Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценка клеточного стресса и воспаления в дискретных окситоцина секретирующих ядрах головного мозга новорожденных крыс до и после первого кормления молозивом

7.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58341

⸱

14 ноября 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Psychiatry, Columbia University, 2Department of Pathology & Cell Biology, Columbia University Medical Center, 3Department of Psychiatry, Division of Molecular Imaging and Neuropathology, New York State Psychiatric Institute, 4EB Sciences

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол изолировать ядер головного мозга в мозге новорожденных крыс в сочетании с первого кормления молозивом. Эта техника позволяет исследование питательной недостаточности стресса в головном мозге, модулированные энтероцитах сигнализации.

Аннотация

Цель настоящего Протокола заключается в изоляции окситоцина рецепторов ядер богатые мозга в мозге новорожденных до и после первого кормления молозивом. Экспрессию белков, известно реагировать метаболического стресса была измерена в мозг ядер изолятов, используя Западный blotting. Это было сделано для оценки ли метаболический стресс индуцированного питательной недостаточности в организме срабатывает нейрональных стресс. Ранее мы показали, что питательной недостаточности у новорожденных вызывает метаболический стресс в кишечнике. Кроме того молозиво окситоцин модулирует клеточного стресса ответ, воспаления и autophagy маркеров в кишечнике Вилли новорожденных крыс до и после первого канала. Сигнализации белковых маркеров, связанные со стрессом эндоплазматического ретикулума [ER сопровождающий иммуноглобулина белок (BiP), 2а фактор инициации эукариотических перевод (eIF2a) и eIF2a киназы протеина R (p-PKR)], а также два воспаление сигнализации белков [ядерный фактор κB (NF-kB) и ингибитор κB (IkB)], были измерены в ядрах головного мозга новорожденного [ядро одиночного тракта (НТС), паравентрикулярного ядра (ПВН), выше оптические ядро (сын), коры (CX), стриатума ядер (STR), и медиальный preoptic ядро (МПО)] до первого канала (безгрунтовых, молозиво) и после начала кормления (грунтовать молозиво). Выражение BiP/GRP78 и p-eIF2a были upregulated в безгрунтовых и downregulated в загрунтовать НТС ткани. NF-kB сохраняется (высокий) в цитоплазме CX, STR и MPO, тогда как NF-kB был ниже и неизменным в НТС, PVN и сын в обоих условий. Коллективные Бип и p-eIF2 выводы согласуются с реакции на стресс. eIf2a был фосфорилированных dsRNA зависимые киназы (p-PKR) в сына, CX, STR и MPO. Однако в НТС (и в меньшей степени в ПВН), eIf2a был фосфорилированных на другой киназы, общего управления nonderepressible-2 киназы (GCN2). Стресс модулирующих механизмов, ранее наблюдали в кишечник новорожденного enterocytes, по-видимому, отражаться в некоторых регионах мозга OTR-богатые люди. НТС и ПВН могут использовать разные фосфорилирование механизм (под дефицит питательных веществ) из других регионов и огнеупорных воздействия питательной недостаточности. Вместе эти данные свидетельствует о том, что ответы мозга на стресс питательной недостаточности компенсируются сигнализации от молозиво загрунтовать enterocytes.

Введение

В отличие от нашего понимания раннего развития мозга, происходят в течение дней до недели после родов, относительно мало известно о множества динамических изменений, происходящих в первые часы жизни крыс. Ключевой задачей был небольшой размер мозга новорожденных крыс и требование для высокотехнологичных инструментов изолировать дискретные мозга или одиночных клеток. Исследования часто оценки гена транскрипции и трансляции не1,2, который не дает твердое понимание функциональных уровней активированного сигнальных молекул. Другие рассмотреть выражение с использованием иммуногистохимия регионов мозга ссылку, которая не позволяет для количественной оценки выражения уровня3. Никаких исследований на сегодняшний день изучило активации сигнальные пути, связанные с крыс первого молозива, кормить в дискретных мозга, которая требует быстрой изоляции и жертву и измерение выражения протеина и фосфорилирование белков с помощью Западной blotting. В то время как мозг microdissection выполняется на старых и больших мозги, мы не выявили ссылку, выполняя одну ячейку мозга удар в мозге P0. Этот документ представляет собой протокол для изоляции ограниченных регионах неонатальной мозга, используя сравнительно низкотехнологичных удар техники и западных blotting процедура для измерения выражение протеина в относительно малых выборок. Этот протокол может быть подходящим для исследования вопросов, которые требуют оценки выражения протеина и столб-поступательные изменения (например., фосфорилирование) в относительно ограниченных районах небольших мозги любых видов, при условии, что пользователь может визуально определить области мозга, представляющих интерес с атласом и идентифицировать достопримечательности.

