Методическая статья

Изоляция внеклеточного Vesicles из мышиных Бронхоальвеолярный лаваж жидкости методом центрифугирования ультрафильтрации

DOI:

10.3791/58310

⸱

9 ноября 2018 г.

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Pulmonary and Critical Care, Women's Guild Lung Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Medicine, Smidt Heart Institute, Cedars-Sinai Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем две протоколы изоляции внеклеточного везикул, ультрафильтрация центрифугирования и ultracentrifugation с плотность градиентного центрифугирования, изолировать внеклеточного пузырьки из мышиных Бронхоальвеолярный лаваж жидкости образцов. Внеклеточные везикулы, получаемые из мышиных Бронхоальвеолярный лаваж жидкости обоих методов количественно и характерны.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внеклеточные везикулы (EVs) являются вновь открывшимися субцеллюлярные компоненты, которые играют важную роль в многих биологических, сигнальные функции во время физиологических и патологических состояний. Изоляции EVs продолжает оставаться серьезной проблемой в этой области, из-за ограничений, присущих каждой техники. Дифференциальный ultracentrifugation с плотностью градиентного центрифугирования метод — это часто используемый подход и считается Золотой стандарт процедура изоляции EV. Однако эта процедура является длительным, трудоемкий и обычно приводит к низкой масштабируемости, которые не могут быть пригодны для малообъемной образцов таких Бронхоальвеолярный лаваж жидкости. Мы продемонстрировать, что метод изоляции центрифугирования ультрафильтрации прост и времени и труда эффективным еще обеспечивает высокое извлечение доходности и чистоты. Мы предлагаем, что этот метод изоляции может быть альтернативный подход, который подходит для изоляции EV, особенно для малообъемной биологических образцов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Exosomes самый маленький поднабор EVs, 50 – 200 Нм в диаметре и имеют несколько биологических функций через разнообразные сигнализации процессов1,2,3,4,5. Они управляют клеточной и тканевой гомеостаза главным образом путем содействия межклеточные связи через грузовые молекул, например, липиды, белки и нуклеиновые кислоты6,,78,9 . Один важный шаг в EV исследований является процесс изоляции. Дифференциальный ultracentrifugation (UC), с или без плотность градиентного центрифугирования (ДГК), считается золотым стандартом подход, но этот метод несет основные ограничения, включая неэффективное EV ставок возмещения и низкой масштабируемость10 , 11 , 12, которые ограничивают его наилучшего использования большего объема пробы, например клетки культуры супернатанта или высокой exosome производства образцов. Преимущества и недостатки других методов, таких как размер исключения ультрафильтрации или хромотографии immunoaffinity изоляции бусы или столбцы и микрофлюидика, хорошо описано, и современные дополнительные процедуры были разработаны для преодоления и сведения к минимуму технических ограничений в каждом подход11,12,13,14,15. Другие показали, что ультрафильтрации центрифугирования (UFC) с мембраной нанопористого в группе фильтр является альтернативным методом, который обеспечивает сопоставимой чистоты для UC метод16,17,18. Эта техника может рассматриваться как один из методов, альтернативных изоляции.

Бронхоальвеолярный лаваж жидкости (BALF) содержит EVs, которые обладают многочисленные биологические функции в различных респираторных заболеваний19,20,21,22. Изучение BALF-производные EVs влечет за собой некоторые проблемы из-за инвазивность процедуре Бронхоскопия в организме человека, а также ограниченное количество жидкости восстановления промывание. В небольших лабораторных животных, таких как мышь только несколько миллилитров могут быть восстановлены в обычных легких условиях, даже меньше в воспаленных или фиброзных легких23. Следовательно сбор достаточное количество BALF для изоляции EV с дифференциальной ultracentrifugation течению приложений не может быть осуществимо. Однако изолируя правильный EV населения является решающим фактором для изучения EV биологические функции. Хрупкое равновесие между эффективностью и эффективностью продолжает оставаться проблемой в устоявшихся методов изоляции EV.

