Method Article

Проведение нескольких режимов изображения с одной флуоресцентным микроскопом

DOI:

10.3791/58320

⸱

October 28th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Chicago, 2The Institute for Biophysical Dynamics, University of Chicago, 3Faculty of Chemistry, Wrocław University of Science and Technology, 4Nikon Instruments Inc.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем практическое руководство построения интегрированных микроскопии системы, которая объединяет обычные epi флуоресцентных изображений, сингл молекула на основе обнаружения суперразрешением изображений и многоцветные сингл молекула обнаружения, включая Одноместный молекула флуоресценции передачи энергии резонанса изображений в один настройки в экономически эффективным способом.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микроскопии флуоресцирования является мощным инструментом для выявления биологических молекул на месте и мониторинга их динамики и взаимодействия в режиме реального времени. Помимо обычных epi флуоресцентной микроскопии для достижения конкретных экспериментальных целей были разработаны различные методы обработки изображений. Некоторые из широко используемых методов включают сингл молекула флуоресценции передачи энергии резонанса (smFRET), который может сообщить конформационные изменения и молекулярных взаимодействий с Ангстрем резолюцией и одной молекулы на основе обнаружения супер-резолюции (SR) изображений, которые могут повысить пространственным разрешением около десяти в twentyfold по сравнению с дифракционный микроскопии. Здесь мы представляем клиентов разработана комплексной системы, которая объединяет несколько методов обработки изображений в одном Микроскоп, включая обычных epi флуоресцентных изображений, изображений на основе обнаружения SR одной молекулы и многоцветные сингл молекула обнаружения, включая smFRET изображений. Различные методы обработки изображений можно легко и можно воспроизвести путем переключения оптических элементов. Эта установка легко принять любой научно-исследовательской лаборатории в биологических наук с необходимостью для рутинных и различных изображений экспериментов на снижение стоимости и пространстве относительно создания отдельных микроскопы для индивидуальных целей.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Флуоресценции Микроскопы являются важными инструментами исследований современной биологической науки и флуоресцентных изображений регулярно проводится во многих лабораториях биологии. Путем пометки биомолекул интерес с флуорофоров, мы можем непосредственно визуализировать их под микроскопом и записывать время зависимых изменения в локализации, конформации, взаимодействия и Ассамблея государств в естественных условиях или в пробирке. Обычных флуоресценции Микроскопы имеют дифракционный пространственным разрешением, который является ~ 200-300 Нм в боковую сторону и ~ 500-700 Нм в осевом направлении1,....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Микроскоп проектирование и монтаж

  1. Возбуждения путь
    Примечание: Возбуждения путь включает лазеры, дифференциальной помехи контраст (DIC) компоненты, Микроскоп тело и его руку освещения.
    1. Подготовьте таблицу оптически изолированы вибрации. Например структурные демпфирования Таблица 48 x 96 x 12'' дает достаточно места для всех компонентов.
      Примечание: Построение set-up в комнате с контролем температуры (например, 21,4 ± 0,55 ° C). Стабильность температуры имеет решающее значение для поддержания оптическое выравнивание.
    2. Установите Микроскоп орган, который оснащен с arm освещения для волоконно-оптических соед....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот микроскоп позволяет гибкое и воспроизводимые переключения между различными методами обработки изображений. Здесь мы покажем примеры изображений, собранных с каждым тепловизионный модуль.

