Method Article

Проведение нескольких режимов изображения с одной флуоресцентным микроскопом

DOI:

10.3791/58320

⸱

October 28th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Chicago, 2The Institute for Biophysical Dynamics, University of Chicago, 3Faculty of Chemistry, Wrocław University of Science and Technology, 4Nikon Instruments Inc.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем практическое руководство построения интегрированных микроскопии системы, которая объединяет обычные epi флуоресцентных изображений, сингл молекула на основе обнаружения суперразрешением изображений и многоцветные сингл молекула обнаружения, включая Одноместный молекула флуоресценции передачи энергии резонанса изображений в один настройки в экономически эффективным способом.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микроскопии флуоресцирования является мощным инструментом для выявления биологических молекул на месте и мониторинга их динамики и взаимодействия в режиме реального времени. Помимо обычных epi флуоресцентной микроскопии для достижения конкретных экспериментальных целей были разработаны различные методы обработки изображений. Некоторые из широко используемых методов включают сингл молекула флуоресценции передачи энергии резонанса (smFRET), который может сообщить конформационные изменения и молекулярных взаимодействий с Ангстрем резолюцией и одной молекулы на основе обнаружения супер-резолюции (SR) изображений, которые могут повысить пространственным разрешением около десяти в twentyfold по сравнению с дифракционный микроскопии. Здесь мы представляем клиентов разработана комплексной системы, которая объединяет несколько методов обработки изображений в одном Микроскоп, включая обычных epi флуоресцентных изображений, изображений на основе обнаружения SR одной молекулы и многоцветные сингл молекула обнаружения, включая smFRET изображений. Различные методы обработки изображений можно легко и можно воспроизвести путем переключения оптических элементов. Эта установка легко принять любой научно-исследовательской лаборатории в биологических наук с необходимостью для рутинных и различных изображений экспериментов на снижение стоимости и пространстве относительно создания отдельных микроскопы для индивидуальных целей.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Флуоресценции Микроскопы являются важными инструментами исследований современной биологической науки и флуоресцентных изображений регулярно проводится во многих лабораториях биологии. Путем пометки биомолекул интерес с флуорофоров, мы можем непосредственно визуализировать их под микроскопом и записывать время зависимых изменения в локализации, конформации, взаимодействия и Ассамблея государств в естественных условиях или в пробирке. Обычных флуоресценции Микроскопы имеют дифракционный пространственным разрешением, который является ~ 200-300 Нм в боковую сторону и ~ 500-700 Нм в осевом направлении1,2и, таким образом, ограничивается изображений на 100s Шкала нанометров до микрона. Для того, чтобы выявить тонкие детали в молекулярной сборки или организации, были разработаны различные SR microscopies, которые могут нарушить дифракционного предела. Стратегии, используемые для достижения SR включают нелинейных оптических эффектов, таких как простимулированное излучение истощения (интереса) микроскопия3,4 и структурированного освещения микроскопии (SIM)5,6, 7, стохастический обнаружения одного молекул, например стохастических оптических реконструкции микроскопии (шторм)8 и photoactivated локализации микроскопии (PALM)9и сочетание обоих, например, MINFLUX10. Среди этих SR microscopies сингл молекула на основе обнаружения SR Микроскопы могут быть относительно легко изменены из одной молекулы Микроскоп set-up. С повторяющихся активации и изображений photoactivatable флуоресцентных белков (FPs) или фото переключаемый красители, отмеченных на биомолекул интерес пространственное разрешение может достигать 10-20 Нм11. Чтобы получить информацию о молекулярных взаимодействий и конформационные динамика в режиме реального времени, Ангстрем нанометровая резолюции не требуется. smFRET12,13 является одним из подходов к достижению этой резолюции. Как правило в зависимости от биологических вопросов интерес, необходимы методы обработки изображений с различным пространственным разрешением.