В это исследование мы демонстрируем, что центробежные ультрафильтрации подход, используя 100 кДа молекулярный вес производства (MWCO) nanomembrane фильтр, подходит для малообъемной биологических образцов таких BALF. Этот метод является простым, эффективным и обеспечивает высокую чистоту и масштабируемость для поддержки исследования BALF-производные EVs.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование животных и животных все процедуры были утверждены институциональный уход животных и использование комитетов (IACUC) в Cedars-Sinai медицинского центра (ЦСМС).

1. мышиных Бронхоальвеолярный лаваж жидкости (BALF) сбор и подготовка

  1. BALF коллекция
    1. Усыпить мышей с коктейль кетамин (300 мг/кг) и ксилазина (30 мг/кг) через внутрибрюшинного маршрута следуют шейки матки дислокации.
    2. Вставьте angiocatheter 22 G в трахею. Прикрепите шприц Инсулин, содержащий 1 мл (мл) ледяной стерильные Дульбекко фосфатный буфер (DPBS) и привить 1 мл DBPS в обоих легких через angiocatheter.
    3. Медленно снять поршень шприца для получения BALF и отказаться от BALF в 50-мл Конические трубки. Сохраните BALF на льду.
    4. Повторите, 1.1.2 и 1.1.3 3 x (4 x в общей сложности в каждой мыши).
      Примечание: Обычно около 0,8 мл извлекается на миллилитр инстилляции. Кроме того можно выполнить следующие действия для отдельных мышей (т.е., 3 мл BALF), но объединение нескольких образцов BALF позволит изоляции более крупного пакета EVs для обеспечения согласованности в нижнем течении экспериментов.
  2. BALF подготовка
    1. Бассейн BALF от 25 мышей и разделить его на две равные части (~ 35 мл / Алиготе).
    2. Центрифуга BALF на 400 x g, при температуре 4 ° C за 5 мин, чтобы удалить клетки и другие сотовой мусора и собирать супернатант.
    3. Центрифуга супернатант в 1500 x g, при 4 ° C на 10 минут, чтобы удалить ячейки мусор. Собирать супернатант и приступить к изоляции EV ступени.

2. изоляция внеклеточного Vesicles из мышиных Бронхоальвеолярный лаваж жидкости

Примечание: В этом исследовании, два EV методов изоляции, а именно UFC и ultracentrifugation с высоким используется для изоляции EVs от BALF. Ниже приводится подробный протокол каждого метода.

