Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Ex Vivo Визуализации ячейки конкретных кальция сигнализации на трехсторонней синапса диафрагмы мыши

7.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58347

⸱

4 октября 2018 г.

 ,  , 
1Department of Physiology and Cell Biology, School of Medicine, University of Nevada, 2Department of Pharmacology, Larner College of Medicine, University of Vermont

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол к изображение кальция сигнализации в популяциях типов индивидуальных клеток на перекрестке мышиных нервно.

Аннотация

Электрической активности клеток в тканях может контролироваться электрофизиологические методы, но они обычно ограничены к анализу отдельных клеток. Поскольку увеличение внутриклеточного кальция (Ca2 +) в цитозоле часто возникает из-за электрической активности, или в ответ на множество других раздражителей, этот процесс может контролироваться изображений клеток загружен с флуоресцентные кальция чувствительных красители.  Однако трудно изображение этот ответ в типе отдельной ячейки в пределах всей ткани, потому что эти красители, принимаются все типы клеток в тканях. Напротив показатели генетически закодированный кальция (GECIs) может быть выражена типа отдельной ячейки и флуоресцировать в ответ на увеличение числа внутриклеточных Ca2 +, позволяя изображений Ca2 + сигнализации в всей популяции типы отдельных клеток. Здесь мы применяем использование GECIs GCaMP3/6 к мыши нервно-Джанкшн, трехсторонний синапса между двигательных нейронов, скелетных мышц и терминал/perisynaptic Шванновские клетки. Мы продемонстрировать полезность этой техники в классическом ex vivo ткани препаратов. С помощью оптического сплиттера, мы выполняем двойной длины волны изображений Ca2 + сигналов динамической и статической метки нервно-Джанкшн (NMJ) в рамках подхода, который может быть легко адаптирована для мониторинга двух клеток конкретных ГЕЧИ или генетически закодированный напряжения показатели (GEVI) одновременно. Наконец мы обсуждаем процедуры, используемые для захвата пространственных карты интенсивности флуоресценции. Вместе эти оптические, трансгенных и аналитические методы могут быть использованы для изучения биологической активности отдельных клеток субпопуляций в NMJ в самых разнообразных контекстах.

Введение

NMJ, как все синапсы, состоит из трех элементов: Пресинаптический терминал производным от нейрона, постсинаптических нейронов/эффекторных клеток, и perisynaptic глиальных клеток в1,2. Хотя основные аспекты синаптической передачи были впервые представлены на этом синапса3, многие аспекты этого процесса остается неизвестным, отчасти из-за выражение же молекул путем различных клеточных элементов этой синапса. Например рецепторы для пуриновых нуклеотидов аденина СПС и ацетилхолин (АКП), которые совместно выпущенная двигательных нейронов в позвоночных NMJ, выраженные мышцы, Шванновские клетки и двигательных нейронов, что затрудняет интерпретации любого функциональное действие, оказываемое этими веществами (например, передатчик выпуска или ответ, мышечной силы поколения)4. Кроме того хотя трехсторонний компоненты NMJ просты по сравнению с, например, нейронов в центральной нервной системе, которые часто exhibit несколько синаптических входов, ли двигательных нейронов, мышечных клеток или Шванновские клетки изменяться в ответ на стимулы на основе на их внутреннюю неоднородность (например, эмбриональных дифференцирование, волокна подтип, морфология) остается неясным. Для того, чтобы рассмотреть каждый из этих вопросов, было бы целесообразно одновременно отслеживать реакцию многих клеток в пределах одной синаптических элемента, а также трек, в то же время, такой ответ в любом из отдельных элементов. Обычные стратегии, используя химические красители для измерения сигналов кальция не могут достичь этих двух целей, потому что краска ванна прикладной занимает несколько типов клеток после применения к ткани, и внутриклеточно загружен краситель может использоваться только для визуализации отдельных лиц или небольших групп клеток. Здесь, используя трансгенных мышей, выражая GECIs предназначен для измерения кальция клеток конкретных сигнализации, вместе с конкретных изображений и программного обеспечения инструменты5, мы продемонстрировать первый из этих двух общих целей и обсудить как добавление новых Трансгенные инструменты поможет достижению второй. Эта техника будет полезно для тех, кто заинтересован в отслеживания динамики кальция или других сотовых сигнализации наблюдаемых событий через ген закодированы оптических датчиков в несколько клеточных популяций в то же время.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Животноводство и эксперименты были проведены в соответствии с национальными институтами здравоохранения руководство для ухода и использования лабораторных животных и IACUC при университете Невады.