Как правило для каждого типа изображения, необходима возбуждения и/или выбросов оптических конфигурации. Например один из наиболее часто используемых освещения методов для обнаружения одной молекулы — посредством полного внутреннего отражения (МДП), в котором конкретные возбуждения угол необходимо достичь через призму или объектива. Для обнаружения smFRET выбросы от доноров и акцепторов красители нужно быть пространственно разделены и направлены в различные части электрон умножения, зарядовой (EMCCD), которое может быть достигнуто с набором зеркал и дихроичный пучка сплиттер помещены в пути выбросов. Для трехмерной (3-D) SR изображений, оптические компоненты, такие как Цилиндрические линзы14, необходимо вызвать эффект астигматизма по пути выбросов. Таким образом homebuilt или коммерчески доступных интегрированных Микроскопы обычно, функционально специализированные для каждого типа изображений метод и не являются гибкими, чтобы переключаться между различными методами визуализации на же настройки. Здесь мы представляем экономически, гибридная система, которая обеспечивает регулируемый и воспроизводимые переключает трех различных методов обработки изображений: обычные epi люминесцентные изображений с разрешением дифракционный, сингл молекула на основе обнаружения SR изображений и многоцветные сингл молекула обнаружения, включая smFRET изображений (рис. 1A). Конкретно здесь представлены настройки содержит волокна в сочетании входных лазеры для возбуждения многоцветные и коммерческого освещения руку в пути возбуждения, который позволяет запрограммированы контроля возбуждения угла, чтобы переключаться между epi режиме и в режиме МДП. В пути выбросов съемный homebuilt Цилиндрические линзы кассету помещается внутри тела микроскоп для 3-D визуализации SR, и коммерческие пучка сплиттер помещается перед EMCCD камеры, которые могут быть выборочно включены обнаружить множественные каналы выбросов одновременно.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Микроскоп проектирование и монтаж