Этот метод был разработан для понимания изменений, происходящих в головном мозге в результате первого молозива новорожденных крыс корма, который богат окситоцина (OT). OT давно известны своей способностью стимулировать сокращения матки и пусть вниз молоко. Однако OT теперь известно играть широкий спектр ролей в регуляции многих телесных функций и поведения4. К примеру OT выступает против стресса и воспаления в сочетании с адаптивной афиллиативной поведения5, задержки опорожнения желудка и замедляет кишечного транзита. OT рецепторов (OTR) были определены в кишечных нейронов и кишечного эпителия6,,78. Желудочно-кишечного тракта OT особенно важны для младенца в начале послеродового периода. К примеру грудное вскармливание ассоциируется с доставкой значительного количества OT новорожденных кишки9,10, и данные показывают, что OTR сильно оверэкспрессировали в двенадцатиперстной кишки ворсинки в молоко, молочный период8.

В vitro эксперименты с использованием линии клеток кишки продемонстрировали на клеточном уровне, что окситоцин модулирует важных молекул в стресс, сигнальный путь11,12 и играет регулирующую роль в переводе белков 12. Эти исследования показывают, что компоненты молока, включая экзогенных окситоцина от матери, имеют важное значение в ответ развернул белка у новорожденных для снижения клеточного стресса13.

В естественных условиях и ex vivo исследования показали, что молозиво OT модулирует клеточного стресса ответ, воспаления и autophagy маркеров в Вилли кишечника новорожденных крыс. Новорожденного enterocytes страдают существенной клеточного стресса на их стороне Люминал, когда кишечник одновременно подвергается микробиоты от матери в многочисленных белков, включая гормонов, таких как OT9 и молозиво14,15 , 10 , 16.

Эффекты OT на мозг были изучены17. Однако OT сигнальных механизмов, продемонстрировал в кишечнике в начале послеродового периода не были изучены в головном мозге. В этом документе метод для изоляции дискретных мозга ядер ствола мозга новорожденных крыс и гипоталамус, с помощью электрофореза используется для профилирования изолированных мозга. Общая цель этого метода является захватить состояние ячейки сигнализации в областях как можно ближе к рождения, до и после первого молочный поросенок, в ткани мозга с наименьшим индексом глиальных/нейронов мозга. Основанием для развития этой техники является, что она позволяет для быстрого изоляции регионов ограничены, микроскопические мозга новорожденных щенков с коллекцией более однородных нейронов для ex vivo исследований с использованием автоматизированных Западный blotting методология, предлагая весьма последовательной результаты на сравнительно небольшие образцы расчлененный. Недостатком предыдущие работы включает в себя более грубых диссекции (срезы мозга или весь мозг) и старых животных18,19. Мозги молодых детенышей невероятно динамичны, показывая волны глиальных дифференциации после рождения. С целью изучения мозга изменения под влиянием первого кормления щенков, необходимо изучение ограниченного нейрональных ядер с воспроизводимые рассечение.

Молочные корма обычно анализируется иммунологических и питательного воздействия на здоровье или ген выражение (например, в enterocytes20,21), тогда как редко рассматривается его влияние на областях мозга во время развития мозга. Со ссылкой на кишечнике холецистокинина рецепторов вагусной реле ядрах ствола головного мозга, но не внутриклеточных сигнальных путей22был проанализирован эффект молока транзита в кишечнике на функции мозга. Существует обширная литература на уязвимость развивающегося мозга новорожденных недоедания матерей во время беременности23, но стресс и воспаление сигналы не рассматриваются. Важно отметить, что текущий метод использует явление в день ноль крыса новорожденных, которая изолирует кровь родился молозиво раздражителей с вагусной реле висцеральных раздражителей. Это так называемые стресс гипо оперативность период характеризуется незрелых ядре tractus solitarius (НТС)-гипоталамический цепи сразу же после рождения24,25 , ограничивающий НТС, паравентрикулярного ядра (ПВН), и supraoptic ядро (сын) сигналы на крови родился стимулы.

Этот метод полезен для анализа нескольких сигнальных путей и относительно ограничена нейрональных клеток, при том условии, что ткани мозга собирают в послеродовой день-0 в крыс, помимо ли матерей были оспорены или нет, любой вид лечения во время беременности. Помета могут быть проанализированы для эффектов молозиво, кормить против предварительно питание сигнализации. При сравнении сигналов между областями мозга с бедными по сравнению с богатые белком урожайности, этот метод позволяет в капиллярной определение общего белка полипептид полос в капиллярах, параллельно иммунной количественный белков антигенов. Этот метод позволяет количественные сравнения, используя условные единицы, результаты, полученные путем же антитела без стандартных количественных кривых и ссылка на общий белок в капиллярной. Сравнение результатов, полученных различными антителами возможно только с помощью количественных стандартных кривых.