  1. Ультрафильтрация метод обогащения центрифугирования (UFC)
    Примечание: Этот метод был изменен из ранее описанных протокол10.
    1. Фильтр супернатант из шага 1.2.3 через фильтр 0.2 мкм стерильным шприцем и сохранять отфильтрованные BALF на льду.
      Примечание: Это исключение шаг, размер которой только везикулы меньше 200 Нм собираются.
    2. Сбалансировать 100 кДа MWCO центробежный фильтр с стерильных DPBS 10 мин центрифуги центробежные блок на 1500 x g 10 мин при температуре 4 ° C для отмены DPBS.
      Предупреждение: После мембраны фильтра устройства является достижение равновесного уровня с DPBS, мембраны должны храниться влажной на все время, пока устройство используется.
    3. Заполните фильтр с 15 мл BALF образца из шага 2.1.1 и центрифуги на 3000 x г за 30 мин при 4 ° C. BALF потока через может быть отброшен или собраны в отдельный канонические трубку и температуре-80 ° C для использования в будущем.
    4. Повторите шаг 2.1.3 для оставшихся 0.2 мкм фильтрации BALF.
      Примечание: Он взял три повторения centrifugations достаточно сосредоточиться на BALF EVs от оригинального начальный объем 35 мл. Это привело к 1-1,5 мл концентрируются.
    5. Стирать концентрируются с 14 мл стерильного DPBS нежно закупорить многократно. Центрифуга фильтр на 3000 x g, при 4 ° C на 30 минут, чтобы удалить DPBS и сконцентрировать концентрируются EV.
    6. Соберите концентрированной EVs BALF-производные от фильтра устройства, вставив дозаторов в нижней части фильтра устройства и снятия образца с помощью side-to-side радикальные движения для обеспечения полного восстановления.
    7. Алиготе EVs BALF-производные и хранить их в-80 ° C для дальнейшей количественной оценки частиц и характеристик (см. шаг 3).
  2. Ultracentrifugation (UC) с плавучей плотность градиентного центрифугирования (ДГК)
    Примечание: Следующий протокол был изменен ранее описанных протокол24.
    1. Передача супернатант из шага 2.1.1 в ультрацентрифуга 37-мл пробирку и центрифуги выборки в 10 000 x г за 30 мин при 4 ° C, с помощью ультрацентрифугирования. Собирайте супернатант и центрифуги на 100,000 x g, при температуре 4 ° C для 60 мин. В то время как гранулы EV центрифугируется, подготовиться шаг 2.2.3 различные концентрации плавучесть плотность градиента буферов (Таблица 1).
    2. Отменить супернатант и Ресуспензируйте EV окатышей в 200 мкл DPBS.
    3. Смешать EV подвеска с 300 мкл рабочего раствора iodixanol 50% (Таблица 1) и передать его на 15 мл ультрацентрифуга трубки. На вершине 50% iodixanol-EV смесь подвеска, последовательно слоя ниже буферного раствора в порядке от дна к верхней части: 30% iodixanol (4,5 мл), 25% iodixanol (3 мл), 15% iodixanol (2,5 мл) и 5% iodixanol (6 мл). Центрифуга на 100,000 x g, при температуре 4 ° C для 230 мин.
      Примечание: Градиент плотности в плавучесть основана на процент масштабирования с самой высокой концентрацией (50%), внизу, чтобы низкие концентрации (5%), в верхней iodixanol. Для создания различных концентраций iodixanol, различные суммы гомогенизации среды (Таблица 1) были смешаны с рабочим раствором (50% iodixanol).
    4. Сбор 15% и 25% фракции и развести их в стерильные DPBS довести объем до 15 мл. Их передачи новой небольшой ультрацентрифуга трубки и центрифуги на 100,000 x g, при температуре 4 ° C для 60 мин.
    5. Отменить супернатант и Ресуспензируйте EV окатышей в 50 мкл стерильные DPBS для дальнейшей характеризации.

3. внеклеточного везикул количественная оценка

Примечание: Доходность восстановления BALF-производные EVs предел с двух метрик.

  1. Наночастицы, отслеживание измерений анализ (НТА)
    1. Разбавить EV образца при 1: 200 – 1: 500 в 1 мл DPBS и загрузки образца в шприц инсулина. Присоединить шприц образца к шприцевый насос и начать измерения частиц числа и размера (см. Таблицу материалы).
    2. Установите уровень камеры на 14 и порог обнаружения на 1 для всех измерений образцов. Пять повторяющихся измерений с 1500 кадров в 30 s были записаны для каждого образца, с задержкой в 20 s между читает. Объединить и средние данные для конечной концентрации и размер сообщений.
      Примечание: Для точного захвата всех частиц, отрегулируйте уровень камеры при необходимости визуализировать все частицы и использовать одинаковые параметры для всех измерений образец в каждом эксперименте.
  2. Количественное определение белка
    Примечание: Bicinchoninic кислота assay протеина (BCA) был использован для измерения концентрации белка BALF-производные EVs.
    1. Солюбилизировать последнего образцы EV 1 x литического буфера.
    2. Подсчитать количество белка в BALF-производные EVs в BCA стандартный протокол с помощью колориметрических обнаружения, измерения оптической плотности на 560 Нм в тарелку читателя.

4. Определение BALF-производные внеклеточного пузырьки

Примечание: Широко известный exosome поверхности маркер белков (TSG101, CD63, CD81 и CD9) были использованы для проверки EV возмещений SDS-PAGE и immunoblotting и потока cytometry анализ.

