Высок объём измерение плазматической мембраны запечатывания эффективность в клетках млекопитающих

Summary

Здесь мы описываем высокой пропускной способностью на основе флуоресценции assay, который измеряет плазматической мембраны, запечатывания эффективность через анализ флуориметрический и изображений в живых клетках. Этот assay может использоваться для скрининга наркотиков или целевых генов, которые регулируют плазматической мембраны запечатывания в mammalian клетках.

Abstract

В их физиологической среде часто подвергаются mammalian клеток механических и биохимических напряжений, которые приводят к повреждению плазматической мембраны. В ответ на эти убытки сложных молекулярных механизмов быстро запечатайте плазматической мембраны для восстановления ее барьерные функции и поддержания выживание клетки. Несмотря на 60 лет исследований в этой области мы все еще не имеют глубокое понимание ячейки запечатывания машины. С целью выявления клеточных компонентов этого управления плазматической мембраны запечатывания или препараты, которые могут улучшить запечатывания, мы разработали на основе флуоресценции высок объём assay, который измеряет плазматической мембраны, запечатывания эффективность в клетках млекопитающих культивируемых в планшет. Как модель системы для повреждения плазматической мембраны, клетки подвергаются бактериальной порами формирования токсин листериолизин O (LLO), который образует большие 30-50 Нм диаметр белковых поры в холестерин содержащих мембраны. Использование контролируемой температурой Гонав мульти-режим чтения позволяет для быстрого и чувствительной spectrofluorometric измерений в сочетании с brightfield и флуоресцентной микроскопии изображений живых клеток. Кинетический анализ интенсивности флуоресценции, испускаемых мембраны impermeant нуклеиновые кислоты привязки флюрохром отражает степень мембраны ранения и запечатывания на клеточном уровне населения, позволяя для расчета эффективности запечатывания ячейки . Флуоресцентной микроскопии изображений позволяет для перечисления клеток, которые конститутивно Экспресс флуоресцентные Химера ядерных белков гистонов 2b, в каждой скважине микропланшетов с учетом потенциальных различий в их количество и позволяет для возможного Идентификация отдельных клеточных популяций. Этот assay высок объём является мощным инструментом предполагается расширить наше понимание мембранных механизмов ремонта через скрининга для принимающих генов или экзогенно добавил соединений, что управления запечатывания плазматической мембраны.

Introduction

Mammalian клетки подвергаются механические, осмотического и биохимических стресс, что приводит к потере целостности плазматической мембраны. Без быстрого и эффективного запечатывания, поврежденные клетки быстро будет поддаваться запрограммирован или некротической смерти. С 1960 года усилия, чтобы понять плазматической мембраны, запечатывания процесса были вызваны разрушительные последствия, связанные с его дисфункции. Действительно заболеваний, таких как конечности-ремень мышечной дистрофии, сахарный диабет, Синдром Чедиака-Хигаси были связаны с недостатками плазматической мембраны ремонт из-за мутации гена кодирования dysferlin, производство Расширенный гликирования ....

Protocol

1. Подготовка

1. Мобильный покрытие
   Примечание: Человека шейки матки эпителиальных клеток HeLa и HeLa, выражая гистона 2B-GFP (H2B-GFP), были использованы в настоящем Протоколе, но этот assay может быть адаптирована к другим mammalian клеток¹⁹.
   1. Отсоедините адэрентных клеток от 75 см² клетки культуры колбу путем промывания клетки с 2 мл трипсина-ЭДТА 0,25%. Замените используемые трипсина 2 мл свежего трипсина ЭДТА 0,25%.
   2. Инкубируйте клетки при 37 ° c за 5 мин до тех пор, пока клетки округлые и отделен от колбы.
   3. Ресуспензируйте клетки в 8 мл среднего роста (DMEM, содержащие 10% тепло инактивирова....

Results

Точность подсчета клеток: Клетки HeLa часто используются как линия клеток млекопитающих модель для изучения мембраны ремонт механизмов. При оценке мембраны ремонт на уровне популяции клеток, важно для плиты клетки на такой же концентрации на всех скважинах для правильной интерпретации. Это также важно для проверки во время анализа числа клеток эквивалент через скважины. Клетки HeLa, которые конститутивно Экспресс гистона 2B сливается с GFP (H2B-GFP) были введены в этот assay автоматически.......

Discussion

Этот assay измеряет эффективность мембраны запечатывания на уровне популяции клеток с высокой пропускной способностью. Он может использоваться экран для клеточных компонентов или наркотиков библиотек, которые могут повлиять на ремонт мембраны. Описанные assay используется формат 96-луночных пластины, но она может быть адаптирована к 384-ну пластины для более высокой пропускной способности. Преимуществом этого анализа является его способность получить измерения флуоресценции адэрентных живых клеток в режиме реального врем.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
SpectraMax i3x Многорежимный считыватель микропланшетов	Молекулярные устройства	i3x
MiniMax 300 Цитометр для визуализации	Молекулярные устройства	5024062
TO-PRO-3	ThermoFisher Scientific	T3605
Йодид пропидия	ThermoFisher Scientific	P3566
HeLa	ATCC	CCL2
HeLa H2B-GFP	Millipore	SCC117
Трипсин-ЭДТА 0,25%	ThermoFisher Scientific	25200056
96-луночный Corning плоское дно черный полистироль, обработанная культурой ткани	Corning	3603
Сбалансированные соли Хэнкса	Sigma-Aldrich	H4891
EGTA	ISC BioExpress	0732-100G
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
D-(+)-глюкоза, HybriMax	Sigma-Aldrich	G5146-1KG