Этот метод позволил для оценки двунаправленный сигнализации, происходящих между кишечника и мозга, что может повлиять на функции в обоих органов26. Ассоциация между окситоцина и приема пищи, которая была подробно изучена в последние годы27, поддерживает связь между повышенной окситоцина сигнализации и наличия питательных веществ. Эти исследования также поддерживают концепцию Конверс эту энергию, которую дефицита связаны с сокращением гипоталамуса окситоцина сигнализации.

Более ранние исследования эффекта OT на активность мозга продемонстрировал, что воспаление индуцированных кишки вызвало cFos транскрипции в гипоталамо НДС, миндалевидного и грушевидной коры, которая была огнеупорной ваготомия28. Однако системных притока OT с секретин сократилась cFos реакции мозга на спровоцировали воспалительной реакции в кишечнике28. Это предполагает, что влияние экзогенных OT было осуществлено маршруты помимо блуждающего реле, возможно через кровь сигнальных молекул, через площадь postrema6,29.

В этом исследовании были оценены клеточного стресса сигнальных путей, которые ранее наблюдали в кишечнике в головном мозге. Гипотеза, что компоненты молока может защищать или отложить влияние воспаления на кишечнике проницаемость для микробиологических и других метаболитов, и в свою очередь, воздействие на мозг функция. Четко антагонистические различия в IkB против BiP сигнализации по направлению ворсинки, до и после грунтования молозиво13, предложил, что мозги новорожденных, все еще в процессе разработки, может смысле эти сигналы молозиво индуцированной кишки.

Сигнализации белка маркеры, используемые в предыдущих экспериментах кишки, которые связаны с эндоплазматического ретикулума стресса были измерены. Они включают ER шаперонов BiP, eIF2a фактор инициации перевода (которая служит интегратор стресс в ответ30), eIF2a киназы p-PKR и два воспаления сигнализации белков (NF-kB и его ингибитора, IkB).

Были выбраны шесть областей мозга, основанные на их способности в взрослых выделяют или реагировать ОП. НТС, расположен в верхней продолговатого мозга, первое реле висцеральных ввода и получает прямой передачи сигналов от блуждающего сенсорных нейронов в кишечнике31 возможно родился крови цитокинов, токсинов и гормоны через прилегающие области postrema32. PVN, supraoptic ядро (сын), стриатума ядер (STR), коре (CX) и медиальный preoptic ядро (МПО) получают сигналы от кишки через НТС.

Результаты показали, что реакции клеточного стресса в непосредственной послеродовой период до молозиво грунтовки и сразу же после первого кормления отличается в НТС, по сравнению с PVN и сына. Сигнализации в CX, STR и MPO отличается от НДС и сына, а также. Различные защитные функции OT было показано ранее для модуляции клетки стресс и воспалительного процесса в кишечнике скорее всего воспринимается некоторых областей головного мозга. В совокупности данные указывают, что на клеточном уровне, в течение первых часов после рождения, мозг реагирует на метаболический стресс, связанный с недостаточностью питательных веществ. Данные также показывают, что масштабы и направления регулирования последствий кормить молозивом зависят от региона и что в некоторых регионах они зеркало OT эффекты, приведенный ранее в кишечнике.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Это исследование был одобрен институциональный уход животных и использование комитетами в Колумбийском университете и в Нью-Йорке психиатрических государственный институт.