1. Подготовка диафрагмы и диафрагмального нервов от трансгенных мышей

  1. Покупка трансгенных мышей и праймеры олигонуклеотида с генотипом этих мышей.
    Примечание: Праймеры, перечислены на странице «Информация» для каждого из этих мышей.
    1. Порода 3-6-месячного мыши, выражая одну копию соответствующего аллеля трансгенных/запрессовка Cre водитель и нулевой копии условного аллеля GCaMP3/6 с второй мыши того же возраста, выражая одну или две копии условного GCaMP3 / 6 аллели и нулевой копии аллеля Cre водитель.
    2. Генотип детенышей и Марк те, которые имеют КРР и условного аллели GCaMP3/6 — это будет отныне называться двойной трансгенных мышей (например, Myf5-Cre, условного GCaMP3)6.
      Примечание: Таким образом, все данные будут наследовать от мышей, выражая одну копию КРР и условного аллели GCaMP3/6. Это особенно важно при добавлении в других мутантных мышей (например, нокауты) эти кресты.
  2. При двойной трансгенных мышей соответствующего возраста (например, послеродовой день 0 или 5 [Р0 или P5] или взрослый), усыпить мышей путем обезглавливания их с ножницами (для мышей моложе P10) или путем размещения их в камеру ингаляции изофлюрановая — когда они являются больше не реагировать щипать хвост с парой щипцов, они готовы к самопожертвованию.
  3. Жертву животное, обезглавливание с ножницами.
  4. Поперек секции через весь животное чуть ниже печени и чуть выше сердца и легких иридэктомия ножницами.
  5. Вскрыть прочь, печени, сердца и легких, стараясь сохранить длину диафрагмальный нерв, который достаточно долго, чтобы быть втянутым в всасывания электрода (т.е., 1-2 см).
    Примечание: Левый диафрагмальный нерв могут быть определены как кусок белой ткани, которая входит в медиальной части влево диафрагмы. Это не должны быть обрезаны, когда удаление легких. Право диафрагмальный нерв проходит внутри кусок фасции, который также содержит верхней полой вены и тоньше и белее, чем верхней полой вены. Вместе они оба проникают прямо медиальной диафрагмы.
  6. Далее удалите грудной клетки и позвоночника, за исключением тонкий хребта вокруг диафрагмы.
  7. Место диафрагмы и образец диафрагмального нерва в трубу отцентрифугировать Кребса-звонарь раствором с 1 мкг/мл 594-αBTX 10 мин в темноте.
    Примечание: Эта концентрация 594-αBTX этикетки ACh рецепторы (AChRs) без блокирования их функции (личное наблюдение).