Рисунок 5 d демонстрирует ПСФ мигает на молекулы во время приобретения SR. Тысячи таких изображений реконструированы для создания окончательного изображения SR (Рисунок 5E).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот Микроскоп гибридной системы исключает необходимость покупки нескольких микроскопы. Общая стоимость всех частей, включая таблицы оптики, таблице трудовых установки, программное обеспечение и рабочей станции, это около $230000. Обработанные пользовательских частей, включая mag объектив и 3-D объектив, стоимость около $700 (стоимость зависит от фактических расходов в различных институтах). Типичный коммерчески доступных интегрированных систем для одной молекулы на основе обнаружения SR микроскопии стоить более $300000 .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.F. выражает поддержку от программы ученых Сирл и директор NIH новый новатор премии. Авторы признают полезные предложения от Paul Selvin лаборатории (Иллинойский университет, г. Урбана-Шампейн) для позиционирования 3-D объектива.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Подставка для микроскопа Nikon Ti-E ОбъективNikonTi-E
ОбъективNikon100X NA 1.49 CFI HP TIRF
Программное обеспечение для микроскопииNikonNIS-Elements Advanced Research/HCHC включает модуль "JOBS", программируемый модуль сбора, используемый для визуализации SR.
Кронштейн подсветкиNikonTi-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit MЭтот кронштейн имеет слот для линзы увеличения
Блок анализаNikonTi-AОн установлен в револьвере фильтров.
Система коррекции Z-дрейфаNikonPFSЭта система состоит из шагового двигателя на носовой части объектива, ИК-светодиода и детектора.
Оптическая настольная столешницаTMC783-655-02R
Оптическая настольная базаTMC14-426-35
647 нм лазерCobolt90346 (0647-06-01-0120-100)Модулированный лазерный диод 647 нм 120 мВт, включая лазерную головку, блок управления CDRH, USB-кабель и блок питания (блок питания)
561 нм лазерCoherent1280721OBIS 561 нм LS 150 мВт лазерная система
488 нм лазерCobolt90308 (0488-06-01-0060-100)Модулированный лазерный диод 488 нм 60 мВт, включая лазерную головку, блок управления CDRH, USB-кабель и блок питания (блок питания)
405 нм лазерныйкристаллазерDL405-025-O405 (+/-5) нм, 25 мВт, круговой, M2 < 1.3, низкий шум, CW, TTL до 20 МГц. 2 разъема BNC для TTL и Аналоговая регулировка
РадиаторCobolt 11658 (HS-03)Два блока, Радиатор без вентилятора HS-03, Радиатор для лазеров 647 нм и 488 нм
РадиаторCoherent1193289Радиатор Obis с вентилятором, 165 x 50 x 50 мм для лазера 561 нм
CAB-USB-miniUSBCobolt10908Два блока, коммуникационный кабель для лазеров 647 нм и 488 нм
алюминий для регулировки высотыMcMaster-Carr9146T35Многоцелевой 6061 Алюминий, Прямоугольный стержень, 4 мм X 40 ММ, 1' Длина для подъема 561 нм
лазерный алюминий для регулировки высотыMcMaster-Carr8975K248Многоцелевой 6061 Алюминий, 1-1/4" Толщина x 3" Ширина x 1' Длина для подъема 405 нм лазерный
кабель BNCL-comCC58C-6RG58C Коаксиальный кабель, BNC Male / Male, 6,0 футов
BNC адаптерL-comBA1087Коаксиальный адаптер, перегородка BNC, заземленный
адаптер SMA на BNC ЛазерыHODSMA-870Cobolt MLD имеют интерфейс SMA, поэтому этот адаптер используется для подключения BNC.
Адаптер SMB-BNCFairview MicrowaveFMC1638316-12SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 дюймов для когерентных лазеров Obis
Карта сбора данныхNational InstrumentsPCI-672313-бит, 32 канала, 800 кГц / с Аналоговое выходное устройство для управления лазерами, светодиодами DIC и т. Д.
Контроллер барьерного фильтра Колесо фильтраSutter InstrumentLambda 10-BУстройство смены оптического фильтра
Делитель излученияCairnOptoSplit III
Дихроичный светоделительChromaT640LPXR-UF2Дихроичный светоделитель отделяет красное излучение от зеленого в OptoSplit III
Дихроичный светоделительChromaT565LPXR-UF2Дихроичный светоделитель отделяет зеленое и красное излучение от синего в OptoSplit III
Фильтр излученияChromaET700/75MДва блока, Фильтр излучения для красного излучения (как Alexa Fluor 647) в OptoSplit III, а также в колесе барьерного фильтра
Фильтризлучения ChromaET595/50MДва блока, Фильтр излучения для желтого/зеленого излучения (как у Cy3B) в OptoSplit III, а также в колесе барьерного фильтра