1. Подготовка тканей

  1. Приказ приурочен беременных крыс от поставщика.
  2. Следуйте приурочен беременных крыс путем наблюдения за их животы растущую в недели после их прибытия и впоследствии ищите щенков на ожидаемой даты поставки, проверив клетке каждые 2 ч до начала поставки.
  3. Удалить щенков с перчатке их хвост до их первого канала для безгрунтовых щенков (не живот белый молоко проявляется при просмотре живота) или после первого корм для загрунтованных щенков (в какой-то момент белый живот будет видна на их живота), как описано в своевременности NE (Рисунок S1).
    Примечание: Первый канал молозиво называется грунтовка щенка; Таким образом щенок безгрунтовых до первого канала, после чего они заливают молозиво.
  4. Быстро обезглавить наркозу щенка, используя острый, чистый хирургические ножницы.
  5. Удаление мозга путем разрезания кожи вниз средней и верхней поверхности черепа в нос. Затем используя пинцет, нежно совать нос от кости подвергать мозга (рис. 1A) и локализовать bregma, пометив его с пером, как пластины кости удаляются (рис. 1B).
  6. Быстро место весь мозг в форме представляет собой метакрилат мозга при комнатной температуре на корональный нарезки при комнатной температуре (рис. 1 c).
  7. Без промедления Сделайте 500 мм толщиной ломтиками, используя свежие лезвия бритвы. Положите ломтики ростральной для каудальной в чашке Петри для поддержания ориентации секций (рис. 2).
  8. Быстро добавить искусственных спинномозговой жидкости (фаго; 1,0 мм х2PO4, 26 мм NaHCO3, 118.6 NaCl, 3,0 мм KCl, 203.3 MgCl2-6 H2O) без глюкозы и инкубации срезов для 60 мин при 28-30 ° C, постоянно помешивая на Орбитальный шейкер метаболически и дифференцированно оспорить безгрунтовых против молозиво загрунтовать тканей.
  9. Идентифицировать мозга ядер, которые требуются для удара с помощью мозга Атлас33 и анатомические ориентиры на разделе ткани. Поместите этот кусочек с ядрами интерес в чашку Петри и переместить его рассечения Микроскоп.
  10. После того, как визуализировать, быстро выбивать 4 из 6 различных ядер с помощью инструмента керна, выбор размера лучший удар в ядро и последовательно между выборками (рис. 2).
    Примечание: Теперь на оставшиеся срез мозга будет отверстие, где ткани мозга был удален. В этом исследовании, мы подакцизным следующих ядер с помощью ниже координаты. Все передняя/задняя (A / P) координаты отсчитываются от Bregma (за исключением НТС, который является ссылкой на АИР Scriptorius). Все спинной/вентральный (D/V) координаты отсчитываются от поверхности коры головного мозга (за исключением НТС, который от поверхности мозга). Следующие координаты включают A / P, медиальной/боковое (M/Л) и D/V в мм: 1) ядро одиночного тракта (НТС, A / P, 0,4-0,8; L, ± 0,2; D/V, 0.3 (от поверхности мозга), 2) паравентрикулярного ядра (PVN, -0,8; ± 0,2; 0), 3) выше оптические ядро (сын, -1.1; ± 1.4; 4.3), 4) коры (CX, частичная коры область 1, -2,8; ± 1,5; 0,6), 5) стриатума ядер (STR, -0.0; ± 1,6; 1.8) и 6) медиальной приоптического ядро (MPO,-0.6; ± 0,2; 4.2).
  11. Быстро погружайте кулаками ядер в 0,06 мл ледяной, буфера извлечения белков, содержащие ингибиторы протеазы и иы АБС битор фосфатазы за 60 минут (см. шаг 2.3).

2. белка добычу

  1. Приготовляют раствор экстракции белка, с помощью комплекта лизис белка (Таблица материалов) за день до ожидаемого щенок доставки.
  2. Оттепель (на льду) замороженные (-20 ° C) водный раствор ингибиторов протеаз и фосфатазы комплекта буфера lysis и место буфера lysis и раствор в ДМСО ингибиторов протеаз/фосфатаз на льду.
  3. Добавление 1,85 мл буфера lysis в чистой, ледяной 15 мл трубку. Затем добавьте 0,1 мл водный раствор ингибиторов и 0,05 мл ДМСО распущена ингибиторов. Наконец шапку и кратко вихревой трубе и держать его при температуре-20 ° C до использования.
  4. Ярлык 24 чистого microcentrifuge трубы (по 0,5 мл) для лизиса процедуры. Назначают 12 трубок мозга молозиво безгрунтовых группы (U) [6 слева (L) и 6 право ядер головного мозга (R)], и этикетку по ядер акроним, стороне и условия (например., НЦ-L-U, НЦ-R-U, и т.д.). Ярлык вторая группа в составе 12 трубок для образцов, заливают молозиво.
  5. Ярлык два дополнительных набора труб, как это сделано в шаге 2.4 для запасов белка экстракты (с использованием трубки 1,5 мл Eppendorf стиль) и первый набор подготовки проб (с использованием 0,5 мл трубки). Держите эти трубы в два отдельных помечены замораживания коробки (каждый для 100 трубок). Одно поле будет использоваться для безгрунтовых образцов и другой для загрунтованных образцов.
  6. Оттепель лизис решение на льду в день, что щенки будут доставлены, и во время инкубации срезов мозга фаго, лизис аликвота 0,06 мл раствора в процедуре лизис трубы (от шаг 2.4) и добавить удары ядер и инкубировать в ice для 60 мин.
  7. Центрифуга инкубирован лизированных ядер на 30 мин в охлажденный мини центрифуга на 14000 об/мин (10 000 x g) и тщательно аспирационная 0,055 мл супернатант с правильно установить пипетки. Передача супернатант в складе трубы предварительно охлажденным 1,5 мл (с шагом 2.5) и положить их на льду. До замораживания (при-20 ° C) трубы запасов белка, передача 0,012 мл супернатант в 0,5 мл предварительно охлажденные трубы для подготовки первого образца (с шагом 2.5) и оставить их на льду.