  1. Возбуждения путь
    Примечание: Возбуждения путь включает лазеры, дифференциальной помехи контраст (DIC) компоненты, Микроскоп тело и его руку освещения.
    1. Подготовьте таблицу оптически изолированы вибрации. Например структурные демпфирования Таблица 48 x 96 x 12'' дает достаточно места для всех компонентов.
      Примечание: Построение set-up в комнате с контролем температуры (например, 21,4 ± 0,55 ° C). Стабильность температуры имеет решающее значение для поддержания оптическое выравнивание.
    2. Установите Микроскоп орган, который оснащен с arm освещения для волоконно-оптических соединений, a 100 X нефти погружение TIRF объектива и компоненты DIC.
    3. Место четыре лазерных головок (647 Нм, 561 Нм, 488 нм и 405 нм, окружили в рис. 1B) и их тепла раковины на таблицы оптики, и убедитесь, что излучаемый лазерные лучи имеют те же высоту и являются, как можно обеспечить хорошую стабильность (например короче 3'').
      Примечание: Если лазерная головка находится на высоте короче чем другие лазеры, положите алюминиевой пластины с достаточной толщины под ним. Всегда обеспечить максимальный контакт между радиаторами и таблицы оптики для лучших тепловыделение (рис. 1B). Лазеры должны быть достаточно мощными для SR изображений. Смотрите таблицу материалов. Рекомендуется иметь лазерного фильтры очистки перед диодных лазеров.
    4. Установите карточку приобретение данных через интерфейс периферийных компонентов соединительный (PCI) в рабочую станцию и подключите лазеры с этой картой. Контролировать поведение ON/OFF лазеры, Транзисторно транзисторная логика (ТТЛ) выход и их регулировка мощности, аналоговый выход этой карты (рис. 1 c). Установите надлежащий микроскопии изображений (коммерческого или homebuilt) контролировать сбор данных карты, а также Микроскоп тела.
    5. Смонтируйте их соответствующих крепления зеркала и дихроичный пучка сплиттер (590, 525 и 470 длинный пас фильтры). Используйте очень стабильная зеркало монтирует для зеркала. Используйте круговые сплиттеры с стопорного кольца, чтобы избежать любой изгиб дихроичных пучка сплиттер (рис. 1 d).
    6. Место зеркала и дихроичный пучка сплиттер оптический таблицы, чтобы объединить лазерные лучи (рис. 1B). Для достижения наиболее стабильных выравнивание, сделать целую договоренность как компактный, насколько это возможно и использовать 1''-толщина оптических должностей. Организовать лазеры, так что короче длина волны лазеров ближе к волоконно-оптических муфта (рис. 1B), так как короткие волны света рассеивается более в воздухе.
    7. Объедините лазерных лучей в одномодовое оптоволокно. Чтобы сделать это, построить волокна стяжки в клетке системы через следующие шаги:
      1. Подключите адаптер плиты в гору перевод по оси z (Рисунок 1E, левой панели).
      2. Смонтировать Дуплет ахроматический объектив (Фокусное расстояние = 7,5 мм) в клетке пластине (Рисунок 1E, вторая группа слева).
      3. Подключите две части выше, удлинительных штанг сформировать в клетке. Установите клетку таблицы оптики с монтажными кронштейнами на 1''-толщиной оптического сообщения (Рисунок 1E, средняя группа).
      4. Совместите сначала 647-Нм лазер с одномодовое оптическое волокно (FC/APC конец стяжка).
        Примечание: Предварительное выравнивание с помощью волоконно-оптических многорежимный перед использованием одномодовое оптическое волокно может помочь процесс выравнивания. Регулировка углов установки зеркала и дихроичный пучка сплиттер (рис. 1 d, путем регулировки ручки), а также расстояние между Дуплет ахроматические линзы и адаптер плита (Рисунок 1E, регулируя z-axis перевод гора) для получения Выходная мощность максимальная лазера через волокна.
      5. После выравнивания первого лазера, временно установить пару ирисов и выровнять остальные лазеров по одному (Рисунок 1F). Проверьте эффективность выравнивания с измеритель мощности.
      6. Оставьте одну Ирис передней пластины адаптера для уменьшения отражения лазеров.
        Примечание: Сильные обратно размышления может сократить срок службы лазерных источников. При необходимости оптический изолятор может устанавливаться перед каждой Лазерная головка полностью удалить размышления.
    8. Подключите другой конец оптоволоконного освещения руку микроскопа (рис. 1 H).
    9. Проектирование и установку «увеличение объектив (МАГ)» через следующие этапы:
      Примечание: Лазеры могут быть использованы для визуализации epi флуоресценции образца, но узкий пучок размер каждого лазерного ограничивает освещенную зону образца в несколько раз меньше, чем фактический размер соответствующего датчика камеры, район особенно для новых камеры (с 18,8 мм Длина диагонали, по сравнению с обычными 11,6 мм длины). Таким образом желательно расширить луча для достижения большего и льстить освещение образца.
      1. Дизайн mag объектива, который может поместиться в руку освещения (рис. 1 H).
        Примечание: Конструкция объектива mag зависит где она будет установлена. Рисунок 1 H показывает пример установки освещения руку, но он может быть установлен в любом месте после лазерных лучей коллимированных (см. обсуждение). Его дизайн с компьютерного проектирования и разработки программного обеспечения.
      2. Место два ахроматические линзы, одной вогнутой (Фокусное расстояние = f1) и один выпуклый (Фокусное расстояние = f2) в держатель объектива домашний mag (рисунок 2A и 2 C), с расстоянием, равным сумме их фокусных расстояний, f1 + f2 = (-25) + 50 = 25 мм (рис. 2B).
        Примечание: С этим выбором фокусных, маг линза расширяет луч, f2/ | f1| = 2 складки. Маг объектив обеспечивает универсальность. Это могут быть удалены для возобновления регулярного освещения без расширения балки (Рисунок 2D) или вставлены в обратном направлении, чтобы сфокусировать лазерный луч для достижения сильной интенсивности возбуждения.

2. выбросов путь

Примечание: Выбросов путь состоит из съемных Цилиндрические линзы, колесо фильтр барьер, разделитель выбросов и EMCCD камеры (рис. 1 g). Для достижения лучших точки распространения функция (PSF) из одной молекулы, Призма DIC ставится вдали от объектива.

  1. Пользовательские Дизайн кассеты цилиндрические (3-D объектив), который может поместиться в ручной анализатор DIC вставить слот в организме микроскоп (рис. 3 c).
    Примечание: Этот дизайн не компромисс анализатор DIC, поскольку блок анализатор может быть вставлен в башне фильтр.
  2. Место 3-D объектив фокусное расстояние 10 м в кассету и вставьте его в путь луча выбросов для создания эффекта астигматизм, необходимые для извлечения каждый одной молекулы14координата z.
    Примечание: При необходимости, кассеты с 3-D объектив может помещаться в или из пути выбросов (рис. 3 c).
  3. Установите многополосный дихроичных пучка сплиттер в башне фильтр внутри тела микроскопа.
  4. Установите фильтры выбросов.
    Примечание: Фильтры выбросов выбираются в зависимости от предпочтительного флуорофоров. В зависимости от модуля обработки изображений используются фильтры выбросов, размещены в разных местах, как описано ниже:
    1. Для последовательного многоцветные epi флуоресценции изображений или изображений SR использовать фильтры выбросов в барьер фильтра колесо связаны рядом с телом микроскоп для сведения к минимуму вибрацию в организме микроскопа при переключении канала (рис. 1 g).
    2. Для одновременного обнаружения многоцветные (например, smFRET экспериментов) место другой фильтр в выбросов разделителя (проверить шаг 4 для подробной информации).
      Примечание: Как правило, коммерческие выбросов разделитель имеет два переключаемых режима (то есть, «участие» или «обойти» режимы). Для разделения выбросов огни хроматически для одновременного многоцветные изображения («занято» режим), используется фильтр куб, проведение двух дихроичных пучка сплиттер и три фильтра выбросов («тройной куб, « фигура 4 c и 4 D). Пустой слот в барьер фильтра колесо используется в сочетании с тройной куб. С другой стороны для последовательного многоцветные изображения, тройной кубов заменяется куб, который просто имеет зеркало внутри («обход куб, « Рисунок 4A и 4 D).
  5. Установите камеру EMCCD как последняя часть пути выбросов. Используйте подключения USB-PCI для достижения высокой частоте кадров.
    Примечание: EMCCD камеры рекомендуется для наиболее чувствительных обнаружения одной молекулы, но расширенные sCMOS камеры может быть альтернативой.

3.-дифракционный изображений с Epi возбуждения

  1. Отрегулируйте возбуждения лазеры случайный угол epi-режим освещения руку.
  2. Освободите 3-D объектив если участвуют (рис. 3 c, правая панель).
  3. Вставьте в обход куб в разделитель выбросов (рис. 4A и 4E, Нижняя панель).
  4. (Необязательно) Вставьте mag объектив для расширения освещения области (Рисунок 2D, левой панели).
    Примечание: С помощью mag объектива и 100 X нефти погружение объектива, около 91 x 91 мкм2 может быть освещен ровно, устраняя необходимость использования источника белого света и несколько кубов фильтр.
  5. Использование микроскопии изображений программное обеспечение для многоканальных, Z-стека или промежуток времени изображения.
    Примечание: Существует несколько программ для микроскопии изображений, не только от Микроскоп производителей, но и от сторонних компаний или разработчиков открытого исходного кода.

4. Многоканальные сингл молекула изображений, включая smFRET

Примечание: Перейти к «пустой» позиции в барьер фильтра колесо, так что все излучение с любой длиной волны может достигать до второй набор фильтров/дихроичных луч сплиттеры в выбросов разделителя.

  1. Многоцветные сингл молекула автоопределения иммобилизованных поверхности молекул15 с использованием TIRF возбуждения, включая измерение smFRET, настройте случайный угол возбуждения лазеры на угол TIRF. Разъединение объектива маг и 3-D объектив.
  2. Трехканальный режим заниматься выбросов разделителя (рис. 1 g) через следующие этапы:
    1. Заменить обход куб с кубом «калибровка» что позволяет свету проходить через все каналы (рис. 4B и 4E).
    2. Включите камеру под ДВС (то есть, фильтр не выбросов в колесе фильтр барьер) и регулировки диафрагмы разделителя выбросов до тех пор, пока три полностью отдельные каналы появляются на экране.
      Примечание: Проведите этот шаг с номер свет горит, чтобы визуализировать все каналы.
    3. Вертикальная/горизонтальная регулировка ручки управления включите выбросов разделителя и приблизительно выровняйте трех каналов (Рисунок 4E и 4F).
    4. Выключите камеру и заменить калибровки куб с тройной Куба (рис. 4 c и 4E).
    5. Поместите образец с 100-Нм многоканальные бисер на вершине 100 X объектив и сосредоточиться на образце.
    6. Включите камеру и 488 нм лазер, увеличить на один из ярких бусин и мелко выровнять трех каналов, повернув регулировки ручки управления снова (Рисунок 4E и 4 G).
      Примечание: 100 Нм многоканальные бисер выделяют различные длины волн света на 488 нм возбуждения, включение 3 канальный выравнивания.
  3. Включите камеру и лазеры, фокус и найти хорошее положение с разумной пятно плотностью. Отрегулируйте время мощности и воздействия лазера для достижения приемлемого уровня сигнала к шуму и Фотообесцвечивание. Использование микроскопии изображений принять промежуток времени изображения.

