при 37 ° C. Когда оптическая плотность 600 Нм (600OD) составляет 0,4-0,8, добавить изопропиловый β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) для получения окончательного решения концентрации 1 мм.
    4. Немедленно удалите Алиготе 1 мл раствора и перенести его на 1,5 мл microcentrifuge трубка с метками времени = 0 часов. Вращайте трубу на 15000 x g за 10 мин до Пелле клетки. После спиннинг, удалить супернатант и хранить клетки при 4 ° C.
    5. Удалите дополнительные аликвоты (по 1 мл) промежутки времени после добавления IPTG (обычно на 5, 10, 12, 18 и 24 ч). Как описано в шаге 3.1.4, центрифуга каждой трубы, декантируют супернатанта и хранить клетки при 4 ° C.
    6. После того, как все, что в получаются аликвоты, Ресуспензируйте клетки от каждого timepoint в 30 мкл раствора бактериального белка добычу, инкубировать их при комнатной температуре за 10-15 минут и центрифуги трубы на 15000 × g на 5 минут, чтобы отделить растворимых и нерастворимых белки.
    7. Передать новые пробки microcentrifuge решение растворимого белка и Ресуспензируйте оставшиеся нерастворимые окатышей с 30 мкл раствора бактериального белка добычу.
    8. Совместить с равным объемом буфер Лэмли 30 мкл каждого решения (как растворимые и нерастворимые решения для каждого timepoint), а затем визуализировать на гель SDS-PAGE40. Выберите условия, соответствующие полосы, содержащее правильный размер полосы в растворимая фракция для выражения протеина в больших масштабах и очистки.
      Примечание: Поскольку минимальный растворимого белка изначально был создан с помощью указанных выше условий, различные добавки были добавлены для проверки воздействия на выражение растворимого белка, с 0,2 мм L-цистеина и черных сульфат аммония 0,1 мм показаны расширенные белка выражение. Согласно этот экран выражение протеина вектор соответствующее выражение для производства растворимых DesB был pMAL-c5x вектора.
  2. После преобразования в Escherichia coli BL21 (DE3), сделать запас DesB/pMal-c5x, объединяя 900 мкл бактериальной культуры (выращенные ночлега с встряхивания на 200 об/мин, 37 ° C) с 100 мкл 80% глицерина. Храните запас на-80 ° C в криогенных трубку.
    Примечание: Сделать новую замороженные фондовой примерно каждые 6-8 месяцев.
  3. Используете наконечник пипетки скрести клетки из замороженных запасов и начать бактериальной культуры, растущих на ночь в 5 мл LB-Amp СМИ при 37 ° C при встряхивании. Прививать 1,5 литра LB-Amp СМИ в 2 Л флакон при 37 ° C и 200 об/мин, используя ночь выросли бактериальной культуры.
    Примечание: Из-за наблюдаемого чувствительности белка для кислорода, было установлено, что снижение headspace в колбу и умеренные встряхивания скорости улучшение белка урожай для крупномасштабных выражения.
  4. Побудить выражение протеина когда оптическая плотность 600 Нм (600OD) составляет 0,4-0,8 с 1 мм ИПТГ и дополнены 0,2 мм L-цистеина и 0,1 мм черных сульфат аммония. Снижение температуры инкубации до 30 ° C и погрозит 200 об/мин. Спин вниз клеток с помощью центрифугирования после 24 ч после индукции на 4700 x g 10 мин и отбросить отработанного СМИ.
  5. Ресуспензируйте Пелле клеток в 20 мл амилоза столбца буфера на каждые 1,5 Л роста, с последующим добавлением 1 мг лизоцима. Мешайте в течение 20 минут на льду.
    Примечание: Более буфера могут быть добавлены если решение является слишком вязкое, как белка решения, которые являются слишком вязкой может нарушить следующий шаг гомогенизации.
  6. Лизируйте решение ресуспензированы клеток через высокого давления гомогенизации с 3-5 проходит на приблизительно 15 000 psi. Передача белка до 50 мл пластиковых пробирок и промойте headspace азотом за 1 мин. Затем центрифуга ячейки lysate на 20000 x g 40 мин для удаления нерастворимых мусора.
    Примечание: Успешный гомогенизации вызывает белка в форме мицеллы, как она течет через трубку и в коллекции колбу, и решение отображается как полупрозрачный серо коричневого цвета. Держите гомогенизированные белка на льду на протяжении всего процесса.