3. Пробоподготовка для измерения в капиллярной белка

  1. Используйте набор и подготовка реагентов для разделения согласно инструкциям производителя. Добавление 0,003 мл реагента Мастер микс для каждого из 12 образцов в 0,5 мл, помечены трубы (с шагом 2.5) на льду, которые содержат 0,012 мл экстракт белка.
  2. Включите блок Отопление до 95 ° C и добавление 0,004 mL реагента, подготовленный на шаге 3.1 биотинилированным молекулярного веса (МВт) лестница в трубку с 0.016 мл деионизованной воды. Денатурируйте лестница и образцы, поместите трубки лестница и 12 образцов безгрунтовых белка экстрактов в блоке тепла в 95 ° C за 5 мин и хранить их на 4 ° C до использования.
  3. Повторите шаги 2.0 до 3,2, от добычи белка для пробоподготовки, для ядра, ударил от молозиво загрунтовать крыс.

4. электрофорез подготовка

  1. Оттепель биотина, маркировки реагента (хранится в морозильник на-80 oC) на скамейке и подготовить комплект обнаружения белка на льду на 4 ° C следуя инструкциям производителя.
  2. Смешать 0,15 мл luminol с 0,15 мл перекиси и загрузить 0,01 мл в 25 скважин (строка E, Уэллс 1-25) пластины для западных автомате. Загрузить 0,008 мл стрептавидина-ПХ из комплекта в скважины D1 D25
  3. Загрузите 0,01 мл разбавителя раствор антител в скважины C1 C25 и B1.
  4. Спина 24 образцы протеина и лестница трубы кратко (2-3 секунды) в minicentrifuge пул вниз испарившейся воды из трубки шапки.
  5. Загрузите 0,003 мл 12 безгрунтовых образцов в скважинах A2 A13, 0,003 мл 12 молозиво загрунтовать образцов в скважин A14 A25 и 0,005 мл биотинилированным лестницы в хорошо A1.
  6. Оставьте пустой строке F и нагрузки 0,45 мл буфера мытья в каждой из 5 отсеков в каждом из 3 строки под строкой F. Крышка плиты с пластиковой крышкой во избежание испарения во время остальные процедуры.
  7. Кратко вихревой талой биотина маркировки реагента и добавить 0,15 мл реагента в его назначенным трубки; затем добавить к нему 0,15 мл агент растворения общего белка и перемешайте до однородности.
  8. Снимите крышку с плиты и загрузить 0,01 мл агентов 1 и 2 в колодцы B2 до В25. Крышка и центрифуги для 10 мин на 1000 g x, чтобы удалить все пузырьки воздуха из различных решений. Используйте пустую тарелку в центрифуге для баланса.

5. электрофорез

  1. Хотя пластины спиннинг, откройте файл запуска в Западной машины придает автоматизированных, указывающий на странице выпадающего из «файл» для запуска анализа общего белка и нажав соответствующие пятно.
  2. Аннотируйте образцы хорошо на компьютере. Затем удалите пластину с центрифугой снимают крышку и Осторожно отделите алюминиевая крышка от разделения отсеков решения.
  3. Установите пластину в автоматизированных Западной инструмент, снимите крышку из поля капиллярной картриджа, вставьте картридж в его место и закрыть дверь.
  4. Нажмите кнопку «Выполнить» и при появлении запроса с типом пробирного («общий белок»), введите название образцов (например, «безгрунтовых 2-13 и молозиво-контроль включён, 14-25»). Нажмите кнопку «ОК» и при появлении запроса выполнения Дата активации и идентификационный номер файла, выполнения, запишите время окончания выполнения.
  5. В конце выполнения (170 мин после начала) открыть дверь инструмента, удаление капиллярной картриджа и отменить его в распоряжение колюще-режущие предметы. Выбросите пластины в распоряжении биологического вещества.
  6. Щелкните значок кривых разделения на странице анализ выполнения файла и убедитесь, что все образцы работать должным образом и показывают несколько кривых белка в всех капилляров.

