Методическая статья

Определение репродуктивного компетентности путем подтверждения наступления полового созревания и выполнение анализа фертильности у мышей и крыс

DOI:

10.3791/58352

⸱

13 октября 2018 г.

1Department of Animal Science, Michigan State University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Многие процедуры и генетические мутации влияют сроки половой зрелости и плодородия. Этот протокол описывает неинвазивный метод для оценки начала полового созревания в мышей и крыс до создания исследование фертильности в половозрелых животных.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оценка компетентности репродуктивного имеет решающее значение для понимания воздействия лечения или генетические манипуляции на оси репродуктивного, также называют гипоталамо гипофизарно гонадной оси. Репродуктивного ось является ключевым интегратор окружающей и внутренней ввода адаптации рождаемости благоприятные условия для размножения. Прежде чем приступать к исследование фертильности у мышей и крыс, половой зрелости оценивается исключить возможность того, что наблюдаемое репродуктивного фенотипов, вызванных задержкой или отсутствует пубертатном начала. Этот протокол описывает неинвазивная подход к оценке пубертатном начала в мужчины через определение препуция разделения и женщин через влагалище и первая течка. После подтверждения завершения полового созревания и достижения половой зрелости может быть начато исследование фертильности. Процедура описывает условия оптимального размножения для мышей и крыс, как настроить исследование фертильности и какие параметры, чтобы оценить и определить, если лечение или удаление ген влияет на фертильность.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для достижения половой зрелости и репродуктивного компетенции требуется переходного периода полового созревания. Пубертатном переходного периода и поддержания плодородия в зрелом возрасте регулируется репродуктивного оси, также называют гипоталамо гипофизарно гонадной оси (рис. 1). Сроки наступления полового созревания и поддержания плодородия жестко регулируется как внутренних, так и экологических факторов, чтобы увеличить шансы на выживание потомства и родители1,2. Этот протокол обеспечивает неинвазивная подход для определения начала полового созревания в мышей и крыс для подтверждения половой зрелости до создания плодородия исследование для оценки репродуктивного компетенции.

Исследование фертильности проводится в половозрелых животных и может быть начато после животные прошли через полового созревания. До начала полового созревания оси репродуктивного покоя, и ключевым фактором полового созревания, гонадолиберин (GnRH), выпускается на гипофиза в недостаточной суммы для начала полового созревания (рис. 1). Наступления полового созревания — сложный процесс, который приводит к увеличению выпуска GnRH на средний возвышение. ГнРГ способствует лютеинизирующего гормона (ЛГ) и фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) из гипофиза, два гормоны, гонадной созревания и репродуктивной функции (рис. 1)3,4,5 .

Оскорбления к оси репродуктивного приведет снижение фертильности и может также заранее или задержки начала полового созревания. Условия, знаны, что влияют на сроки начала полового и репродуктивного компетенции включают в себя воздействие на эндокринную, нарушая химических веществ6,7, увеличение/уменьшение тела вес1,8, изменения в 2,длина день9 и генетические мутации10,11,12,13,14,15.

Наступления половой зрелости является важным шагом, который необходимо выполнить до настройки анализа фертильности. Преимущества определения пубертатном начала через препуция разделения, влагалище и первой течки, являются неинвазивные характеристики этих процедур, как они не требуют сбора крови или жертвоприношения животных16, 17.

После начала полового созревания определяется, правильно исследование фертильности обеспечит важную информацию о целостности репродуктивного оси и обычно имеет второе преимущество создания экспериментальных животных для дальнейшего исследования (уточнение) 18. установки исследование фертильности, указанных в настоящем Протоколе может обнаруживать мелкие и крупные дефициты в репродуктивных компетенции у самцов и самок. Основные параметры оценки включают в себя 1) время первый помет, 2) количество пометов, сгенерирована заданного размера сроки и 3) помет. Наконец включены рекомендации для типа последующих исследований, которые могут проводиться для определения причины ухудшения плодородия.

Описывается протокол относится к мышей и репрезентативных данных отражают работу у трансгенных мышей. Однако все включенные протоколы одинаково допустимы в крыс.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитета Мичиганского государственного университета и проводились в соответствии с руководство по уходу и использованию лабораторных животных.