  7. После центрифугирования передачи супернатант в 50 мл трубки (больше, чем один может потребоваться), крышка трубки с резиновой перегородки и 20-иглы, медленно пузырь азот через решение для 2 минут для вытеснения кислорода. Оберните перегородки с парафином фильм и далее закрепите его с медной проволоки и принести супернатант в перчаточный ящик вместе с материалами столбца.
  8. Сбалансировать столбце (см. шаг 2.3) и загрузить белка супернатанта на столбец. Соберите потока через в 5 мл фракций под умеренно под давлением азота (1 капля/секунду или около 5 мл/мин). Затем промойте колонку с использованием еще 3 колонки томов амилоза столбца буфера и вручную собирать фракции 3 мл в стеклянные пробирки под умеренно под давлением азота (около 5 мл/мин). Элюировать белка, используя 5 столбец томов (~ 50 мл) буфера и вручную собрать 3 мл фракций под давлением умеренной азота (около 5 мл/мин).
    Примечание: Фракции может альтернативно собрана с помощью гравитации фильтрации. Приблизительно 12 элюции фракции должны быть собраны.
  9. Сбор 30 мкл аликвоты фракций и удалять их из перчаточного ящика, чтобы позволить визуализации белковые фракции через анализ SDS-PAGE.
    Примечание: Собранные фракции остаются в перчаточном ящике в течение этого теста. Очищенный DesB обычно elutes из столбца в 3-5 фракций.

4. анаэробных белка концентрацию/буфера обмена

  1. Соберите концентратор клеток под давлением, перемешивают с 76-мм восстановленной целлюлозы мембранный фильтр (отсечки 10 кДа). Добавьте достаточное количество 20% этанола в концентратор держать мембраны, мокрый как собрал концентратор переводится в бардачок.
    Примечание: Убедитесь, что есть без слез в мембране и что уплотнительное кольцо не морщинистой.
  2. После чего концентратор перемешивают клеток в бардачке, промывочный раствор этанола от мембраны с водой. Крышка и давление перемешивают ячейку для очистки труб и мембраны любой избыток воды.
  3. Добавьте всех фракций, содержащих белок определяется SDS-PAGE (рис. 3) на концентратор. Добавьте достаточно буфер обмена приносить 150 мл объема раствора общего белка.
  4. Давление зале перемешивают клеток с помощью внешней линии N2 и концентрат белка до 50 мл с умеренной скорости перемешивания.
    Примечание: Достижение концентрации 50 мл занимает около 20 мин.
  5. Дополнение к 100 мл буфера обмена с 0,1 мм Дитиотреитол (DTT) и черных сульфат аммония 0,1 мм, добавить решение в перемешиваемой ячейку и концентрат белка в суммарный объем 50 мл с умеренной перемешивания скорость.
  6. После того, как решение достигает объемом 50 мл, добавить в буфер обмена дополнениями еще раз, но сосредоточиться решения общим объемом 10 мл с умеренной скорости перемешивания.
  7. Фильтр концентрации протеина используя 0,45 мкм поры размер шприца фильтр и Алиготе в отдельных 0,2 мл полимеразной цепной реакции (ПЦР) трубы (каждый из которых содержит приблизительно 150 мкл раствора белка). Снять перчаточный ящик ограничен аликвоты и сразу же вспышки заморозить их жидким азотом. Хранить аликвоты-80 ° c.

5. обессоливания DesB

  1. Промойте Перчатка Сумка с газом азота примерно 1,5 часов перед использованием.
  2. Оттепель 150 мкл Алиготе очищенный протеин DesB внутри Перчатка Сумка, на льду.
  3. В то время как белок тает, подготовьте небольшой тяжести, обессоливания столбец, содержащий 3 мл G-25 торфов грубый опреснительной геля в столбце боросиликатное 9 мл. Промойте колонку с 2 колонки тома (~ 6 мл) о дегазации опреснения буфера.
    Примечание: Замените опреснительной гель, когда есть изменения в гель цвета от белого до желтого (после приблизительно 7 использует).
  4. Загрузите талой DesB на столбец с помощью процесса под контролем гравитации. Отказаться от потока через. Элюировать белка с приблизительно 5 мл обессоливания буфера.