2. стимуляция и запись действий потенциалов мышц

  1. С помощью minutien Пен, иммобилизации диафрагмы, закрепляя его на 6 см блюдо с диэлектрической силиконовый гель покрытием и заполнены с ~ 8 мл раствора кислородом Кребса-звонарь и поместить его на этап микроскопа. Perfuse диафрагма с более Кребса-Рингера раствор (8 мл/мин) за 30 мин.
    Примечание: Это произведет промывку несвязанных 594-αBTX, а также уравновешивает ткани после вскрытия.
  2. Сделайте всасывания электрода согласно установленных методов7.
    1. При 4-кратном, используя микроманипулятор наведите левый диафрагмальный нерв всасывания электрода и применять всасывания, потянув ствола 5-мл шприц, подключенных к трубки, которая прилагается к всасывания электрода.
      Примечание: Когда успешно втянуты всасывания электрода, диафрагмальный нерв тугой. Включите стимулятор и стимулировать диафрагмальный нерв, щелкая ручной переключатель 1 x.
    2. Убедитесь, что диафрагма контрактов в ответ на стимуляцию 1 Гц, визуально изучив его с brightfield освещения. Если нет, то отрегулировать напряжение, повернув регулятор напряжения постепенно добиться supramaximal импульсов, которые могут быть проверены путем визуального осмотра мышц. Если до сих пор не видно, задуть нерва с шприц и пытаются нарисовать его снова, применяя всасывания.
  3. Выключить перфузии и добавьте мышц конкретных миозин ингибитор БХК6 или закрытом напряжения натрия канал антагонист µ-conotoxin8 до конечной концентрации 100 мкм.
    1. Чтобы сделать 100 мкм БХК, Пипетка 4 мкл акций 200 мм в ДМСО и predilute в 1 мл раствора Кребса-звонаря.
    2. 1 мл раствора Кребса-звонарь снять блюдо.
    3. Добавьте prediluted БХК, блюдо.
      Примечание: Этот predilution помогает предотвратить индукции в неразбавленном ДМСО непереходными флуоресцентные ответ в GCaMP3-выражая клеток.
    4. Подождите 30 минут, а затем, включите перфузии свежих Кребса-звонарь решение для еще 20-30 мин.
  4. Подготовка записи электрода.
    1. Перчатках, уложите микропипеткой съемник боросиликатного стекла filamented с внешнего диаметра (OD) 1 мм и внутренним диаметром 0,4 мм (ID) и затяните циферблатов зажать его в положение. Закройте дверцу съемник.
    2. С помощью съемника P-97, программа следующий параметр: тепло в 900, тянуть на 120, скорость на 75, время на 250, давление в 500 и без дополнительных петель.
      Примечание: Resistance (R) измеряется с помощью программного обеспечения управления усилителя: программное обеспечение получения данных подтверждает сопротивление путем решения по формуле V = IR. Программное обеспечение контроллера проходит известный ток (I) (обычно 1 НС) через электрод и измеряет изменение напряжения (V), что позволит нам решить для р.
    3. Для эмбриональных диафрагмы что обеспечивает сопротивление около 60 MΩ и для старых диафрагмы, 10-20 MΩ. Загрузите запись электрод с 3 M KCl.
  5. При 10-кратном опустите электрода в мышцы, используя второй микроманипулятор на противоположной стороне сцены как стимулирующий электрода.
  6. С помощью электрофизиологических данных приобретения программного обеспечения, подождать, пока мембранный потенциал покоя изменяется от 0 до -65 mV или ниже.
  7. Стимулирование на 1 Гц и проверить наличие потенциал действия мышц путем проверки для большой потенциал, что экспонаты скромный выброс (потенциал, который поднимается выше 0 mV, когда она начинается -65 mV или ниже). Не путайте стимуляции артефакт с потенциал действия.
    Примечание: Потенциал значительно больше в продолжительности (~ 5 мс) чем стимуляции артефактов.