5. SR изображений

Примечание: Это сингл молекула на основе обнаружения SR микроскопии.

  1. Чтобы настроить SR изображений, вставьте 3-D объектив и удалить объектив маг. Установите время экспозиции камеры в соответствующий лазерный каналов (например, 5-60 мс). Определить и вручную установить оптимальный возбуждения лазеры случайный угол угол TIRF.
  2. Поместите образец в SR визуализации буфера16. Разрешить буфер, чтобы сбалансировать для по крайней мере 10 минут до изображений.
    Примечание: SR визуализации буфера истекает после примерно 1 h, так что новый SR визуализации буфера соответственно.
  3. Возьмите DIC изображения до SR изображений. С целью нахождения надлежащих объективных высоту для SR, которая оптимизирует эффект астигматизма, используйте DIC изображений найти средней плоскости клетки. Определение плоскости на высоте, на которой клетки переход от «свет» в «темные» образы и появляются стать прозрачным (Рисунок 5A, 5Bи 5 C). Как только желаемый фокальной плоскости определяется, заниматься коррекции системы z смещения (рис. 1A).
  4. Проводить SR изображений. Измените мощность лазера 405 нм для поддержания разумного плотность «мигает на» пятна.
    Примечание: Хотя это можно изменить 405 нм лазер вручную, это более удобно для запуска код приобретение запрограммированных данных для поддержания плотности «мигает на» пятна. Вот пример того как это осуществляется автоматически. Исходный код доступен по запросу (рис. 6).
    1. Начало обработки изображений приобретения с 0 Вт/см2 фиолетовый лазер мощностью.
    2. Подсчитать количество мигает на места в течение определенного периода.
    3. Модулировать фиолетовый лазерного луча, так что количество мигает на пятна хранится выше определяемых пользователем «подсчета порог» в поле зрения. Увеличьте мощность фиолетового лазера, когда количество мигает на пятна падает ниже порогового значения подсчета.
    4. Прекратить приобретение, когда количество мигает на пятна падает ниже порога подсчета, используя мощность максимальная фиолетового лазера.
      Примечание: Максимальная можно задать по-разному в зависимости от яркости образец, но не более чем 130 Вт/см2. В зависимости от фактической цели SR изображений этот код автоматического приобретения вручную может быть прекращено в любой нужный момент.
  5. Проверьте мигающий поведение и PSFs пятна вскоре после начала приобретения.
    Примечание: Если мигающий поведение не является идеальным, измените возбуждения лазеры случайный угол или заменить буфере визуализации. Ожидаете выборки «вертикальной», «горизонтальной» и «алмаз» формы ПСФ, представляющие флуорофоров ниже, выше и в пределах фокальной плоскости, соответственно (рис. 5 d). Если большинство пятен Показать вертикальные или горизонтальные PSFs, затем фокальной плоскости отключен от центра клетки, так прекратить эксперимент и повторно настроить фокальной плоскости. Наличие воздушных пузырьков в Масло иммерсионное или другие местные факторы могут повлиять на PSFs качества, поэтому оно может быть необходимо заменить масло или изменить на другую область изображения образца.
  6. Для анализа данных используйте open source (в плагинов NIH ImageJ) или коммерчески доступные коды для обнаружения центроиды каждое пятно в каждом кадре изображений и извлечь z значения каждого пятна от x - и y ширина14.
    Примечание: В настоящем докладе, исходный код, первоначально разработанный в одной из ранних одной молекулы на основе обнаружения SR8 была изменена для 3-D обнаружения16 и был использован.
  7. В случае двух цветные изображения, изображение Флюорофор с больше длины волны возбуждения, следуют один с короче длина волны возбуждения. Запустите код автоматического приобретения аналогично описанному в шаге 5.4, но с помощью различных изображений лазера.
    Примечание: следует исправить хроматические аберрации между изображениями с различными флуорофоров (например, красный краситель и желто зеленый краситель). Вот шаги.
    1. Иммобилизации несколько 100 Нм многоканальные бисер на стекло coverslip, избегая формирования кластеров.
    2. Возьмите изображения их в каналах различных возбуждения.
    3. Экстракт их (X, Y, Z) координаты программного обеспечения (шаг 5.6).
    4. Участок ΔX,я = X1i - X2i и ΔYi = Y1i - Y2i (я это для разных бусинок, и 1 и 2 являются различные цветовые каналы) отдельно и соответствовать их соответствующие функции. Сохраните функции.
      Примечание: Линейной функции достаточно в большинстве случаев. После того, как эти функции определены, это измерение не должны повторяться каждый раз изображений.
    5. В фактической визуализации SR-двухцветный образца интерес, применить функции к правильным (X, Y) хроматической аберрации. Для z направленного хроматических аберраций, проводить его путем получения ΔZ = Z1 -2 Z для многоканальные бисер или известных многоканальный образцов посеян вместе с образцом интерес.
      Примечание: в отличие от (X, Y) хроматические аберрации, z направленного хроматической аберрации не хорошо воспроизводимые в каждом эксперименте, главным образом из-за неполной z направленного фокус обслуживание при переключении каналов. Таким образом рекомендуется проводить коррекцию каждый раз. ΔZ = Z1 - Z2 главным образом независимо от (X, Y), так что просто несколько шариков или эталонных образцов будет достаточно за каждого образца области интересов. Сюжет построен окончательного изображения-двухцветный SR в 3-D визуализации программного обеспечения и вручную проверить ΔZ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот микроскоп позволяет гибкое и воспроизводимые переключения между различными методами обработки изображений. Здесь мы покажем примеры изображений, собранных с каждым тепловизионный модуль.