    Примечание: Давление от бензобака, постоянно заполнения мешка перчатка будет влиять на скорость, с которой решения капать из столбца.
  5. Для первоначального определения белка элюции из столбца Соберите 12 ампул/смывах (содержащие 3 капли на флакон). Герметичный с резиновой септум, удалите их из перчатка сумка и тест на наличие белка, либо непосредственно (через анализ геля SDS-PAGE) или косвенно (через изучение деятельности каждой фракции).
    Примечание: Как правило, фракций тестируются индивидуально для деятельности, как описано в пункте 7.1, с наибольшей активности соответствует дроби с наибольшей концентрацией активных белка. DesB обычно elutes, начиная с 7-падение, после чего собираются следующие 9 капель обессоленной белка. Белка аликвоты хранятся на льду во время измерения кинетики (шаги 7.1-7.4).

6. Подготовка кислорода электрод

  1. Польский Кольцо серебро анод и платины катод с электрод чистого и Q-tip влажной до тех пор, пока есть никаких видимых признаков черный оксид месторождений.
  2. С ножницами вырежьте приблизительно один 1,5 дюймовый квадрат прокладку бумаги (или сигареты прокатки, который работает одинаково хорошо как). Затем нарежьте 1) треугольники на каждом лице площади и 2) щели углы для помощи перенос электрода.
  3. Добавьте 5 капель введение 50% раствора KCl на Серебряный анода паза и соединить их так, что они формируют одно непрерывное кольцо раствора. Добавьте 2 капли 50% раствора KCl в верхней части платинового электрода. Осторожно поместите прокладку бумаги поверх Платиновый электрод и зачищают прокладку бумаги так есть нет пузырьков воздуха.
    Примечание: Будьте осторожны, чтобы избежать разрывов прокладку бумаги.
  4. Отрежьте кусок мембраны ПТФЭ (политетрафторэтилен) S4 30 м, что составляет около 2 дюймов длиной и наложить его на прокладку бумаги. Обрезают кромки мембраны, так что они выравниваются с наружным кольцом электрода.
  5. Используя кольцо аппликатора, подтолкнуть небольшое кольцо электрода обеспечить прокладку бумаги и мембраны на электрод. Место больших уплотнительное кольцо на круговой паз электрода, обеспечить это не мембраны под ним. Слайд верхняя палата электрода на базу и завинтите два вместе.
    Примечание: Двумя болтами на правильно если не воздушные пузыри придерживаться стороны камеры.
  6. Установите собранный электрода на его базе и подключить электрод к системе мониторинга. Инициировать программу управления электрода и калибровки электрода, выполняя протокол калибровки жидкой фазы (рис. 4A). Переменной температуры должна быть температура в помещении, в котором проводится эксперимент, и переменной атмосферное давление зависит от региона и текущих погодных условий.
    Примечание: Атмосферное давление можно получить прогноз погоды для региона.
  7. Добавьте 1 мл буфера Tris 25 мм камере электродные, вставьте поршень, начать калибровку раствор насыщен кислородом и отрегулировать скорость мешалки до 100. После того, как электрод стабилизируется, набор точки калибровки для кислорода, насыщенный раствор определяется (рис. 4В).
  8. Без удаления поршень, используйте иглы и 1 мл шприц 1,2 x 40 мм для вставки примерно 1 мл раствора Дитионит натрия в камеру, стараясь избежать добавления воздушные пузыри (рис. 4 c). Использование резиновой пробкой для уплотнения электрода камеры сразу же после Дитионит натрия сложения.
  9. Разрешить калибровки продолжать до тех пор, пока весь кислород используется и завершения программы и сохранить калибровки (рис. 4 d). Аспирационная решение из камеры и промойте поршень и камеры с дейонизированной воде 5 - 6 раз для обеспечения полного удаления Дитионит натрия. Когда полоскания, используйте пластиковую трубку, оборудованных с кончиком пипетки подключен к стороне рука термос. Избегайте повреждения мембраны.

7. кинетические анализов с использованием кислорода электрод

  1. Идентифицировать обессоленной аликвоты, содержащие активные белка серийно тестирования 1 мкл раствора фермента для деятельности в решении буфера Tris 25 мм, с рН 7,5 и содержащие 100 мкм эпигаллокатехина. Использование aliquot(s) с наибольшей активности наблюдаемого для оставшихся экспериментов. (См. шаг 5.5.1)
  2. Определить скорость ферментативной реакции путем измерения потребления2 O, с помощью O2-чувствительных Кларк тип электрода с компьютерной интеграции через блок управления электрода.