3. томография флуоресценции образца

  1. При 20-кратном, найдите концевую полоса в центре мышцы, ищет 594-αBTX-меченых NMJs под желто зеленый свет возбуждения (550 Нм). Переключиться на синий свет возбуждения (470 Нм) для изображения Ca2 + ответы в мышцы, мотонейрона или Шванновские клетки.
  2. При желании настройте изображение разделителя с полосовых фильтров и дихроичный фильтр краевыми для отображения двойной длины волны.
  3. Чтобы вычислить максимальное флюоресценция (Fmax) выставлены GCaMP3/6-выражая ткани, мкл 12 3 M хлорида калия (KCl) Диафрагма препаратов6.
    1. Проводить эксперименты с панель яркости на панели таблицы подстановки, установите 110% от уровня, на котором GCaMP3/6-выражая ткани экспонатов насыщения при 20-кратном, без биннинга в ответ KCl.
  4. Запись при 20 кадрах в секунду, чтобы не пропустить никаких быстрых событий.
  5. Стимулировать с 1-45 s 20-40 Гц нерва стимуляции, обеспечивая поезд импульсов с помощью всасывания электрода или добавить фармакологических агонисты Ванна приложением или перфузии и собирать динамических флуоресцентные Ca2 + ответы в одной ячейке подтип Вместе с сигналом NMJ статические 594-αBTX.
    Примечание: Если ткани конкретных красного или far-red ГЕЧИ или GEVI мышей становятся доступными для использования в NMJ, они могут использоваться для сбора двух динамических сигналов, отражающие двух отдельных клеточных элементов в NMJ.
  6. Когда изображения или электрофизиологических эксперименты закончены потому, что были достигнуты желаемые результаты, perfuse воды через линии перфузии и сосать воду 2 x - 3 x через всасывания электрод для обеспечения что соли не строить.

4. экспорт и анализ данных по стандартное отклонение люминесцентная интенсивности карта (SDiu16)