6. анализ сигналов белки

  1. В меткой 1,5 мл добавьте 0,003 мл кролика анти фосфо eIF2a (p-eIF2a) антител и приостановить его в 0,3 мл (1: 100 разрежения) в разбавителя из комплекта подходит обнаружения антител. Затем держите его на льду.
  2. Ярлык luminol трубку и добавить 0,15 мл luminol и 0,15 мл перекиси из этого комплекта модуля обнаружения и отказаться от 0,01 мл в скважины E1 для E25 свежий, автоматизированных Западной пластины.
  3. Отказаться от 0,01 мл вторичного анти антитела кролика в скважины D2 до D25 и добавить 0,01 мл стрептавидина-ПХ из комплекта хорошо D1.
  4. Отказаться от 0,01 мл первичного антитела (от шага 6.1) в скважины C2 до С25 и добавить 0,01 мл разбавителя 2 раствор антител в скважины C1 и B1 до В25.
  5. Оставьте пустым, строка F скважин и заполнить 0,45 мл буфера мытья на 5 отсеков 3 строк ниже строке F.
  6. Кратко спина охлажденных образцы для 3 s и добавить строку A в том же порядке, они были добавлены для assay общего белка, начиная от A2 до A25 0,003 мл каждого образца. Добавление 0,005 мл биотинилированным МВт лестницы хорошо A1 и крышка.
  7. Центрифуга пластины, как это сделано в шаге 4.8. В то время как пластины спиннинг, открыть (в автоматизированного программного обеспечения, связанные с Западной и компьютер) нового запуска файла и укажите dropdown странице от «Файл» для запуска анализа молекулярного размера, нажав соответствующие пятно.
  8. В странице пробирного введите имена образец в каждом капиллярные, а затем введите имя основного антитела в выделенных местах и вторичные антитела анти кролик ниже.
  9. В конце центрифугирования повторите шаги 5.3-5.5, за исключением имя, присвоенное файлу запуска этот раз должно быть «p-eIF2a безгрунтовых 2 – 13 и молозиво-контроль включён, 14 – 25».
  10. После электрофореза разделения проверьте файл запуска для иммунной реактивности вершины антигенов на размерами 40 – 43 кДа. Где отсутствует МВт пиков этот размер, щелкните правой кнопкой мыши ниже кривой и указать внутри раскрывающегося списка для добавления МВт на пик, который гарантирует, что размер и произвольное количество ниже кривой записываются.

7. обработка результатов

  1. Открыть файл электронной таблицы для общего белка запустить в автоматизированных Западной запустите файл и предоставить идентификационный номер.
  2. Откройте файл запуска анализа общего белка на странице анализа в режиме кривой и пометить все вершины в отдельных капилляров. Затем скопируйте и вставьте их в электронную таблицу и сумма районы под кривой всех вершин, записанная в всей капилляров.
  3. В отдельном столбце организовать общее количество белка для каждого столбца с капиллярной чисел, имена соответствующих мозга ядер и номера Идентификаторов запуска файлов.
  4. Открыть таблицу для p-eIF2a антигена и в одном столбце, записывать площадь под кривой от каждого капилляра бок о бок с его соответствующих капиллярного номер, имя ядра мозга, и идентификатор выполнения файла.
  5. Скопируйте столбце общего белка (параллельно кривой количества p-eIF2a) в третьей таблицы и вычислить p-eIF2a:total соотношения белков в третьей колонке.
  6. Сбор результатов от шаги с 4 по 6 для каждого ядра мозга, организовать их в группы ядер и создать гистограмму.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Представитель полос иммунореактивности относительно общего белка показывают, что мозг ядер с очень низким заготовленной белка. Это требует использования автоматизированных иммуноблоттинга техника, которая очень чувствительна по сравнению с канонической западную помарку. Этот подход может работать с fortyfold меньше белка на капиллярные, по сравнению с за Лейн в западной помарки.

Дифференциального воздействия молозиво грунтовки на B...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Техника для microdissection дискретного, OTR-богатые ядер головного мозга в мозге новорожденных крыс представлена в настоящем документе. Общепризнано, что нейроны являются узкоспециализированными, даже в хорошо изученных ядер в головном мозге. Этот высоко воспроизводимый подход к изоляции определенных OTR-богатые ядер позволяет тестирование надежный гипотезы. Использование автоматизированных Западный blotting, были улучшить согласованность и воспроизводимость результатов. Ограничением этой методики остается скромным мозг...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Авторы благодарят Manon Рейнджер и Александра Шульц за их помощь в подготовке настоящего Протокола.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Bradford solutionBio Rad
Набор для лизиса белкаProtein simpleCBS403Bicine/CHAPS
WES kit ProteinsimpleWES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07)
антимышиный конъюгат IgG HRP Proteinsimple
Rabbit антифосфо-eIF2aКлеточная сигнальная технологияSER51, 9721
мышиный mAb анти-PKRКлеточная сигнализациятехнология 2103
кролик антифосфо-PKRMilliporeThr451, 07-886
кролик mAb анти-PKRклеточная сигнализациятехнология 12297
кролик mAb анти-GAPDHклеточная сигнализация2118
мышиный mAb антифосфо-IKBКлеточная сигнальная технология9246
мышиный mAb анти-IKBклеточная сигнальная технология4814
кролик анти-BiPклеточная сигнальная технология3183
кролик анти-GCN2клеточная сигнальная технология3302
кролик mAb антифосфо-GCN2BIORBYTT899
беременный Sprague-Dawley ratsCharles River Laboratories
Punch deviceWellTech Rapid Core или Harris Uni-Core0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50
технология