    1. Для каждого кинетики данных точки измерения DesB, добавить 1 мл буфера Tris 25 мм (рН 7,5) в зале электрода. Добавьте вычисляемый объем запасов раствора галлат 25 мм в буфер Tris для достижения желаемого окончательный субстрата концентрации (0,05-25 мм).
      Примечание: Ежедневно готовят свежие акций решения галлат и тормозящий соединений с водой и при необходимости отрегулировать pH 7.5 с добавлением 0,1 мм NaOH.
    2. После 10 s перемешивания для смешивания раствора, уплотнение в камеру с поршень медленно и винта сверху вниз. Чистой ткани может использоваться для впитывать лишнюю жидкость, которая смещается от камеры. Разрешить электрод сбалансировать, где он может производить стабильные измерения концентрации кислорода в растворе для по крайней мере 1 минуту перед добавлением энзима (норма потребления фон O2 ± 0,5 мкм/мин).
    3. С помощью шприца туго 10 мкл газ, добавьте примерно в 1 мкл фермента (примерно 3-7 мкм фермент) электрода камере через поршень.
      Примечание: Количество фермента может быть увеличивается или уменьшается в ответ на наблюдаемых деятельности конкретных Алиготе для реакции показатели достаточными.
    4. Расчет скорости реакции, основанный на склоне первых 30 s линейных данных после добавления фермента и правильным для фона O2 потребления с помощью 30 s данных непосредственно перед добавлением энзима. Скорость катализа равны темпам потребления O2 (Рисунок 5A).
    5. После сбора данных для данного субстрата концентрации, пустые электрода камеры через стремление с помощью пластиковой трубки подключены к стороне рука термос и промывки неоднократно с водой для 4-6 циклов. Настройка решения в электроде, как описано в шаге 7.2.1, с использованием новой концентрации субстрата.
    6. Различаются концентрации субстрата неупорядоченным образом и реплицировать в ходе эксперимента, чтобы счета за снижение ферментативной активности со временем (Рисунок 5B).
      Примечание: При повторных измерений концентрации конкретных запускаются и продемонстрировать более, чем 30% снижение по сравнению с ранее выполнения, без дополнительных анализов должны быть выполнены с пакетной фермента. Как правило после 30-40 трасс, фермент демонстрирует 30% снижение активности.
    7. Определить кинетические параметры, kкошка (катализатора константа для преобразования субстрата продукта) и Km (константы Михаэлиса, оперативно определяется как первоначальный показатель концентрации субстрата половина максимальной скорости), путем наименьших квадратов монтажа данных от каждого из концентрации субстрата Michaelis−Menten уравнения (рис. 6) с помощью GraphPad призмы.
  3. Добавьте 4-nitrocatechol (4NC) для проверки ее влияние на кинетику dioxygenation и определить константы ингибирования (Kя) с DesB. Для каждого условия реакции, фондовый растворов трис (50 мм), галлат (25 мм) и 4NC (25 мм), объединяются и разбавляют водой до выход 2 мл раствора буфера Tris 25 мм (рН 7,5) с 1 мм галлат и различной концентрации 4NC. Объем 4NC был разнообразным для достижения желаемого окончательный ингибитор концентрации (0,05-20 мм).
    1. После 10 секунд перемешивания перемешивания раствора, место поршень в камере медленно и винта сверху вниз. Чистой ткани может использоваться для впитывать лишнюю жидкость, которая смещается от камеры. Разрешить электрода макроэкономическую и производить стабильные измерения концентрации кислорода в растворе для по крайней мере 1 минуту перед добавлением энзима (норма потребления фон O2 ± 0,5 мкм/мин).
    2. Как описано ранее, добавить белка (шаг 7.2.3), определить скорость реакции (шаг 7.2.4) и сброс электрода для следующего состояния.
    3. В рамках этой серии экспериментов Определите скорость реакции в отсутствие ингибитор несколько раз. Определите ингибирование стандартизации показатели потребления кислорода в присутствии различных концентраций ингибитора с 1 мм субстрата и отсутствие ингибитора (ov/v).