  1. SDS-PAGE и immunoblotting
    1. Растворите равное количество белков EV каждого образца с промокательной загрузки буфера (литий Додециловый сульфат) и 50 мм Дитиотреитол (DTT) в 1,6 мл. Тепло образцов при 70 ° C на 10 мин.
    2. Загрузить образцы из шага 4.1.1 в гель акриламида бис-трис плюс 4 – 12% и запустить электрофореза (150 вольт, 35 мА) для 35 мин.
    3. Передача белков на нитроцеллюлозную мембрану, с помощью метода сухой передачи.
    4. Блокировать мембраны с 5% сухого обезжиренного молока для 60 мин, тряся при комнатной температуре (RT).
    5. Проинкубируйте мембрану с антитела EV поверхности белка маркера, опухоли восприимчивость ген 101 (TSG101), при разбавлении 1: 500 в 5% BSA в трис буфер солевой Tween-20 (TBST) в при температуре 4 ° C, покачиваясь на ночь.
    6. Следующий день, Промойте мембрану 3 x, 10 мин каждого мытья, TBST буфер и проинкубируйте его с анти кролик IgG, ПХ связаны антител, при разбавлении 1:5,000 60 мин на RT.
    7. Промойте мембрану 3 x, 10 мин, каждый мыть, в TBST буфер. Разработка мембраны с хемилюминесцентный HRP антитела обнаружения реагента и изображения (см. Таблицу материалы для визуализации системы).
  2. Проточная цитометрия
    1. Развести BALF-производные EVs в 49 мкл PEB пятнать буфера (PBS + ЭДТА 5 мм + 0.5% BSA, фильтруют через мембрану фильтра шприц 0,1 мкм).
    2. Добавьте каждый из следующих антител в каждый индивидуальный образец: 1) крыса анти мыши PE CD63 антитела (100 нг в реакции); 2) крыса анти мыши PE CD81 (500 нг); 3) крыса анти мыши FITC CD9 (200 нг). Инкубируйте на 4 ° C, качалки для 60 мин в темноте.
    3. Развести образцы с 450 мкл мембранная фильтрация PEB пятнать буфера и подвергать образцы cytometry анализ потока (см. Таблицу материалы)25.
    4. Настройки потока цитометр следующим образом: 1) установить все каналы на гипер журнала (hlog); 2) установите триггер на SSC в 4; 3) Выключите вторичных триггера. Выполнение примеров в условиях низкой скорости и приобрести по крайней мере 10 000 событий в каждом образце.
    5. Выполнять анализ данных низкого цитометрии в каждом образце с помощью программного обеспечения для анализа (см. Таблицу материалы).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы исполняли EV изоляции от мыши BALF с использованием методов изоляции UFC и UC-ДГК в тот же день. Метод UFC требуется примерно 2,5-3 ч, тогда как UC-ДГК техника требует 8 h времени обработки. Это не включать, буферов и время приготовления реагентов. Следует отметить, что некоторые другие задачи могут выполняться в периоды длительного центрифугирования. Тем не менее вся процедура длилась почти целый день для UC-ДГК изоляции техники.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В последние несколько десятилетий ученые разгадана significances EVs в клеточного гомеостаза. Что еще более важно EVs играют важную роль во многих процессах, болезни, модулируя соседних и дальних клетки через их биоактивные грузов молекул1,21,22,,2627 , 28 , 29 ,