1. определить наступления полового созревания

  1. Следуйте институциональных руководящих принципов для одежды, как минимум, надо носить пальто чистой лаборатории и чистые перчатки. Всегда обращайтесь в чистых перчатках мышей.
  2. Подготовка рабочей области, поместив площадку на столе.
    1. Место чистой мыши Кейдж Топ с сеткой вверх на клавиатуре.
    2. Настройка масштаба рабочей области. Место чистой 500 – 1000 мл стакан на шкале и тары.
    3. Поместите лист рядом с рабочей области, чтобы записывать веса и препуция разделения, влагалище или первой течки.
  3. Идентифицировать мышей для изучения. Выполнение ежедневных проверок для начала полового созревания до достижения половой зрелости. Выполните проверки в то же время дня всей учебы. Наступления полового созревания может произойти как послеродовой день 11-1219, однако, в самых экспериментальных установок, пубертатном начала мониторинга начинается ~ 22 дней.
  4. Место клетки мыши в рабочей области (шаг 1.2). Откройте отсек и поместите крышку, бутылку воды и продовольствия держатель на столе.
  5. Определение препуция разделения у мышей-самцов.
    1. Удерживая мышь за хвост, поместите его на верхней части клетки чистой мыши от шаг 1.2.1. Аккуратно придерживая на хвост, пусть мыши исследовать сетку верхней клетке за ~ 5 s.
    2. Осторожно потяните хвост назад; Это обычно приводит к двигаться вперед, держа на сетке с его передние конечности животного. Другой подход к коже закрыть, шею и уши.
    3. Понять дряблая кожа между плеч и шеи с большим и указательным пальцами. Важно получить хорошее владение кожи, как это поможет предотвратить превращение свою голову укусить мыши.
    4. Grab кожи на спине с оставшиеся пальцы и удерживайте ее, нажимая против руки. Крепко удерживайте без препятствовать дыханию, крови поток, или повреждения костей, мышц или кожи. Поверните руку, чтобы разоблачить живот мыши, поддерживая в задней части мыши в руке.
    5. Свободной рукой аккуратно отодвинуть кожи вокруг пениса без принуждения. В препуция разделения коже препуция слайды назад подвергая головки полового члена (рис. 2A, стрелка, указывающая препуция разделение). Запись, наличие или отсутствие препуция разделения.
    6. Весят мыши, аккуратно поставив в 500-1000 мл стакан из шага 1.2.2 и запишите вес.
    7. Вновь мыши в клетке жилищного строительства путем проведения стакан 0-2 см над полом клетке и медленно перевернуться стакан, позволяя мыши выйти на свой собственный. Очистить стакан с водой и мягким моющим средством и высушить его, прежде чем вернуть масштаб и Довешивание масштаба.
  6. Определение открытия влагалища у самок мышей.
    1. Поместите ватный шарик, стакан и бутылка стерильной воды в рабочей области (шаг 1.2). Налейте в стакан воды. Увлажняют ватный шарик стерильной водой и поместите его рядом с верхней клетке от шаг 1.2.1.
    2. Место клетки мыши в рабочей области (шаг 1.2) и передачи мыши от его дома клетке клетка верхней (шаг 1.2.1), удерживая его у основания хвоста. Осторожно потяните назад хвост, чтобы стимулировать движение вперед мыши.
    3. Поднимите хвост поддерживая бедра с бесплатным пальцами. Разрешить гомотерия поддерживать контакты с верхней части клетки. Если указатель мыши перемещается слишком много, держите его в руке, как описано в шагах 1.5.1-1.5.4.
    4. Аккуратно очистите вульвы с увлажненной ватный шарик воды из шага 1.6.1. Для каждой мыши используйте чистые увлажненные ватным тампоном. Чтобы определить влагалище, изучать вульвы и определить, открыта ли полностью во влагалище (рис. 2A, Женский вагинальный открытия).
    5. Запись, если произошла вагинальный открытия. Весят мыши и вернуть его домой клетку, как описано в шагах 1.5.6-1.5.7.
  7. Первая течка показатель первой овуляции.
    1. Поместите стакан с стерильной водой, обозначенные стеклянное скольжение и 200 мкл пипетки с чистой кончиком в рабочей области (шаг 1.2).
    2. Держите девушки, как описано в шаге 1.6.2-1.6.3. Поместите наконечник пипетки, содержащие ~ 50 мкл стерильной воды на влагалище.
    3. Осторожно промойте клетки от стенки влагалища, вводя и поглощая ~ 50 мкл воды 2 - 4 раза. Мазок содержание от кончика пипетки на обозначенные стекло микроскопа.
    4. Тщательно соблюдать клеточной морфологии на brightfield микроскопа с помощью 10 X или 20 X цели или пусть airdry мазок для ~ 1 час и затем изображение с 0,1% раствора метиленового синего (растворяют в ddH2O) (рис. 2B). Чтобы изображение, окунуть сушеные слайд в 0,1% раствора метиленового синего для ~ 30 s. Пусть слайд воздух сухой за 1 час.
    5. Наблюдать за слайды из шага 1.7.4 на микроскопе яркий поле 10 X или 20 X. Установите на стадии эстрального цикла (рис. 2B)20 , наблюдая морфологии клеток, который позволяет различать четыре отдельных этапа эстрального цикла (рис. 2B).
      Примечание: Metestrus характеризуется сочетанием ороговевшем Плоскоклеточный эпителиальных клеток и лейкоциты, диэструса, лейкоциты, proestrus смесью лейкоциты и ядерных эпителиальных клеток и эструса в ороговевшем эпителиальных клеток (рис. 2B) 20.
    6. Запишите вес тела и вернуть его домой клетку мыши, как описано в шагах 1.5.6-1.5.7. Вагинальных мазков прекращаются в день, когда мышь имеет своей первой течки (Рисунок 2Б).