    4. Подходят с ингибированием галлат dioxygenation уравнение 7.3A, а затем ингибирование данные уравнения 7.3B, используя программу изображая диаграммой (рис. 7).
  4. Определите точное фермента концентрацию для каждого эксперимента, выполнив assay Брадфорд после завершения всех кинетических работает.
    Примечание: Все тарифы были исправлены для концентрации фермента. Этот шаг не нужно быть сделано в перчаточный ящик или мешок перчатки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Приведен анализ геля SDS-PAGE отдельных фракций от очистки DesB мальтозные связывания белка (MBP) слияние конструкции (рис. 3). Гель показывает, что белок является чистым (МВт = 91,22 кДа), за исключением наличия DesB (MW = 49.22 кДа) и MBP белка домен (42 кДа) расщепляется друг от друга. Для концентрации (шаг 4.2) были отобраны фракций E2 и E3.

Воспроизводимые результаты кинетического анализа DesB ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Важнейшие шаги в получении активный, очищенный белок DesB включать формирование и поддержание снижения Fe(II) активного узла в фермента. Таким образом, исправление производительность индукции, очистки, концентрация, и опреснительные шаги необходимы для успешного получения активных ферментов. Вызывая выражение протеина в присутствии черных сульфат аммония 1 мм гарантирует, что Fe(II) правильно включены в активный сайт DesB. Этот метод основывается на исследованиях как те с amidohydrolase metalloenzymes, который часто треб...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы могут не конкурирующих финансовых интересов или другие конфликты интересов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить доктора Camille Keller Уэслианского университета для получения технической поддержки. Особая благодарность профессор Линдси D. Eltis и Дженна K. Capyk из Университета Британской Колумбии, а также Кристиан Whitman из университета Техаса в Остине, за их рекомендации относительно методов очистки белков анаэробных и использование O2 -чувствительных электрода.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Изопропил β-D-1-тиогалактопиранодизGold Bio TechnologiesI2481C50
Coomassie Brilliant Blue R-250Bio-Rad161-0400
Персульфат аммонияBio-Rad161-0700
30% акриламидBio-Rad161-0158
N,N'тетраметилэтилендиаминBio-Rad161-0801
Амилоза смола с высокой скоростьюпотока Новая Англия BiolabsE8022S
BL21 (DE3) компетентные клетки Escherichia coliНовая Англия BiolabsC2527I
L-цистеинSigma AldrichC7352
галловая кислотаSigma AldrichG7384
4-нитрокатехинSigma AldrichN15553
Железо сульфат аммонияMallinckrodt5064
Дитионит натрияAlfa Aesar33381-22
бутылки с сывороткойпшеницы Fisher Scientific06-406G
25 мм Acrodisc PF Шприцевой фильтр с мембраной Supor MembranePall Corportation4187
400 мл Amicon Концентратор перемешанных клетокEMD MilliporeUFSC40001
76 мм Millipore Ultracel 10 кДа отсечка реконструированный целлюлозный мембранный фильтрEMD MilliporePLGC07610
DL-дитиотреитолGold Bio TechnologiesDTT50
Sephadex G-25 грубое обессоливание галколонка GE Healthcare17-0033-01
2 мл Обжимные флаконыFisher Scientific03-391-38
Oxygraph Plus блок управленияэлектродамиHansatechInstruments OXYG1 Plus
Кислородная электродная камераHansatech InstrumentsDW1
Электродный дискHansatech InstrumentsS1
PTFE (0,0125 ммX25 мм) 30м катушкаHansatechInstruments S4
Набор для чистки электродов HansatechInstruments S16
Прокладочная бумагаЗиг Загдоступный на любой АЗС
бардачок He-series Dri-LabВакуум/Атмосфера Компания
HE-493 Dri-TrainВакуум/Атмосферы Компания
Двусторонний микроконический шпатель из нержавеющей сталиFisher Scientific21-401-10
DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Колонна Экономичная КолоннаFisher Scientifick420400-1530
10 μ L, Model 701 N SYR, Цементированный NDL 26s ga, 2 дюйма, острие stlye 2 шприцHamilton80300
DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Экономичная колонна FisherScientific K420401-1505
Emulsiflex-C5 гомогенизатор высокого давленияAvestin
B-PER Полный реагент для экстракции бактериального белкаThermo Fisher Scientific89821
Лизоцим из белка куриного яйцаSigma Aldrich12650-88-3
Додецилсульфат натрияThermo Fisher Scientific151-21-3
ампициллинSigma Aldrich7177-48-2
ТриптонFisher ScientificBP-1421-500
Экстракт дрожжейFisher ScientificBP1422-2
ХлориднатрияFisher ScientificS271-10
Хлорид калияFisher ScientificP217-3
Хлорид магнияFisher ScientificM33-500
ДекстрозаFisher ScientificD16-3
Гидроксид натрияFisher ScientificS318-1
Трис гидрохлоридFisher ScientificBP153-500
MaltoseFisher ScientificBP684-500
GlycineFisher ScientificG46-500

Ссылки

  1. Awaya, J. D., Walton, C., Borthakur, D. The pydA-pydB fusion gene produces an active dioxygenase-hydrolase that degrades 3-hydroxy-4-pyridone, an intermediate of mimosine metabolism. Applied Microbiology and Biotechnology. 75 (3), 583-588 (2007).
  2. Barry, K. P., Taylor, E. A. Characterizing the Promiscuity of LigAB, a Lignin Catabolite Degrading Extradiol Dioxygenase from Sphingomonas paucimobilis SYK-6. Biochemistry. 52 (38), 6724-6736 (2013).
  3. Colabroy, K. L., Smith, I. R., Vlahos, A. H. S., Markham, A. J., Jakubik, M. E. Defining a kinetic mechanism for l-DOPA 2,3 dioxygenase, a single-domain type I extradiol dioxygenase from Streptomyces lincolnensis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1844 (3), 607-614 (2014).
  4. Imsand, E. M., Njeri, C. W., Ellis, H. R. Addition of an external electron donor to in vitro assays of cysteine dioxygenase precludes the need for exogenous iron. Archives of Biochemistry and Biophysics. 521 (1), 10-17 (2012).
  5. Tsai, C. -L., Tainer, J. A. Methods in Enzymology. David, S. S. 599, Academic Press. 157-196 (2018).
  6. Kuchenreuther, J. M., et al. High-Yield Expression of Heterologous [FeFe] Hydrogenases in Escherichia coli. Public Library of Science ONE. 5 (11), e15491(2010).
  7. Dupuy, J., et al. Crystallization and preliminary X-ray diffraction data for the aconitase form of human iron-regulatory protein 1. Acta Crystallographica Section F. 61 (5), 482-485 (2005).
  8. Fan, L., et al. XPD Helicase Structures and Activities: Insights into the Cancer and Aging Phenotypes from XPD Mutations. Cell. 133 (5), 789-800 (2008).
  9. Vaillancourt, F. H., Bolin, J. T., Eltis, L. D. The ins and outs of ring-cleaving dioxygenases. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 41, 241-267 (2006).
  10. Sugimoto, K., et al. Molecular Mechanism of Strict Substrate Specificity of an Extradiol Dioxygenase, DesB, Derived from Sphingobium sp. SYK-6. Public Library of Science ONE. 9 (3), e92249(2014).
  11. Lewis-Ballester, A., et al. Structural insights into substrate and inhibitor binding sites in human indoleamine 2,3-dioxygenase 1. Nature Communications. 8, (2017).
  12. Lipscomb, J. D., Hoffman, B. M. Allosteric control of O-2 reactivity in Rieske oxygenases. Structure. 13 (5), 684-685 (2005).
  13. Mccray, J. A., Brady, F. O. Allosteric Control of Transient Kinetics of Carbon Monoxide-L-Tryptoohan-2,3-Dioxygenase Complex-Formation. Federation Proceedings. 32 (3), 469(1973).
  14. Pearson, J. T., Siu, S., Meininger, D. P., Wienkers, L. C., Rock, D. A. In Vitro Modulation of Cytochrome P450 Reductase Supported Indoleamine 2,3-Dioxygenase Activity by Allosteric Effectors Cytochrome b(5) and Methylene Blue. Biochemistry. 49 (12), 2647-2656 (2010).
  15. Walsh, H. A., Daya, S. Inhibition of hepatic tryptophan-2,3-dioxygenase: Superior potency of melatonin over serotonin. Journal of Pineal Research. 23 (1), 20-23 (1997).
  16. Barry, K. P., et al. Exploring allosteric activation of LigAB from Sphingobium sp strain SYK-6 through kinetics, mutagenesis and computational studies. Archives of Biochemistry and Biophysics. 567, 35-45 (2015).
  17. Reynolds, M. F., et al. 4-Nitrocatechol as a probe of a Mn(II)-dependent extradiol-cleaving catechol dioxygenase (MndD): comparison with relevant Fe(II) and Mn(II) model complexes. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 8 (3), 263-272 (2003).
  18. Tyson, C. A. 4-Nitrocatechol as a colorimetric probe for non-heme iron dioxygenases. Journal of Biological Chemistry. 250 (5), 1765-1770 (1975).
  19. Kasai, D., Masai, E., Miyauchi, K., Katayama, Y., Fukuda, M. Characterization of the gallate dioxygenase gene: Three distinct ring cleavage dioxygenases are involved in syringate degradation by Sphingomonas paucimobilis SYK-6. Journal of Bacteriology. 187 (15), 5067-5074 (2005).
  20. Billings, A. F., et al. Genome sequence and description of the anaerobic lignin-degrading bacterium Tolumonas lignolytica sp. nov. Standards in Genomic Sciences. 10 (1), 106(2015).
  21. Brown, M. E., Chang, M. C. Y. Exploring bacterial lignin degradation. Current Opinion in Chemical Biology. 19, 1-7 (2014).
  22. Bugg, T. D. H., Ahmad, M., Hardiman, E. M., Rahmanpour, R. Pathways for degradation of lignin in bacteria and fungi. Natural Product Reports. 28 (12), 1883-1896 (2011).
  23. Clarkson, S. M., et al. Construction and Optimization of a Heterologous Pathway for Protocatechuate Catabolism in Escherichia coli Enables Bioconversion of Model Aromatic Compounds. Applied and Environmental Microbiology. 83 (18), (2017).
  24. de Gonzalo, G., Colpa, D. I., Habib, M. H. M., Fraaije, M. W. Bacterial enzymes involved in lignin degradation. Journal of Biotechnology. 236, 110-119 (2016).
  25. Falade, A. O., Eyisi, O. A. L., Mabinya, L. V., Nwodo, U. U., Okoh, A. I. Peroxidase production and ligninolytic potentials of fresh water bacteria Raoultella ornithinolytica and Ensifer adhaerens. Biotechnology Reports. 16, 12-17 (2017).
  26. Gall, D. L., Ralph, J., Donohue, T. J., Noguera, D. R. A Group of Sequence-Related Sphingomonad Enzymes Catalyzes Cleavage of β-Aryl Ether Linkages in Lignin β-Guaiacyl and β-Syringyl Ether Dimers. Environmental Science & Technology. 48 (20), 12454-12463 (2014).
  27. Li, J., Yuan, H., Yang, J. Bacteria and lignin degradation. Frontiers of Biology in China. 4 (1), 29-38 (2009).
  28. Masai, E., Katayama, Y., Nishikawa, S., Fukuda, M. Characterization of Sphingomonas paucimobilis SYK-6 genes involved in degradation of lignin-related compounds. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 23, 364-373 (1999).
  29. Morales, L. T., González-García, L. N., Orozco, M. C., Restrepo, S., Vives, M. J. The genomic study of an environmental isolate of Scedosporium apiospermum shows its metabolic potential to degrade hydrocarbons. Standards in Genomic Sciences. 12 (1), 71(2017).
  30. Shettigar, M., et al. Isolation of the (+)-Pinoresinol-Mineralizing Pseudomonas sp. Strain SG-MS2 and Elucidation of Its Catabolic Pathway. Applied and Environmental Microbiology. 84 (4), (2018).
  31. Shi, Y., et al. Characterization and genomic analysis of kraft lignin biodegradation by the beta-proteobacterium Cupriavidus basilensis B-8. Biotechnology for Biofuels. 6 (1), 1(2013).
  32. Varman, A. M., et al. Decoding how a soil bacterium extracts building blocks and metabolic energy from ligninolysis provides road map for lignin valorization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), E5802-E5811 (2016).
  33. Wu, W., et al. Lignin Valorization: Two Hybrid Biochemical Routes for the Conversion of Polymeric Lignin into Value-added Chemicals. Scientific Reports. 7 (1), 8420(2017).
  34. Koehntop, K. D., Emerson, J. P., Que, L. The 2-His-1-carboxylate facial triad: a versatile platform for dioxygen activation by mononuclear non-heme iron(II) enzymes. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 10 (2), 87-93 (2005).
  35. Lipscomb, J. D. Mechanism of extradiol aromatic ring-cleaving dioxygenases. Current Opinion in Structural Biology. 18 (6), 644-649 (2008).
  36. Machonkin, T. E., Doerner, A. E. Substrate specificity of Sphingobium chlorophenolicum 2,6-dichlorohydroquinone 1,2-dioxygenase. Biochemistry. 50, 8899-8913 (2011).
  37. Suzuki, T., Kawamichi, H., Imai, K. Amino Acid Sequence, Spectral, Oxygen-Binding, and Autoxidation Properties of Indoleamine Dioxygenase-Like Myoglobin from the Gastropod Mollusc Turbo cornutus. Journal of Protein Chemistry. 17 (8), 817-826 (1998).
  38. Vaillancourt, F. H., Labbe, G., Drouin, N. M., Fortin, P. D., Eltis, L. D. The Mechanism-based Inactivation of 2,3-Dihydroxybiphenyl 1,2-Dioxygenase by Catecholic Substrates. Journal of Biological Chemistry. 277 (3), 2019-2027 (2002).
  39. Sugimoto, K., et al. Crystallization and preliminary crystallographic analysis of gallate dioxygenase DesB from Sphingobium sp. SYK-6. Acta Crystallographica Section F. 65 (11), 1171-1174 (2009).
  40. Gallagher, S. R. SDS‐Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE). Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. 6 (1), 7.3.1-7.3.28 (2012).
  41. Xiang, D. F., et al. Function Discovery and Structural Characterization of a Methylphosphonate Esterase. Biochemistry. 54 (18), 2919-2930 (2015).
  42. Vladimirova, A., et al. Substrate Distortion and the Catalytic Reaction Mechanism of 5-Carboxyvanillate Decarboxylase. Journal of the American Chemical Society. 138 (3), 826-836 (2016).
  43. Korczynska, M., et al. Functional Annotation and Structural Characterization of a Novel Lactonase Hydrolyzing d-Xylono-1,4-lactone-5-phosphate and l-Arabino-1,4-lactone-5-phosphate. Biochemistry. 53 (28), 4727-4738 (2014).
  44. Netto, L. E. S., Stadtman, E. R. The Iron-Catalyzed Oxidation of Dithiothreitol Is a Biphasic Process: Hydrogen Peroxide Is Involved in the Initiation of a Free Radical Chain of Reactions. Archives of Biochemistry and Biophysics. 333 (1), 233-242 (1996).
  45. Arciero, D. M., Orville, A. M., Lipscomb, J. D. Protocatechuate 4,5-Dioxygenase from Pseudomonas testosteroni. Methods in Enzymology. 188, 89-95 (1990).
  46. Harpel, M. R., Lipscomb, J. D. Gentisate 1,2-dioxygenase from pseudomonas. Purification, characterization, and comparison of the enzymes from Pseudomonas testosteroni and Pseudomonas acidovorans. Journal of Biological Chemistry. 265 (11), 6301-6311 (1990).
  47. Ishida, T., Tanaka, H., Horiike, K. Quantitative structure-activity relationship for the cleavage of C3/C4-substituted catechols by a prototypal extradiol catechol dioxygenase with broad substrate specificity. Journal of Biochemistry. 135 (6), 721-730 (2004).
  48. Vaillancourt, F. H., Han, S., Fortin, P. D., Bolin, J. T., Eltis, L. D. Molecular Basis for the Stabilization and Inhibition of 2,3-Dihydroxybiphenyl 1,2-Dioxygenase by t-Butanol. Journal of Biological Chemistry. 273 (52), 34887-34895 (1998).
  49. Veldhuizen, E. J. A., et al. Steady-state kinetics and inhibition of anaerobically purified human homogentisate 1,2-dioxygenase. Biochemical Journal. 386, 305-314 (2005).
  50. Wolgel, S. A., et al. Purification and Characterization of Protocatechuate 2,3-Dioxygenase from Bacillus macerans: a New Extradiol Catecholic Dioxygenase. Journal of Bacteriology. 175 (14), 4414-4426 (1993).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Очищение протеина анаэробных и кинетический анализ через электрод кислорода для изучения DesB Dioxygenase деятельность и ингибирование
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.