  1. Запись последовательности изображений, как 16-битных TIFF стеки и загрузить их в нужный визуализации система анализа данных для анализа.
  2. В меню файл 8d программного обеспечения выберите Стек изображений интерес и нажмите кнопку Загрузить.
    1. После того, как видео загрузится, сканировать через время, чтобы определить раздел, который имеет не клеточную активность флуоресцентные.
      Примечание: Этот регион будет использоваться для создания фона образца.
    2. Удерживайте клавишу Shift и нажмите, чтобы рисовать региона интерес (ROI) поле в области определены как области образец фона.
    3. После создания поле, нажмите клавишу пробел для создания участок изменения фоновой активности.
    4. Щелкните правой кнопкой мыши трассировку и выберите параметр ассорти представить вариант Дамп ROI как текст чтобы трассировки xy координаты текстового файла.
  3. Переход обратно к видео интерес, сканирования снова определить время регион, где происходит действие интерес.
    1. С помощью средней кнопки мыши, выберите этот регион время в поле время желтый.
    2. Щелкните правой кнопкой мыши на видео и выберите Стек УОП и стат карта вариант 5.
      Примечание: Это будет генерировать стандартное отклонение (SD карта) в левом окне.
    3. Нажмите на карту SD и затем нажмите [ ] 19 x применять тепла карта соответствующего цвета.
    4. Щелкните правой кнопкой мыши на карте SD и выберите STM загрузки и сохранения, которая представит параметр сохранить stm как tiff , чтобы сохранить SD карту.
    5. Затем, нажмите [ ключ 19 x вернуться к карте серого цвета.
    6. Нажмите C и D воспитывать средства сопоставления плотности. Используя левую кнопку мыши и кнопкой мыши центр, отрегулируйте порог включить все флуоресцентные деятельность, показано на SD карте.
    7. Нажмите C , чтобы закрыть плотность инструменты при сохранении настройки порога.
    8. Щелкните правой кнопкой мыши на карте SD и выберите STM частицы , а затем Найти PTCLS.
      Примечание: Это будет идентифицировать отдельные клетки, выражая флуоресцентные активности.
    9. Еще раз щелкните правой кнопкой мыши на карте SD и выберите Создать частиц ROIs.
      Примечание: Это будет накладывать выбранные ячейки на оригинальное видео интерес.
    10. Удерживая клавишу Shift, щелкните правой кнопкой мыши на любой из теперь выявленных частицы ROIs на оригинальное видео.
    11. Выберите маркер ROI и мера Int в ROI.
      Примечание: Это будет генерировать отдельных флуоресцентные активности участков для каждого выявленных ROI в видео интерес. Эти можно сохранить, щелкнув правой кнопкой любой из этих и выбор ассорти, следуют Дамп ROI как текст.
  4. Для детальной логики, лежащих в основе этих операций пожалуйста, смотрите файл исходного кода9.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Несколько примеров изменения интенсивности флуоресценции, посредничестве увеличивает внутриклеточную Ca2 + в пределах определенных клеток типы NMJ, показать полезности такого подхода. Эти результаты представлены в виде пространственной флуоресценции интенсивности карты, которые предоставляют расположение ответивших клеток, а также интенсивность их ответов, таким образом позволяя для оценки как многие клетки реагируют и сколько каждая клетка реагирует к конкретному стимул. Напри...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы предлагаем некоторые примеры измерения Ca2 + ответы в определенных ячейках нетронутыми нервно-мышечной ткани, с помощью выражения ГЕЧИ мышей. Для того, чтобы успешно выполнить эти эксперименты, крайне важно, чтобы не травмировать диафрагмального нерва во время вскрытия. Чтобы изображение Ca2 + ответы в Шванновские клетки на низкой или высокой мощности (т.е., 20 X или 60 X), необходимо использовать БХК или µ-conotoxin блок движения. Для маломощных изображений Ca2 + ответо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа было поддержано средств от национальных институтов здравоохранения (НИЗ) GM103554 и GM110767 (T.W.G.) и национального центра по 5P20RR018751 научно-исследовательских ресурсов и национального института Генеральной медицинских наук 8P 20 GM103513 (для G.W.H.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
мыши Myf5-CreJax#007893Стимулирует экспрессию мышечных клеток уже на уровне класса E136
Wnt1-Cre мышиJax#003829Стимулирует экспрессию во всех  Шванновские клетки в E13, но не P209
Sox10-Cre мышиJax#025807Стимулирует экспрессию шванновских клеток в более старшем возрасте
Условные GCaMP3 мышиJax#029043Экспрессирует GCaMP3 клеточно-специфичным образом
Условные GCaMP6f мышиJax#024105Экспрессирует GCaMP6f клеточно-специфичным образом
BHC (3-(N-бутилэтанимидоил)-4-гидрокси-2H-хромен-2-он)Hit2Lead#5102862Блокирует миозин скелетных мышц, но не нейротрансмиссию6
CF594-α-BTXBiotium#00007Маркирует кластеры ацетилхолиновых рецепторов в пептидах NMJ&
micro;-conotoxin GIIIbInt'l#CONO20-01000Блоки Nav1.4 потенциал-зависимый натриевый канал8
Silicone Dielectric Gel; aka SylgardEllswoth Adhesives# Sil Dielec Gel .9KG Позволяет иммобилизовать мембрану с помощью мельчайших штифтов
Миниатюрные штифты (диаметр 0,1 мм)Fine Science Tools26002-10Иммобилизует диафрагму на силиконовом диэлектрическом геле
Вертикальный микроскоп Eclipse FN1 NikonMBA74100позволяет постановку и наблюдение образцов
Базовая платформа для стационарного микроскопа с ручным переводчиком XY-микроскопа Autom8MXMScrПозволяет перемещать образец
Ручной микроманипулятор НаришигеМ-152Держит регистрирующие и стимулирующие электроды 
Микроэлектродный усилитель Молекулярные приборыAxoclamp 900AПозволяют вести острый электрод внутриклеточная электрофизиологическая запись
Микроэлектрод малошумящая система сбора данныхMolecular DevicesDigidata 1550 Позволяет получать электрофизиологические данные
Система анализа данных микроэлектродовМолекулярные приборыPCLAMP 10Standard Выполняет электрофизиологический анализ данных
Прямоугольный волновой стимуляторТраваS48Стимулирует нерв к возбуждению мышц
Блок изоляции стимуловТраваPSIU6Уменьшает артефакты стимуляции
Боросиликатные нити, внешний диаметр 1,0 мм, внутренний диаметр 0,5 мм;SutterFG-GBF100-50-15Пронзает и регистрирует нервно-вызванные мышечные
потенциалы Боросиликатные нити, внешний диаметр 1,5 мм, внутренний диаметр 1,17 мм SutterBF150-117-15Удлиненный и используемый для отсасывания электрод
Micropipette PullerSutterP-97 Протягивает и подготавливает записывающие электроды
1200x1200 пикселей, камера cMOS с тыловой подсветкой ФотометрикаPrime 95bЧувствительная камера, которая позволяет получать изображения с высоким разрешением и высокой скоростью
Источник светаLumencorSpectra XОбеспечивает освещение от светодиодов для флуоресцентного наблюдения
  Флуоресцентные погружные объективы с коррекцией на бесконечность, Ш.Д. 2мм NikonCFI60Обеспечивает большие рабочие расстояния для визуализации образца
Волоконно-оптический осветитель с галогенной лампойSumitaLS-DWL-NОбеспечивает освещение для наблюдения в светлом поле
W-View Gemini Image Splitter HamamatsuA12801-01проецирует 1 пару изображений с двумя длинами волн, разделенных дихроичным на одну камеру
Однополосные полосовые фильтры  (512/25-25 и 630/92-25) СемРокFF01-512/25-25; FF01-630/92-25Позволяет получать двухдиапазонную визуализацию
560 нм Одногранный дихроичный светоделительSem RockFF560-FDi01-25x36Дихроичное зеркало, которое разделяет лучи света для получения изображений с двумя длинами волн
Система сбора данных визуализацииNikonNIS Elements - MQS31000Позволяет получать данные визуализации
Модуль управления длиной волныNikonMQS41220Модуль для получения данных визуализации acqusiition
Аппаратный модуль разветвителя выбросов NikonMQS41410Модуль для получения данных визуализации
Система анализа данных визуализацииNAVolumetry 8D5, ФиджиПозволяет анализировать интенсивность флуоресценции и другие данные визуализации