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Работа поддерживается NHLBI/низ грантов HL103868 (УК) и HL137076 (для ПК), Американской ассоциации субсидий сердца (для ПК) и Самуэля Ошина всеобъемлющей рака институт (SOCCI) легких Рак исследований премию (УК). Мы хотели бы выразить нашу большую признательность институт сердца Артурович в Cedars-Sinai медицинский центр, который предоставляет нам Nanosight машина для EV наночастиц отслеживания анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Material
Amicon Ultra-15 Ultra-15 Ultracel-100KSigma-Millipore, Сент-Луис, МиссуриUFC910024
Dulbecco's Phosphate Buffered Salt (DPBS)Corning Cellgro, Manassas, VA21-031-CV
SucroseSigma-Millipore, Сент-Луис, МиссуриEMD8550
HEPESResearch Products International, Prospect, IL75277-39-3
EDTACorning Cellgro, Манассас, VA46-034-CI
Sodium ChlorideSigma-Millipore, St. Louis, MOS3014-1KG
OptiPrepSigma-Millipore, St. Louis, MOMKCD9753Density Gradient Medium
KetamineVetOne, Boise, ID13985-702-10
XylazineAkorn Animal Health, Лейк-Форест, Иллинойс59399-110-20
Шприц 1 млBD, Франклин Лейкс, Нью-Джерси309656
Ангиокатетер 20 гШприц BD, Франклин Лейкс, Нью-Джерси381703
Центрифужные пробирки 15 млVWR, Раднор, Пенсильвания89039-666
Центрифужные пробирки 50 млCorning Cellgro, Манассас, Вирджиния430828
Анализ белка бицинхоновой кислоты (BCA)Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL23235
Rabbit anti-mouse TSG101 AntibodyAbCam, Кембридж, МассачусетсAB125011
Rat anti-mouse PE-CD63 AntibodyBiolegend, Сан-Диего, Калифорния143904
CD81
CD9
Антикроличий IgG, HRP-связанные антителаТехнология клеточной сигнализации, Danvers, MA7074S
4x LDS
10x Восстановитель (Bolt)
10x Лизисный буфер (Bolt)Технология клеточной сигнализации, Danvers, MA
Bolt 4-12% Bis-Tris Plus акриламидный гельInvitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MANW04120
iBlot 2 Нитроцеллюлоза мини-стекиInvitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAIB23002
Хемилюминесцентный реагент для обнаружения антител HRP HyGLODenville Scientific, Holliston, MAE2400
Ультрацентрифуга 17 млBeckman Coulter, Пасадена, Калифорния337986
ультрацентрифужные пробирки 38,5 млBeckman Coulter, Пасадена, Калифорния326823
Шприцевые фильтры Corning SFCA 0.2 & микро; m poreThermo Fisher Scientific, Waltham, MA09-754-13
Equipment
CentrifugeEppendorf, Гамбург,
Beckman Coulter, Пасадена, CA-Nanosight
(NS300)Malvern, Worcestershire, UK -Для измерения распределения частиц по размерам и концентрация частиц
MACSQuant Analyzer 10 проточный цитометрMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach,Германия-iBlot
Transfer ApparatusThermo Fischer Scientific, Waltham, MA-Bio-Rad
ChemiDoc MP Imaging SystemBio-Rad, Hercules, CA
FlowJo v. 10Программное обеспечение для анализа
Центробежные фильтры Германия-Ультрацентрифуга