Ссылки

  1. Hietaniemi, M., et al. Gene expression profiles in fetal and neonatal rat offspring of energy-restricted dams. Journal of Nutrigenetics and Nutrigenomics. 2 (4-5), 173-183 (2009).
  2. Okabe, A., et al. Homogenous glycine receptor expression in cortical plate neurons and Cajal-Retzius cells of neonatal rat cerebral cortex. Neuroscience. 123 (3), 715-724 (2004).
  3. Mailleux, P., Takazawa, K., Erneux, C., Vanderhaeghen, J. J. Distribution of the neurons containing inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase and its messenger RNA in the developing rat brain. Journal of Comparative Neurology. 327 (4), 618-629 (1993).
  4. Carter, C. S. Oxytocin and Human Evolution. Current Topics in Behavioral Neuroscience. , (2017).
  5. Sippel, L. M., et al. Oxytocin and Stress-related Disorders: Neurobiological Mechanisms and Treatment Opportunities. Chronic Stress (Thousand Oaks). 1, (2017).
  6. Agnati, L. F., et al. Aspects on the integrative actions of the brain from neural networks to "brain-body medicine". Journal of Receptors and Signal Transduction Research. 32 (4), 163-180 (2012).
  7. Welch, M. G., Margolis, K. G., Li, Z., Gershon, M. D. Oxytocin regulates gastrointestinal motility, inflammation, macromolecular permeability, and mucosal maintenance in mice. American Journal Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 307 (8), G848-G862 (2014).
  8. Welch, M. G., et al. Expression and developmental regulation of oxytocin (OT) and oxytocin receptors (OTR) in the enteric nervous system (ENS) and intestinal epithelium. Journal of Comparative Neurology. 512 (2), 256-270 (2009).
  9. Prakash, B. S., Paul, V., Kliem, H., Kulozik, U., Meyer, H. H. Determination of oxytocin in milk of cows administered oxytocin. Analytica Chimica Acta. 636 (1), 111-115 (2009).
  10. Solangi, A. R., Memon, S. Q., Mallah, A., Khuhawar, M. Y., Bhanger, M. I. Quantitative separation of oxytocin, norfloxacin and diclofenac sodium in milk samples using capillary electrophoresis. Biomedical Chromatography. 23 (9), 1007-1013 (2009).
  11. Klein, B. Y., et al. Oxytocin modulates markers of the unfolded protein response in Caco2BB gut cells. Cell Stress and Chaperones. 19 (4), 465-477 (2014).
  12. Klein, B. Y., Tamir, H., Hirschberg, D. L., Glickstein, S. B., Welch, M. G. Oxytocin modulates mTORC1 pathway in the gut. Biochemical and Biophysical Research Communications. 432 (3), 466-471 (2013).
  13. Klein, B. Y., Tamir, H., Ludwig, R. J., Glickstein, S. B., Welch, M. G. Colostrum oxytocin modulates cellular stress response, inflammation, and autophagy markers in newborn rat gut villi. Biochemical an Biophysical Research Communications. 487 (1), 47-53 (2017).
  14. Donnet-Hughes, A., et al. Potential role of the intestinal microbiota of the mother in neonatal immune education. Proceedings of the Nutritional Society. 69 (3), 407-415 (2010).
  15. Perez, P. F., et al. Bacterial imprinting of the neonatal immune system: lessons from maternal cells? Pediatrics. 119 (3), e724-e732 (2007).
  16. Takeda, S., Kuwabara, Y., Mizuno, M. Concentrations and origin of oxytocin in breast milk. Endocrinolcia Japonica. 33 (6), 821-826 (1986).
  17. Quintana, D. S., Outhred, T., Westlye, L. T., Malhi, G. S., Andreassen, O. A. The impact of oxytocin administration on brain activity: a systematic review and meta-analysis protocol. Systematic Reviews. 5 (1), 205(2016).
  18. Dobbing, J., Sands, J. Comparative aspects of the brain growth spurt. Early Human Development. 3 (1), 79-83 (1979).
  19. Orr, M. E., Garbarino, V. R., Salinas, A., Buffenstein, R. Extended Postnatal Brain Development in the Longest-Lived Rodent: Prolonged Maintenance of Neotenous Traits in the Naked Mole-Rat Brain. Frontiers in Neuroscience. 10, 504(2016).
  20. Hansson, J., et al. Time-resolved quantitative proteome analysis of in vivo intestinal development. Molecular and Cellular Proteomics. 10 (3), (2011).
  21. Mochizuki, K., Yorita, S., Goda, T. Gene expression changes in the jejunum of rats during the transient suckling-weaning period. Journal of Nutritional Science and Vitaminology (Tokyo). 55 (2), 139-148 (2009).
  22. Rinaman, L., Banihashemi, L., Koehnle, T. J. Early life experience shapes the functional organization of stress-responsive visceral circuits. Physiology and Behavior. 104 (4), 632-640 (2011).
  23. Johannes, G., Sarnow, P. Cap-independent polysomal association of natural mRNAs encoding c-myc, BiP, and eIF4G conferred by internal ribosome entry sites. RNA. 4 (12), 1500-1513 (1998).
  24. Rinaman, L. Hindbrain noradrenergic A2 neurons: diverse roles in autonomic, endocrine, cognitive, and behavioral functions. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (2), R222-R235 (2011).
  25. Walker, C. D., Toufexis, D. J., Burlet, A. Hypothalamic and limbic expression of CRF and vasopressin during lactation: implications for the control of ACTH secretion and stress hyporesponsiveness. Progress in Brain Research. 133, 99-110 (2001).
  26. Montiel-Castro, A. J., Gonzalez-Cervantes, R. M., Bravo-Ruiseco, G., Pacheco-Lopez, G. The microbiota-gut-brain axis: neurobehavioral correlates, health and sociality. Frontiers in Integrative Neuroscience. 7, 70(2013).
  27. Blevins, J. E., Ho, J. M. Role of oxytocin signaling in the regulation of body weight. Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders. 14 (4), 311-329 (2013).
  28. Welch, M. G., et al. Combined administration of secretin and oxytocin inhibits chronic colitis and associated activation of forebrain neurons. Neurogastroenterology Motility. 22 (6), 654(2010).
  29. Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 85 (1-3), 1-17 (2000).
  30. Taniuchi, S., Miyake, M., Tsugawa, K., Oyadomari, M., Oyadomari, S. Integrated stress response of vertebrates is regulated by four eIF2alpha kinases. Scientific Reports. 6, 32886(2016).
  31. Altschuler, S. M., Bao, X. M., Bieger, D., Hopkins, D. A., Miselis, R. R. Viscerotopic representation of the upper alimentary tract in the rat: sensory ganglia and nuclei of the solitary and spinal trigeminal tracts. Journal of Comparative Neurology. 283 (2), 248-268 (1989).
  32. Shapiro, R. E., Miselis, R. R. The central neural connections of the area postrema of the rat. Journal of Comparative Neurology. 234 (3), 344-364 (1985).
  33. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (1997).
  34. Nayak, R., Pintel, D. J. Adeno-associated viruses can induce phosphorylation of eIF2alpha via PKR activation, which can be overcome by helper adenovirus type 5 virus-associated RNA. Journal of Virology. 81 (21), 11908-11916 (2007).
  35. Zaborske, J. M., et al. Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p. Journal of Biological Chemistry. 284 (37), 25254-25267 (2009).
  36. Hollis, J. H., Lightman, S. L., Lowry, C. A. Integration of systemic and visceral sensory information by medullary catecholaminergic systems during peripheral inflammation. Annals of the New York Academy of Sciences. 1018, 71-75 (2004).
  37. Klein, B. Y., et al. Oxytocin opposes effects of bacterial endotoxin on ER-stress signaling in Caco2BB gut cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (2), 402-411 (2016).
  38. Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. NF-kappaB in the nervous system. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (3), a001271(2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Оценка клеточного стресса и воспаления в дискретных окситоцина секретирующих ядрах головного мозга новорожденных крыс до и после первого кормления молозивом
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.