Рисунок 5 d демонстрирует ПСФ мигает на молекулы во время приобретения SR. Тысячи таких изображений реконструированы для создания окончательного изображения SR (Рисунок 5E).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот Микроскоп гибридной системы исключает необходимость покупки нескольких микроскопы. Общая стоимость всех частей, включая таблицы оптики, таблице трудовых установки, программное обеспечение и рабочей станции, это около $230000. Обработанные пользовательских частей, включая mag объектив и 3-D объектив, стоимость около $700 (стоимость зависит от фактических расходов в различных институтах). Типичный коммерчески доступных интегрированных систем для одной молекулы на основе обнаружения SR микроскопии стоить более $300000 ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.F. выражает поддержку от программы ученых Сирл и директор NIH новый новатор премии. Авторы признают полезные предложения от Paul Selvin лаборатории (Иллинойский университет, г. Урбана-Шампейн) для позиционирования 3-D объектива.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Подставка для микроскопа Nikon Ti-E ОбъективNikonTi-E
ОбъективNikon100X NA 1.49 CFI HP TIRF
Программное обеспечение для микроскопииNikonNIS-Elements Advanced Research/HCHC включает модуль "JOBS", программируемый модуль сбора, используемый для визуализации SR.
Кронштейн подсветкиNikonTi-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit MЭтот кронштейн имеет слот для линзы увеличения
Блок анализаNikonTi-AОн установлен в револьвере фильтров.
Система коррекции Z-дрейфаNikonPFSЭта система состоит из шагового двигателя на носовой части объектива, ИК-светодиода и детектора.
Оптическая настольная столешницаTMC783-655-02R
Оптическая настольная базаTMC14-426-35
647 нм лазерCobolt90346 (0647-06-01-0120-100)Модулированный лазерный диод 647 нм 120 мВт, включая лазерную головку, блок управления CDRH, USB-кабель и блок питания (блок питания)
561 нм лазерCoherent1280721OBIS 561 нм LS 150 мВт лазерная система
488 нм лазерCobolt90308 (0488-06-01-0060-100)Модулированный лазерный диод 488 нм 60 мВт, включая лазерную головку, блок управления CDRH, USB-кабель и блок питания (блок питания)
405 нм лазерныйкристаллазерDL405-025-O405 (+/-5) нм, 25 мВт, круговой, M2 < 1.3, низкий шум, CW, TTL до 20 МГц. 2 разъема BNC для TTL и Аналоговая регулировка
РадиаторCobolt 11658 (HS-03)Два блока, Радиатор без вентилятора HS-03, Радиатор для лазеров 647 нм и 488 нм
РадиаторCoherent1193289Радиатор Obis с вентилятором, 165 x 50 x 50 мм для лазера 561 нм
CAB-USB-miniUSBCobolt10908Два блока, коммуникационный кабель для лазеров 647 нм и 488 нм
алюминий для регулировки высотыMcMaster-Carr9146T35Многоцелевой 6061 Алюминий, Прямоугольный стержень, 4 мм X 40 ММ, 1' Длина для подъема 561 нм
лазерный алюминий для регулировки высотыMcMaster-Carr8975K248Многоцелевой 6061 Алюминий, 1-1/4" Толщина x 3" Ширина x 1' Длина для подъема 405 нм лазерный
кабель BNCL-comCC58C-6RG58C Коаксиальный кабель, BNC Male / Male, 6,0 футов
BNC адаптерL-comBA1087Коаксиальный адаптер, перегородка BNC, заземленный
адаптер SMA на BNC ЛазерыHODSMA-870Cobolt MLD имеют интерфейс SMA, поэтому этот адаптер используется для подключения BNC.
Адаптер SMB-BNCFairview MicrowaveFMC1638316-12SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 дюймов для когерентных лазеров Obis
Карта сбора данныхNational InstrumentsPCI-672313-бит, 32 канала, 800 кГц / с Аналоговое выходное устройство для управления лазерами, светодиодами DIC и т. Д.
Контроллер барьерного фильтра Колесо фильтраSutter InstrumentLambda 10-BУстройство смены оптического фильтра
Делитель излученияCairnOptoSplit III
Дихроичный светоделительChromaT640LPXR-UF2Дихроичный светоделитель отделяет красное излучение от зеленого в OptoSplit III
Дихроичный светоделительChromaT565LPXR-UF2Дихроичный светоделитель отделяет зеленое и красное излучение от синего в OptoSplit III
Фильтр излученияChromaET700/75MДва блока, Фильтр излучения для красного излучения (как Alexa Fluor 647) в OptoSplit III, а также в колесе барьерного фильтра
Фильтризлучения ChromaET595/50MДва блока, Фильтр излучения для желтого/зеленого излучения (как у Cy3B) в OptoSplit III, а также в колесе барьерного фильтра
Фильтризлучения ChromaET525/50MДва блока, фильтр излучения для синего излучения (как Alexa Fluor 488/GFP) в OptoSplit III, а также в колесе фильтра Барьер
Фильтр излученияSemrockFF02-447/60-25Фильтр излучения для фиолетового излучения (как DAPI/Alexa Fluor 405), установленный в колесе фильтра
Барьер Дихроичный светоделительChromazt405/488/561/647/752rpc-UF3Многополосный дихроичный светоделитель для лазерных возбуждений 647, 561, 488 и 405 нм внутри корпуса микроскопа
DAPI Filter setChroma49000установленный в корпусе микроскопа
Nikon laser/TIRF filtercubeChroma91032
590 long pass filterChromaT590LPXR-UF1для совмещения лазера 647 нм и 561 нм лазера 525
long pass filterChromaT525LPXR-UF1для объединения уже объединенных лазеров 647 нм и 561 нм с лазером 488 нм
470 длинночастотный фильтрChromaT470LPXR-UF1для объединения уже объединенных лазеров 647 нм, 561 нм и 488 нм с лазером 405 нм
Лазерный фильтр очистки (647)Chromazet640/20xдля очистки других длин волн от лазера 647 нм
Фильтр лазерной очистки (488)SemrockLL01-488-25для очистки других длин волн от лазерного светодиодного источника света 488 нм
ExcelitasX-Cite120LEDиспользуется только для изображения DAPI
Крепление для зеркалаNewportSU100-F3K
Оптические стойкиNewportPS-2
Зажимная вилкаNewportPS-F
NewportPMKITДля измерения мощности лазера
Дихроичное крепление для сумматора лучаEdmund Optics58-872C-Mount Кинематическое крепление, для удержания дихроичных сумматоров луча в узле лазерного возбуждения
Стопорное кольцоThorlabsCMRRиспользуемое для креплений для дихроичного лучевого сумматора
Волоконная переходная пластинаThorlabsSM1FCFC/PC Волоконная переходная пластина с внешней резьбой SM1 (1.035"-40) Резьба
по оси Z трансляционное креплениеThorlabsSM1ZКрепление для трансляции по оси Z, 30 мм Совместимый с клеткой
ахроматический дуплетный объективThorlabsAC050-008-A-MLØ 5 мм, установленные ахроматические дублеты, с покрытием AR: 400 - 700 нм
Клеточная пластинаThorlabsCP1TM0930 мм Клеточная пластина с внутренней резьбой M9 x 0,5, 8-32 Узел Метчика
СтерженьThorlabsER4Клеточный стержень, длина 4 дюйма, и Oslash;
Кронштейн для монтажа в клетку6 мм ThorlabsCP02BКронштейн для монтажа в клетку 30 мм
Одномодовое оптическое волокноThorlabsP5-405BPM-FC-2Патч-кабель, PM, FC/PC в FC/APC, 405 нм, Panda, 2 м
Многомодовое оптическое волокноThorlabsM42L01Ø 50 & микро; m, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Оптоволоконный патч-кабель, 1 м
Ахроматическая дуплетная линза (магнитная линза)ThorlabsACN127-025-AACN127-025-A - f=-25.0 мм, Ø 1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 нм, вогнутая линза в "магнитной линзе"
Achromatic Doublet lens (магнитная линза)ThorlabsAC127-050-Af=50.0 мм, Ø 1/2" Ахроматический дублет, ARC: 400-700 нм, выпуклая линза в "магнитной линзе"
Стопорное кольцоThorlabsSM05PRRSM05 Пластиковое стопорное кольцо для ø 1/2" Трубки и крепления для объективов, для "магнитного объектива"
Винт с нейлоновым наконечникомThorlabsSS3MN6M3 x 0.5 Установочный винт с нейлоновым наконечником, длиной 6 мм, для удержания "3D объектива"
3D объективCVI Лазерная оптикаRCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700f=10 м, прямоугольный цилиндрический объектив
EMCCD камераAndoriXon Ultra 888
100 нм многоканальные шарикиThermoT7279, микросферы
красный красительThermoAlexa Fluor 647
желто-зеленый красительGE HealthcareCy3
зеленый красительGEHealthcare Cy3B
синий красительThermoAlexa Fluor 488
Измеритель мощности Newport PS-F , TetraSpeck

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lipson, S. G., Lipson, H., Tannhauser, D. S. Optical physics. , Cambridge University Press. Cambridge, UK; New York, NY. (1995).
  2. Török, P., Wilson, T. Rigorous theory for axial resolution in confocal microscopes. Optics Communications. 137 (1-3), 127-135 (1997).
  3. Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Optics Letters. 24 (14), 954-956 (1999).
  4. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780-782 (1994).
  5. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
  6. Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
  7. Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
  8. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  9. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  10. Balzarotti, F., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606-612 (2017).
  11. Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nature Methods. 9 (12), 1181-1184 (2012).
  12. Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6264-6268 (1996).
  13. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  14. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  15. Hua, B., et al. An improved surface passivation method for single-molecule studies. Nature Methods. 11 (12), 1233-1236 (2014).
  16. Fei, J., et al. RNA biochemistry. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
  17. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
  18. Stracy, M., Kapanidis, A. N. Single-molecule and super-resolution imaging of transcription in living bacteria. Methods. 120, 103-114 (2017).
  19. Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8452-8457 (2014).
  20. Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. The Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
  21. Shi, X., et al. Super-resolution microscopy reveals that disruption of ciliary transition-zone architecture causes Joubert syndrome. Nature Cell Biology. 19 (10), 1178-1188 (2017).
  22. Youn, Y., Ishitsuka, Y., Jin, C., Selvin, P. R. Thermal nanoimprint lithography for drift correction in super-resolution fluorescence microscopy. Optics Express. 26 (2), 1670-1680 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence MicroscopySuper Resolution ImagingSingle Molecule FRETMulticolor DetectionEpifluorescence ImagingOptical AlignmentLaser ControlEmission Filter Wheel3D Lens InsertionData Acquisition Card

Related Articles