Ссылки

  1. Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).
  2. Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions. Nature Reviews Neuroscience. 15 (11), 703-718 (2014).
  3. Fatt, P., Katz, B. An analysis of the end-plate potential recorded with an intracellular electrode. Journal of Physiology. 115 (3), 320-370 (1951).
  4. Todd, K. J., Robitaille, R. Purinergic modulation of synaptic signalling at the neuromuscular junction. Pflugers Archive. 452 (5), 608-614 (2006).
  5. Hennig, G. W., et al. Use of Genetically Encoded Calcium Indicators (GECIs) Combined with Advanced Motion Tracking Techniques to Examine the Behavior of Neurons and Glia in the Enteric Nervous System of the Intact Murine Colon. Frontiers of Cellular Neuroscience. 9, 436(2015).
  6. Heredia, D. J., Schubert, D., Maligireddy, S., Hennig, G. W., Gould, T. W. A Novel Striated Muscle-Specific Myosin-Blocking Drug for the Study of Neuromuscular Physiology. Frontiers of Cellular Neuroscience. 10, 276(2016).
  7. Johnson, B. R., Hauptman, S. A., Bonow, R. H. Construction of a simple suction electrode for extracellular recording and stimulation. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 6 (1), A21-A26 (2007).
  8. Hong, S. J., Chang, C. C. Use of geographutoxin II (mu-conotoxin) for the study of neuromuscular transmission in mouse. British Journal of Pharmacology. 97 (3), 934-940 (1989).
  9. Heredia, D. J., Feng, C. Y., Hennig, G. W., Renden, R. B., Gould, T. W. Activity-induced Ca2+ signaling in perisynaptic Schwann cells of the early postnatal mouse is mediated by P2Y1 receptors and regulates muscle fatigue. Elife. 7, e30839(2018).
  10. Cho, J. H., et al. The GCaMP-R Family of Genetically Encoded Ratiometric Calcium Indicators. ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Нервно-мышечное соединениегенетически кодируемые индикаторы кальциядвухволновая визуализацияоптический разделительфлуоресцентный альфа-бунгаротоксинстимуляция диафрагмального нервавизуализация шванновских клетоквизуализация мышечных клеток
Ex Vivo Визуализации ячейки конкретных кальция сигнализации на трехсторонней синапса диафрагмы мыши
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.