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2, 569-579 (2002).
  2. Kosaka, N., et al. Secretory Mechanisms and Intercellular Transfer of MicroRNAs in Living Cells. Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17442-17452 (2010).
  3. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  4. Fujita, Y., Kosaka, N., Araya, J., Kuwano, K., Ochiya, T. Extracellular vesicles in lung microenvironment and pathogenesis. Trends in Molecular Medicine. 21 (9), 533-542 (2015).
  5. Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).
  6. Janowska-Wieczorek, A., et al. Microvesicles derived from activated platelets induce metastasis and angiogenesis in lung cancer. International Journal of Cancer. 113 (5), 752-760 (2005).
  7. Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).
  8. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 255-289 (2014).
  9. Rocco, G. D., Baldari, S., Toietta, G. Exosomes and other extracellular vesicles-mediated microRNA delivery for cancer therapy. Translational Cancer Research. 6 (Supplement 8), S1321-S1330 (2017).
  10. Peterson, M. F., Otoc, N., Sethi, J. K., Gupta, A., Antes, T. J. Integrated systems for exosome investigation. Methods. 87 (1), 31-45 (2015).
  11. Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. Journal of Clinical Investigation. 126, 1152-1162 (2016).
  12. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945(2016).
  13. Inglis, H. C., et al. Techniques to improve detection and analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Cytometry Part A. 87 (11), 1052-1063 (2015).
  14. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
  15. Willis, G. R., Kourembanas, S., Mitsialis, S. A. Toward Exosome-Based Therapeutics: Isolation, Heterogeneity, and Fit-for-Purpose Potency. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 20389(2017).
  16. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 27031(2015).
  17. Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Scientific Reports. 7 (1), 15297(2017).
  18. Vergauwen, G., et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7 (1), 2704(2017).
  19. Kesimer, M., et al. Characterization of exosome-like vesicles released from human tracheobronchial ciliated epithelium: a possible role in innate defense. The FASEB Journal. 23 (6), 1858-1868 (2009).
  20. Torregrosa Paredes, P., et al. Bronchoalveolar lavage fluid exosomes contribute to cytokine and leukotriene production in allergic asthma. Allergy. 67 (7), 911-919 (2012).
  21. Alipoor, S. D., et al. Exosomes and Exosomal miRNA in Respiratory Diseases. Mediators of Inflammation. 2016, 5628404(2016).
  22. Hough, K. P., Chanda, D., Duncan, S. R., Thannickal, V. J., Deshane, J. S. Exosomes in Immunoregulation of Chronic Lung Diseases. Allergy. 72 (4), 534-544 (2017).
  23. Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398(2017).
  24. Minciacchi, V. R., et al. MYC Mediates Large Oncosome-Induced Fibroblast Reprogramming in Prostate Cancer. Cancer Research. 77 (9), 2306-2317 (2017).
  25. Koliha, N., et al. Melanoma Affects the Composition of Blood Cell-Derived Extracellular Vesicles. Frontiers in Immunology. 7, 581(2016).
  26. Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).
  27. Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).
  28. Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. Exosomes and microvesicles: extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, R125-R134 (2012).
  29. Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutiérrez-Vázquez, C., Sánchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: Regulation of exosome loading. Seminars in Cancer Biology. 28, 3-13 (2014).
  30. Hoshino, A. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527, 329-335 (2015).
  31. Liu, F., et al. The Exosome Total Isolation Chip. ACS Nano. 11 (11), 10712-10723 (2017).
  32. Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).
  33. Zhao, Z., Yang, Y., Zeng, Y., He, M. A Microfluidic ExoSearch Chip for Multiplexed Exosome Detection Towards Blood-based Ovarian Cancer Diagnosis. Lab on a Chip. 16 (3), 489-496 (2016).
  34. Fang, S., et al. Clinical application of a microfluidic chip for immunocapture and quantification of circulating exosomes to assist breast cancer diagnosis and molecular classification. PloS ONE. 12 (4), e0175050(2017).
  35. Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).
  36. Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674(2018).
  37. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).
  38. Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6 (1), 329(2016).
  39. Xiao, J., et al. Cardiac progenitor cell-derived exosomes prevent cardiomyocytes apoptosis through exosomal miR-21 by targeting PDCD4. Cell Death & Disease. 7 (6), e2277(2016).
  40. Agarwal, U., et al. Experimental, Systems and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients. Circulation Research. 120 (4), 701-712 (2017).
  41. Merchant, M. L., et al. Microfiltration isolation of human urinary exosomes for characterization by MS. PROTEOMICS - Clinical Applications. 4 (1), 84-96 (2010).
  42. Gouin, K., et al. A comprehensive method for identification of suitable reference genes in extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1347019(2017).
  43. Betsuyaku, T., et al. Neutrophil Granule Proteins in Bronchoalveolar Lavage Fluid from Subjects with Subclinical Emphysema. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (6), 1985-1991 (1999).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CD63 CD9 CD81

Похожие статьи