2. желательно, разведение комнатных условий

  1. Убедитесь, что номер селекции имеет температуру ~ 20-24 ° C, с 55 ± 10% влажности и однородной обслуживание свет интенсивности ~ 300-400 люкс около 1 м над полом21. Эта интенсивность света позволяет желательно интенсивности света середину клетки 25-80 люкс. Для проверки интенсивности света, используйте свет метр.
  2. Использование автоматизированной системы для управления освещение в комнате селекции для обеспечения надлежащих сроков освещения на протяжении всего эксперимента. Оптимальные условия день длина для оценки фертильности в диапазоне грызунов от 12 h день (12 ч света и тьмы 12 h, LD12:12), «лето как» условия с 14 h света и 10 h тьмы (LD14:10)21.
  3. Подготовьте размножения клеток.
    1. Подготовьте клетку чистой мыши с крышкой, вода, еда, постельные принадлежности и гнездящихся на разводить пары.
    2. Заполнить клетки карты с всю необходимую информацию, включая пол, Дата рождения, штамм мыши и дату когда сопрягать вверх.

3. рождаемость исследование

  1. Идентифицировать животных, которые будут использоваться для изучения плодовитости. Убедитесь, что животные являются половозрелыми (шаг 1). Обычно используется возрастной диапазон создать исследование фертильности у мышей-10-16 недель возраста, где было завершено полового созревания в самых экспериментальных условиях.
  2. На чистый стол место разведения Кейдж, подготовленный в шаге 2.3.
  3. Поймать и удерживайте кнопку мыши.
    1. Медленно ввести перчатке в отсек мыши. Оставьте руки в клетке для короткого периода времени (~ 5-30 s), позволяя мышей адаптироваться к запах Перчатки и рук. Избегайте суеты и порывистых движений.
    2. Опустите чашевидный стороны близко к нижней части клетки и медленно подход к мышей. Они будут бежать. Когда они бегут за руку, поймать хвост одной мыши между большим и указательным пальцем.
    3. Поднимите мыши хвост для 2-3 s. Если мыши необходимо проходить дольше, держаться на хвост и поместите указатель мыши в чашевидный стороны, поддержание Держись хвост.
  4. Передача 1 кобель и впоследствии 1 женщин в клетку разведения, держа их за хвост (шаг 3.3). Убедитесь, что женщины находятся в стадии же эстрального при настройке анализа фертильности. Определите стадии эстрального самок, выполняя вагинальный мазок, как описано в шаге 1.7.
  5. Закройте клетке и убедитесь, что мышей имеют продовольствия, воды и раскроя материала. Прикрепите держатель карты клетке с картой клетки к клетке.
  6. Место размножения клетку на корпус стойки. Отпуск разведения Кейдж как спокойно можно на весь срок действия исследования плодородия. Провести исследование фертильности за 30 дней. Для каждой пары размножения вести подробный учет и 1 наступления даты сопрягать вверх, 2) дату рождения помета и 3 количество детенышей родился, включая погибших и живых детенышей. Выполните проверку мусор ежедневно на протяжении всего исследования.
  7. Продлить плодородия исследование для дополнительных 30-60 дней, если нет или слабое влияние на фертильность устанавливается в шаге 3.6.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представленные результаты являются от двух разных трансгенные мыши модели, где был удален фактор транскрипции в вентральной передней гомеобокс 1 (Vax1) во всем организме на один аллель, здесь называют гетерозиготных мышей (HET)13, или Vax1 условно был удален в течение GnRH нейронов22, здесь называют условным KO (СКО). До создания в исследовании фертильности, важно для подтверждения начала полового созревания у всех мышей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Общее самочувствие мышей имеет решающее значение для успешного плодородия пробирного21. При выполнении анализа фертильности, важно не физически проверить на мышей каждый день, как это может вызвать стресс. Далее Избегайте частых Кейдж изменения, как они также напряженный. Идеально клетка изменений будет проводиться не более чем 1 - 2 раза в неделю. Воздействия света на темной этапе негативно влияет на разводить в ночной грызунов. Не включайте свет в комнате разведения во время темных часов. Если в...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Автор не имеет ничего, чтобы раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Я благодарю авторов первоначальной работы, которая является основой этого издания. Благодаря Aitor Aguirre, Женевьев э. Райан и Эрика л Schoeller за помощь в подготовке рукописи. Благодаря ли Джессика Сора и Остин Чин для оказания технической помощи с рукописью. H.M.H. была поддержана Юнис Кеннеди Шрайвер национального института здоровья ребенка и развития человеческого потенциала национальных институтов здоровья под награду номер R00HD084759.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Стерильные ватные шарикиFisher22456885
Защита поверхностиFisher1420637
ЭкспонометрVWR21800-014
Метиленовый синий Sigma-AldrichM9140
Предметные стекла для микроскопаGenesee Scientific29-101
Optimouse Стеллаж с клеткамиAnimalCare systemsC89100
Корзина для бутылок с водой СистемыAnimalCare C61011
Фильтрованные крышки клетокСистемы AnimalCareC78210
Optimice Стандартная кормушкаСистемы AnimalCare C40100SG
Держатель карточки клеткиСистемы AnimalCareC43251
Карточки клеткиСистемы AnimalCareM52010
Бутылочка в сбореСистемы AnimalCare
Кровать R'Nest NestingThe AndersonsBRN4WSR
1/8" Подстилка из кукурузных початков Andersons8B
Стандартная мышьTeklad7904 (7004)
МасштабVWR10205-004
Полипропиленовый стаканFisher14-955-111F
C79122P