Фильтризлучения ChromaET525/50MДва блока, фильтр излучения для синего излучения (как Alexa Fluor 488/GFP) в OptoSplit III, а также в колесе фильтра Барьер
Фильтр излученияSemrockFF02-447/60-25Фильтр излучения для фиолетового излучения (как DAPI/Alexa Fluor 405), установленный в колесе фильтра
Барьер Дихроичный светоделительChromazt405/488/561/647/752rpc-UF3Многополосный дихроичный светоделитель для лазерных возбуждений 647, 561, 488 и 405 нм внутри корпуса микроскопа
DAPI Filter setChroma49000установленный в корпусе микроскопа
Nikon laser/TIRF filtercubeChroma91032
590 long pass filterChromaT590LPXR-UF1для совмещения лазера 647 нм и 561 нм лазера 525
long pass filterChromaT525LPXR-UF1для объединения уже объединенных лазеров 647 нм и 561 нм с лазером 488 нм
470 длинночастотный фильтрChromaT470LPXR-UF1для объединения уже объединенных лазеров 647 нм, 561 нм и 488 нм с лазером 405 нм
Лазерный фильтр очистки (647)Chromazet640/20xдля очистки других длин волн от лазера 647 нм
Фильтр лазерной очистки (488)SemrockLL01-488-25для очистки других длин волн от лазерного светодиодного источника света 488 нм
ExcelitasX-Cite120LEDиспользуется только для изображения DAPI
Крепление для зеркалаNewportSU100-F3K
Оптические стойкиNewportPS-2
Зажимная вилкаNewportPS-F
NewportPMKITДля измерения мощности лазера
Дихроичное крепление для сумматора лучаEdmund Optics58-872C-Mount Кинематическое крепление, для удержания дихроичных сумматоров луча в узле лазерного возбуждения
Стопорное кольцоThorlabsCMRRиспользуемое для креплений для дихроичного лучевого сумматора
Волоконная переходная пластинаThorlabsSM1FCFC/PC Волоконная переходная пластина с внешней резьбой SM1 (1.035"-40) Резьба
по оси Z трансляционное креплениеThorlabsSM1ZКрепление для трансляции по оси Z, 30 мм Совместимый с клеткой
ахроматический дуплетный объективThorlabsAC050-008-A-MLØ 5 мм, установленные ахроматические дублеты, с покрытием AR: 400 - 700 нм
Клеточная пластинаThorlabsCP1TM0930 мм Клеточная пластина с внутренней резьбой M9 x 0,5, 8-32 Узел Метчика
СтерженьThorlabsER4Клеточный стержень, длина 4 дюйма, и Oslash;
Кронштейн для монтажа в клетку6 мм ThorlabsCP02BКронштейн для монтажа в клетку 30 мм
Одномодовое оптическое волокноThorlabsP5-405BPM-FC-2Патч-кабель, PM, FC/PC в FC/APC, 405 нм, Panda, 2 м
Многомодовое оптическое волокноThorlabsM42L01Ø 50 & микро; m, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Оптоволоконный патч-кабель, 1 м
Ахроматическая дуплетная линза (магнитная линза)ThorlabsACN127-025-AACN127-025-A - f=-25.0 мм, Ø 1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 нм, вогнутая линза в "магнитной линзе"
Achromatic Doublet lens (магнитная линза)ThorlabsAC127-050-Af=50.0 мм, Ø 1/2" Ахроматический дублет, ARC: 400-700 нм, выпуклая линза в "магнитной линзе"
Стопорное кольцоThorlabsSM05PRRSM05 Пластиковое стопорное кольцо для ø 1/2" Трубки и крепления для объективов, для "магнитного объектива"
Винт с нейлоновым наконечникомThorlabsSS3MN6M3 x 0.5 Установочный винт с нейлоновым наконечником, длиной 6 мм, для удержания "3D объектива"
3D объективCVI Лазерная оптикаRCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700f=10 м, прямоугольный цилиндрический объектив
EMCCD камераAndoriXon Ultra 888
100 нм многоканальные шарикиThermoT7279, микросферы
красный красительThermoAlexa Fluor 647
желто-зеленый красительGE HealthcareCy3
зеленый красительGEHealthcare Cy3B
синий красительThermoAlexa Fluor 488
Измеритель мощности Newport PS-F , TetraSpeck

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lipson, S. G., Lipson, H., Tannhauser, D. S. Optical physics. , Cambridge University Press. Cambridge, UK; New York, NY. (1995).
  2. Török, P., Wilson, T. Rigorous theory for axial resolution in confocal microscopes. Optics Communications. 137 (1-3), 127-135 (1997).
  3. Klar, T. A., Hell, S. W.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence MicroscopySuper Resolution ImagingSingle Molecule FRETMulticolor DetectionEpifluorescence ImagingOptical AlignmentLaser ControlEmission Filter Wheel3D Lens InsertionData Acquisition Card

Related Articles