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schneider, J. E. Energy balance and reproduction. Physiology and Behavior. 81 (2), 289-317 (2004).
  2. Walton, J. C., Weil, Z. M., Nelson, R. J. Influence of photoperiod on hormones, behavior, and immune function. Frontiers Neuroendocrinology. 32 (3), 303-319 (2012).
  3. Hoffmann, H. M., Mellon, P. L. A small population of hypothalamic neurons govern fertility: the critical role of VAX1 in GnRH neuron development and fertility maintenance. Neuroscience communications. 2, (2016).
  4. Kauffman, A. S. Sexual differentiation and the Kiss1 system: Hormonal and developmental considerations. Peptides. , (2009).
  5. Bronson, F. H., Dagg, C. P., Snell, G. D. Reproduction. , Dover Publications, Inc. New York. (1966).
  6. Chehab, F. F., Mounzih, K., Lu, R., Lim, M. E. Early onset of reproductive function in normal female mice treated with leptin. Science. , (1997).
  7. Yoshimura, S., Yamaguchi, H., Konno, K., Ohsawa, N., Noguchi, S., Chisaka, A. Observation of Preputial Separation is a Useful Tool for Evaluating Endocrine Active Chemicals. J Toxicologic Pathology. 18, 141-157 (2005).
  8. Ahima, R. S., Dushay, J., Flier, S. N., Prabakaran, D., Flier, J. S. Leptin accelerates the onset of puberty in normal female mice. Journal of Clinical Investigation. 99 (3), 391-395 (1997).
  9. Bohlen, T. M., et al. A short-day photoperiod delays the timing of puberty in female mice via changes in the kisspeptin system. Frontiers in Endocrinology. 9 (FEB), 1-9 (2018).
  10. Shahab, M., Mastronardi, C., Seminara, S. B., Crowley, W. F., Ojeda, S. R., Plant, T. M. Increased hypothalamic GPR54 signaling: A potential mechanism for initiation of puberty in primates. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2005).
  11. Hoffmann, H. M., Mellon, P. L. A small population of hypothalamic neurons govern fertility: the critical role of VAX1 in GnRH neuron development and fertility maintenance. Neuroscience communications. 2, 5-9 (2016).
  12. Navarro, V. M., et al. Role of Neurokinin B in the Control of Female Puberty and Its Modulation by Metabolic Status. Journal of Neuroscience. 32 (7), 2388-2397 (2012).
  13. Hoffmann, H. M., Tamrazian, A., Xie, H., Pérez-Millán, M. I., Kauffman, A. S., Mellon, P. L. Heterozygous deletion of ventral anterior homeobox (Vax1) causes subfertility in mice. Endocrinology. 155 (10), 4043-4053 (2014).
  14. Kauffman, A. S., et al. The Kisspeptin Receptor GPR54 Is Required for Sexual Differentiation of the Brain and Behavior. Journal of Neuroscience. 27 (33), 8826-8835 (2007).
  15. Teles, M. G., et al. Brief report: A GPR54-activating mutation in a patient with central precocious puberty. New England Journal of Medicine. , (2008).
  16. Korenbrot, C. C., Huhtaniemi, I. T., Weiner, R. I. Preputial separation as an external sign of pubertal development in the male rat. Biology of reproduction. , (1977).
  17. Gaytan, F., et al. Development and validation of a method for precise dating of female puberty in laboratory rodents: The puberty ovarian maturation score (Pub-Score). Scientific Reports. 7 (March), 1-11 (2017).
  18. Caligioni, C. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. , 1-11 (2010).
  19. Mayer, C., et al. Timing and completion of puberty in female mice depend on estrogen receptor -signaling in kisspeptin neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (52), 22693-22698 (2010).
  20. McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. Journal of Visualized Experiments. (67), 4-9 (2012).
  21. Hedrich, H. The Laboratory Mouse. , Academic Press. (2012).
  22. Hoffmann, H. M., Trang, C., Gong, P., Kimura, I., Pandolfi, E. C., Mellon, P. L. Deletion of Vax1 from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Abolishes GnRH Expression and Leads to Hypogonadism and Infertility. Journal of Neuroscience. 36 (12), 3506-3518 (2016).
  23. Sloboda, D. M., Howie, G. J., Pleasants, A., Gluckman, P. D., Vickers, M. H. Pre- and postnatal nutritional histories influence reproductive maturation and ovarian function in the rat. PLoS ONE. , (2009).
  24. Manual, R. Breeding Strategies for Maintaining Colonies of Laboratory Mice. Management. , (2007).
  25. Kennedy, G. C., Mitra, J. Body weight and food intake as initiating factors for puberty in the rat. The Journal of Physiology. , (1963).
  26. Sisk, C. L., Foster, D. L. The neural basis of puberty and adolescence. Nature Neuroscience. 7 (10), 1040-1047 (2004).
  27. Nelson, J. F., Karelus, K., Felicio, L. S., Johnson, T. E. Genetic influences on the timing of puberty in mice. Biology of reproduction. , (1990).
  28. Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biology of reproduction. , (1982).
  29. Falconer, D. S. Weight and age at puberty in female and male mice of strains selected for large and small body size. Genetical Research. , (1984).
  30. Rodriguez, I., Araki, K., Khatib, K., Martinou, J. C., Vassalli, P. Mouse vaginal opening is an apoptosis-dependent process which can be prevented by the overexpression of Bcl2. Developmental Biology. , (1997).
  31. Lomniczi, A., Wright, H., Ojeda, S. R. Epigenetic regulation of female puberty. Frontiers in Neuroendocrinology. 36, 90-107 (2015).
  32. Selmanoff, M. K., Goldman, B. D., Ginsburg, B. E. Developmental changes in serum luteinizing hormone, follicle stimulating hormone and androgen levels in males of two inbred mouse strains. Endocrinology. 100 (1), 122-127 (1977).
  33. Larder, R., Clark, D. D., Miller, N. L. G., Mellon, P. L. Hypothalamic Dysregulation and Infertility in Mice Lacking the Homeodomain Protein Six6. Journal of Neuroscience. 31 (2), 426-438 (2011).
  34. Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. Milk yield and composition in mice: Effects of litter size and lactation number. Comparative Biochemistry and Physiology -- Part A: Physiology. 84 (1), 127-133 (1986).
  35. Chahoud, I., Paumgartten, F. J. R. Influence of litter size on the postnatal growth of rat pups: is there a rationale for litter-size standardization in toxicity studies. Environmental research. 109 (8), 1021-1027 (2009).
  36. Pandolfi, E. C., Hoffmann, H. M., Schoeller, E. L., Gorman, M. R., Mellon, P. L. Haploinsufficiency of SIX3 Abolishes Male Reproductive Behavior Through Disrupted Olfactory Development, and Impairs Female Fertility Through Disrupted GnRH Neuron Migration. Molecular Neurobiology. , (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи