Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Изображений взаимодействия клеток в слизистой оболочки трахеи во время инфекции вируса гриппа с помощью двух Фотон прижизненной микроскопии

7.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58355

⸱

17 августа 2018 г.

 ,  ,  ,  , 
1Faculty of Biomedical Sciences, Institute for Research in Biomedicine, Università della Svizzera italiana (USI), 2Graduate School of Cellular and Molecular Sciences, Faculty of Medicine, University of Bern, 3Institute of Computational Science, Università della Svizzera italiana (USI)

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этом исследовании мы представляем протокол для анализа двух Фотон прижизненной изображений и ячеек взаимодействия в мышиных слизистой оболочки трахеи после заражения вирусом гриппа. Этот протокол будет актуален для исследователей, изучения динамики иммунных клеток во время инфекции дыхательных путей.

Аннотация

Анализ ячеек или ячеек возбудитель взаимодействия в естественных условиях является важным инструментом для понимания динамики иммунной реакции на инфекции. Двух Фотон прижизненной микроскопии (2P-IVM) позволяет наблюдения взаимодействий клеток в глубоких тканях живых животных, при сведении к минимуму Фотообесцвечивание, созданные во время захвата изображений. На сегодняшний день, были описаны различные модели для 2P-IVM лимфоидных и не лимфоидных органов. Однако томография органов дыхания остается проблемой из-за движения, связанных с циклом дыхания животных.

Здесь мы описываем протокол для визуализации в vivo иммунных клеток взаимодействий в трахею мышей, инфицированных вирусом гриппа, используя 2 P-КБПБ. С этой целью мы разработали пользовательские изображений платформы, которая включала хирургического воздействия и интубация трахеи, после приобретения динамических изображений нейтрофилов и дендритных клеток (DC) в эпителии слизистой оболочки. Кроме того мы подробно шаги, необходимые для выполнения гриппа интраназального инфекции и потока гранулярных анализ иммунокомпетентных клеток в трахею. Наконец мы проанализировали нейтрофилов и DC моторики, а также их взаимодействия в ходе фильма. Этот протокол позволяет для создания стабильных и яркие изображения 4D необходимое для оценки взаимодействия ячеек в трахею.

Введение

Двух Фотон прижизненной микроскопии (2P-IVM) является эффективным методом для реального времени изображений к ячейке взаимодействий, как они происходят в их природной среды1. Одним из главных преимуществ этого метода является, что она позволяет изучение клеточных процессов на большей глубине образца (500 мкм до 1 мм) по сравнению с другими традиционными изображений методы2. В то же время использование двух низкой энергии фотонов, порожденных два фотона лазерного минимизирует фото повреждение тканей, обычно связанных с процессом приобретения изображения2. В течение последнего десятилетия 2P-IVM был применен для изучения различных типов взаимодействий ячеек в нескольких дисциплинах3,4,5. Эти исследования были особенно важны для расследования иммунные клетки, которые характеризуются их высокая динамичность и формирование известных контактов после сигналов другие клетки и окружающей среды. 2P-IVM также применяется для изучения взаимодействия между возбудителя и принимающих6. Действительно было ранее показано, что некоторые патогены могут изменить тип и продолжительность контактов между иммунных клеток, препятствуя, в результате иммунного ответа7.

На слизистую оболочку дыхательных путей это первый сайт, в котором иммунный ответ против бортовых патогенов сгенерированное8. Таким образом в естественных условиях анализ взаимодействий возбудителя хост в этой ткани очень важно понять начало механизмов обороны хост во время инфекции. Однако 2P-IVM дыхательных путей является сложной задачей, главным образом благодаря артефакты, производимые цикл дыхания животного, которое подрывает процесс приобретения изображений. Недавно были описаны различные хирургические модели для визуализации мышиных трахеи9,10,11,легких и12 13,14,15, 16. Трахеи 2P-IVM модели представляют отличную set-up визуализировать на начальном этапе иммунной реакции в верхних дыхательных путях, в то время как модели 2P-IVM легких альвеолы больше подходят для изучения поздней фазе инфекции. Модели развитых легких представляют ограничения, связанные с присутствием альвеол заполненными воздухом, которые ограничивают оптических проникновения лазерных и сделать недоступными для в vivo imaging17 слизистая слой внутрилегочного airways . И наоборот структура трахеи, образованное непрерывного эпителия, облегчает получение изображения.

Здесь мы представляем протокол, который содержит подробное описание шагов, необходимых для выполнения инфекции гриппа, хирургической подготовки животных, а также 2P-IVM трахеи. Кроме того мы описывают конкретные экспериментальные установки для визуализации нейтрофилов и дендритных клеток (DC), два типа иммунных клеток, которые играют важную роль в качестве посредников механизм обороны против гриппа вирус18,19 . Наконец мы описываем процедуры для анализа взаимодействий нейтрофилов DC. Было показано, что эти контакты модулировать DC активации и, впоследствии, чтобы повлиять на иммунный ответ против патогенов20.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Всех животных процедуры с участием мышей были исполнены в соответствии с швейцарским Федеральным управлением ветеринарии руководства и животных протоколы были одобрены властями местным ветеринаром.

1. гриппа инфекция CD11c-рекламы ЯФП мышей

  1. Биобезопасности
    Примечание: Мыши адаптированы штамм гриппа H1N1 Рико/8/34 A/Puerto (PR8) вырос в оплодотворенных яиц, очищенная и титруют как описано21. Все действия, связанные с зараженных животных или биологических образцов были проведены под биобезопасности кабинета по биобезопасности уровня (BSL) 2 условий.
    1. Очистите биобезопасности кабинет с 70% этанола раствор до и после процедуры заражения.
    2. Отменить все отходы производства во время этой процедуры, после надлежащего, кто биобезопасности руководящие принципы (http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/Biosafety7.pdf). Отбросить загрязненных жидкостей в пластиковые мешки заполнены с 70% этанола раствор или медицинские дезинфицирующие и твердых отходов в автоклавируемый бункеров.
  2. Интраназального инфекции гриппа
    ПРИМЕЧАНИЕ: B6. В этом исследовании были использованы CG-Tg(Itgax-Venus) 1Mnz/J (CD11c-рекламы ЯФП)22 на фоне C57BL/6J. Мышей были сохранены в конкретном объекте возбудителя бесплатно в Институте исследований в биомедицине.
    1. Место максимум 5 возраста и пола соответствием (6-8 недельных) CD11c-рекламы ЯФП мышей в клетке. Подождите, по крайней мере два дня для мышей адаптационного жилищных условий перед процедурой инфекции.
    2. Размораживания PR8 фондовых и подготовить соответствующие разрежения с помощью холодной 1 x Дульбекко фосфатный буфер изменяться без хлорида кальция и магния хлорид (PBS) для получения конечной концентрации 200 единиц формирования зубного налета (ОРП) в 30 мкл. Держите вирус разбавления на льду в течение всей процедуры.
      Примечание: титрование каждой партии вируса гриппа перед его использованием рекомендуется обеспечить точное инфекции доза.
    3. Вводить дозу кетамина (100 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг) внутрибрюшинно (и.п.) с помощью 26 G иглы 1 мл шприца.
    4. Подождите, пока мышь полностью наркотизированных (полная потеря рефлекс вывод восстанавливающих и педали). Глубокий наркоз необходима для оптимального инфекции, так как не полностью наркотизированных мышей будут глотать или высылать вирус посевным материалом, приводит к изменениям в дозе инфекции.
    5. Место наркотизированных мышь в лежачем положении. Сбор 15 мкл вирус посевным материалом. Поместите наконечник пипетки недалеко от мыши левую ноздрю и отказаться от вирусных посевным материалом по капле. Как капли должны быть вдыхании, не Пипетка их непосредственно внутри полости носа.
    6. Подождите 2-5 мин и поместите наконечник пипетки, содержащий оставшиеся 15 мкл посевным материалом вируса в правую ноздрю.
      Примечание: Чтобы избежать удушья, обойтись малый размер капель в приблизительно 20 s интервалы.
    7. Проверьте, что мышь правильно дышать и поместите его в клетке в боковой пролежни. Монитор мыши дыхание и анестезии восстановления (примерно 60 мин после индукции).
      Примечание: Это можно заразить более чем 1 мыши в то же время. В этом случае администрирования Вирусная посевным материалом в левую ноздрю всех мышей в последовательности, подождите 2-5 мин и затем управлять вируса в правую ноздрю. Чтобы избежать изменчивость между людьми, заразить не более чем 3 мышей в то же время.
    8. Мониторинг состояния и вес потеря здоровья животных ежедневно.
    9. Усыпить мышей согласно гуманного конечной точки определяется руководящими принципами органа. Эвтаназия метод должен быть одобрен властями экспериментов на животных и должны уважать местные этические правила. После двух Фотон экспериментов усыпить мышей администрацией передозировки кетамина/Ксилазина следуют шейки матки дислокации. В всех других экспериментов используйте CO2 ингаляции в качестве метода для эвтаназии.
      Примечание: Чтобы измерить вирусного титры зараженных трахеи, 50% пробирного инфекционный дозы (TCID50) культуры ткани или реального времени полимеразной цепной реакции (RT-PCR) анализа могут быть выполнены как ранее описанных23.
  3. Оценка нейтрофилов вербовки в трахею, проточной цитометрии
    Примечание: Эта часть протокола является необязательным. Она направлена на оценку нейтрофилов вербовки в слизистой трахеи, после инфекции гриппа.
    1. Усыпить мышей, инфицированных и неинфицированных управления на 3 день после инфекции (ПЗ), CO2 ингаляции.
      Примечание: Во избежание повреждения трахеи, Избегайте шейки матки дислокации чтобы усыпить животных. Кроме того желательно, чтобы избежать загрязнения от крови нейтрофилы перфузии Усыпленных мышей.
    2. Спрей мыши шеи с 70% этанола раствор и выполнять разрез кожи, используя Ножницы хирургические от груди к подбородку.
    3. Отдельные слюнных желез, с помощью щипцов и разоблачить трахеи.
    4. Рассечь мышцы вокруг трахеи, с помощью щипцов и ножницы.
      Примечание: Этот шаг должен выполняться тщательно поскольку трахеи может быть легко поврежден во время процедуры.
    5. Держите трахеи с щипцами и аккуратно отсоединить пищевода, рассечение.
    6. Проведение в внутригрудного части трахеи с щипцами, надрезать в начале бронхиального дерева. Затем отсоедините трахеи от гортани и тщательно удалить любые мускулатура слева.
    7. Место орган в 1,5 мл тубы RPMI 1640 + HEPES среднего (RPMI) на льду.
    8. Подготовьте смесь ферментов для переваривания трахеи, содержащий 0.26 единиц/мл коллагеназы (I и II) и 0,2 мг/мл DNase I в RPMI.
    9. Место расчлененных трахеи в 6-ну пластины, содержащие 1 мл смеси ферментов.
    10. Орган мелко нарежьте с помощью щипцов и ножницы. Держите пластины на льду во время этого шага.
    11. Инкубируйте при 37 ° C на 45 мин. В это время встряхните пластину каждые 15 мин.
    12. Остановите Пищеварение энзима, добавив 1 мл СУИМ Отмывающий буфер (2 мм ЭДТА и 2% тепло инактивированная фильтр стерилизации плода бычьим сывороточным (ФБС)) в PBS.
    13. Ресуспензируйте решение с 1 мл пипетку, чтобы помочь отделить частично непереваренных кусочков ткани.
    14. Решение передать другой хорошо, передавая содержимое через стрейнер 40 мкм. Затем аккуратно разбить оставшиеся части органа, оказавшихся на вершине сетчатый фильтр, используя поршень шприца 2 мл.
      Примечание: Smashing частично непереваренных части трахеи через ситечко является важным шагом для получения оптимальное количество клеток во время анализа потока гранулярных.
    15. Мыть хорошо и ситечко с СУИМ, промывание буфер и передачи, подвеска в 5 мл трубке хранится на льду.
    16. Центрифуга для трубы на 166 x g 5 мин при 4 ° C. Отменить супернатант и Ресуспензируйте клетки в 100 мкл СУИМ Отмывающий буфер.
    17. Продолжите с поверхности Пятнать антитела для проточной цитометрии. Вкратце блокировать рецепторы Fc изолированных клеток, используя антитело против CD16/32, следуют поверхности окраски. Чтобы правильно определить нейтрофилов, панель цитометрия потоков должен содержать следующие антитела: αLy6G, αCD11b, αCD45, а также жизнеспособность красителя исключить мертвые клетки.
    18. Запустите все содержимое образцов на проточный цитометр и анализировать данные.
      1. Чтобы получить оптимальное количество иммунных клеток, запустите одну ячейку подвеска со скоростью не выше, чем 3000 событий/сек. Это позволит сократить количество событий, исключены во время приобретения. Используя этот протокол, можно получить 1 до 2 миллионов клеток в трахею.

2. изоляция и инъекции нейтрофилов

Примечание: В этой процедуре, B6.129 (ICR)-Tg (CAG-ECFP) CK6Nagy/J мышей (CK6-ECFP) были используется24. Эти животные Экспресс КФП во всех типах клеток под человека β-актина промоутер. Кроме того это также можно использовать для изоляции клеток и выведение их согласно протоколу, описанный в шаге 2.6 мышей C57BL/6J. Очистка и манипуляции нейтрофилов может увеличить их статус активации, потенциально изменяя их миграционных и функциональных свойств.

  1. Усыпить животных вдыханием CO2 .
  2. Удаление бедра и tibias и Осторожно очищайте их с помощью щипцов.
  3. Вырезать эпифизов костей и промойте костного мозга с помощью 1 мл шприц, наполненный стерильного холодного PBS, в 50 мл трубки хранится на льду.
  4. Ресуспензируйте клетки с 18 G иглы и фильтрация суспензию клеток с помощью стрейнер 40 мкм. Один раз Помойте с PBS на 110 x g 5 минут при температуре 4 ° C и Ресуспензируйте клетки в 2 мл холодного PBS.
  5. Разбавляют 100% Percoll 9:1 в 10 x PBS и подготовить градиента решения percoll 72%, 64% и 52%, с использованием ПБС. Тщательно слой 2 мл каждого из трех градиентов в 15 мл, начиная от наиболее сосредоточены один.
    1. Добавьте тщательно 2 мл суспензии клеток костного мозга на вершине градиентов и центрифуги на 1100 x г за 30 мин при комнатной температуре (RT) без разгона и торможения.
  6. Осторожно удалите группу на стыке между 64% и 72% и мыть его один раз в 200 x g 5 минут при температуре 4 ° C с холодной PBS. Ресуспензируйте клеток в объеме 100 мкл PBS и держать их на льду. Чистоту нейтрофилы, как ожидается, будет выше, чем 90%.
  7. При необходимости лейбл нейтрофилов с комплектом распространения клеток, используя протокол изготовителя. Добавить краситель суспензию клеток до конечной концентрации 10 мкм в объеме 1 мл, инкубации при 37 ° C за 30 мин и мыть (166 x g, 5 мин).
  8. Оценка концентрации клеток с помощью Горяева и вводить внутривенно 5 х 106 клеток в максимальный объем 100 мкл в ранее зараженных мышей CD11c-рекламы ЯФП+ , с помощью шприца иглы 1 мл 26 G, 12 h до изображений.

3. Подготовка мышь для изображений

  1. Анестезия
    1. Анестезировать зараженных мышей CD11c-рекламы ЯФП+ на 3 день п.и. Согласно шаг 1.2.3.
    2. После того, как мышь глубоко под наркозом, подготовьте катетер для анестезии повторно дозирования.
      1. Удаление иглой 30 G из шприца с помощью щипцов.
      2. Вставьте иглу в 20 см кусок трубки медицинской силиконовой PE-10.
      3. Вставьте шприц иглой 30 G заполнены смесью кетамин/ксилазина на другой стороне трубки.
      4. Удалите воздух внутри трубки.
    3. Подготовьте катетер 20 G подключен к трубе из insufflating машины кислорода для поддержания автоматической вентиляции (рис. 1Aя). Установите его на соотношении дыхание 130 ударов в минуту (b.p.m.) с приливной объемом 0,2 мл, с использованием 100% кислорода газоснабжения.
  2. Подготовить мышь для хирургии
    1. Держите мышь на конкретные индивидуальные хирургические доску (рис. 1Aii-iii) над табличкой с подогревом или лежаком с подогревом хирургический набор при 37 ° C для все время операции.
    2. Бритье волос из шеи мыши, с помощью электрической бритвой и депиляционный крем (рис. 1Bi).
    3. Поместите курсор мыши над пластиковые мыши позиционные (рис. 1Aii-a), сохраняя голова животного вне позиционные (рис. 1Bii) для создания угол, облегчает интубации трахеи.
    4. Прикрепите Передние конечности, лапы и хвост с хирургическая лента, мочим мыши глаза с витамином А обогащенная гель и продезинфицируйте мыши шеи (рис. 1Bii).
  3. Хирургия
    1. Подготовьте должным образом газобетона элементов, а именно, ножницы, микрохирургическая ножницы и пинцет.
    2. Выполните небольшой надрез на долго медиальной оси шеи, примерно 1 см длиной, в средней зоне между верхней части груди и линией, проходящей через точку нижней челюсти (рис. 1Biii).
    3. Переместить с боков патчи кожи и слюнных желез и визуализировать трахеи, охватываемых мышц. Затем вскрыть трахеи мышцы, тщательно с использованием щипцов (iiiрис. 1B).
    4. Интубировать мыши с катетером и начала искусственной вентиляции (рис. 1Biv).
      Примечание: Катетер состоит из внешней пластиковые части, которая защищает слизистую оболочку трахеи и внутренняя железа иглы. Присутствие иглы представляет идеальное решение для расширения и стабилизировать трахеи и регулировать ее экспозиции. Искусственная вентиляция через катетер будет гарантировать правильное дыхание мыши.
    5. Немедленно Начните искусственной вентиляции для мыши Монитор дыхания.
    6. Исправьте высоту катетера и ориентации с помощью хирургического крюк (рис. 1Bv) подключены к конкретным стержень на плате хирургические (ii-bрис. 1A). Разоблачить трахеи на той же высоте подбородка.
    7. Окружить трахеи с вазелином и покрыть ее с несколькими каплями предварительно нагретой PBS для обеспечения надлежащей гидратации для органа (viрис. 1B).
    8. Установите coverslip на вершине подготовки. Для этого шага клей coverslip на металлический держатель (рис. 1Bvii), который будет привинчен к XYZ переводчик (рис. 1Aii-c). Отрегулируйте XYZ переводчик поставить coverslip на вершине хирургической подготовки.
    9. Поместить катетер для администрирования анестезии внутрибрюшинно (viiiрис. 1B).
    10. Придать 50% первоначальной дозы кетамина/Ксилазина смеси каждые 30 мин.
      Примечание: Повторно дозирования от 50% до 25% от первоначального кетамин/Ксилазина смесь является безопасной и действительный альтернативных25. Однако поскольку этот протокол является терминал и строгой иммобилизации животного во время всей процедуры не требуется, используйте более высоких дозах для поддержания плоскости глубоко хирургического анестезии.

4. в естественных условиях покадровой изображений

Примечание: Получение изображения была выполнена с помощью микроскопа вертикально двух фотонов, оснащен двумя лазерами сапфировый, контролем температуры инкубации камеры и 25 X / NA 1.1 воды цель погружения. Photomultipliers (ПЛТ) используется для захвата изображений были гибрид детекторов или высокая чувствительность Гаасп.

  1. Место хирургические доска с наркотизированных мыши внутри камеры инкубации микроскоп (предварительного подогрева при температуре 37-38 ° C) и добавить каплю воды на coverslip.
  2. Центр и найти фокус на ткани трахеи.
  3. Установите частоту сканирования до 800 Гц, с 520 x 520 пикселей, поле зрения 440 x 440 мкм2 и линии средняя 1.
    1. Мотив сапфировый лазер 830 нм для возбуждения генерации второй гармоники (SHG) из коллагена, с ориентировочной мощности источника 150 МВт. Настройте второй сапфировый лазер на 920 Нм с 94 МВт на источник, чтобы пробудить CFP и рекламы ЯФП.
    2. Создание 3D и timelapse приобретение режиме с одновременным возбуждения
      Примечание: Держите лазерной полномочий как низкий, как можно свести к минимуму Фотообесцвечивание и Фототоксичность.
  4. Запись флуоресценции, с использованием двух каналов в режиме, не descanned, с мастер дихроичное зеркало на 560 Нм. В настройки, используемые в настоящем Протоколе, второй дихроичное зеркало разделить сигнал в 495 нм для разделения канала 1 (фильтр 475/50 выбросов) из канала 2 (выбросов фильтр 525/50) (рис. 2A). Эта конфигурация собирает SHG свет из коллагена в первом канале, в то время как CFP выбросов собирается в обоих каналах 1 и 2 и рекламы ЯФП собирается только в канале 2.
  5. Определите диапазон 50 мкм вдоль оси Z с размером шаг 3 мкм (voxel размер 0,86 мкм x 3 мкм). Запись фото каждые 30 s для общей продолжительностью 30 минут.
  6. При желании приобрести несколько областей. Перед запуском более поглощений, проверьте жизненно важные признаки и reinject анестезии через катетер, если это необходимо (см. шаг 3.3.10).
  7. В конце процесса создания образов усыпить мыши через кетамин/Ксилазина передозировка следуют шейки матки дислокации.

5. изображения обработки и количественный анализ подвижность нейтрофилов DC и взаимодействия

Примечание: В настоящем Протоколе, специализированное программное обеспечение обработки изображений использовался для анализа данных микроскопии.

  1. После завершения загрузки изображений 4D передачи файлов (данные и метаданные) на рабочей станции с достаточными вычислительными ресурсами (предложил минимальные системные требования: 32 ГБ ОЗУ, быстро solid государство-диски, недавно ЦП, выделенные GPU, основанные на массивно параллельная архитектура).
  2. Откройте файлы изображений программного обеспечения.
  3. Воспроизведение видео и убедитесь, что клетки интерес хорошо видны и что артефакты изображения отсутствуют.
    Примечание: с этой целью, убедитесь, что оба движения образца и вариации яркости достаточно ограничены. Действительно они представляют собой проблемы для автоматического анализа26. Если движение образца между соседними кадрами является чрезмерным, примените метод коррекции дрейф, например с помощью ГСП канала как фиксированной ссылка. Это позволяет лучше оценивать движение клеток, а не движение образца. Кроме того при наличии яркий фон или мусора, подрежьте реконструированный поверхностей, использование тома в качестве параметра выбора.
  4. Создание конкретного канала сотрудничества локализации на СЛП+ клетки, для того чтобы отделить сигнала между CFP и коллагена (SHG). С этой целью обозначить стробирования многоугольник, (Рисунок 2Bя), который выбирает только вокселей, имея положительный интенсивности, как в зелёном канале, так и в канале синего.
    Примечание: Эта процедура может меняться в соответствии набор фильтров микроскопа и окрашивания клеток. Это может быть достигнуто путем выбора только вокселей с достаточной интенсивностью в зеленый и синий каналы. Среди доступных инструментов функцию «coloc» может использоваться автоматически вычислить colocalization канал, основанный на интенсивности порога. Кроме того методы, основанные на машинного обучения может использоваться для этого шага с наблюдением экспертов27.
  5. Обнаруживать и отслеживать CFP+ клетки, с помощью автоматического восстановления поверхности и отслеживания (поверхности) по каналу соответствующего совместного локализации.
    Примечание: Ручной курирование последующего отслеживания ошибок и исключения треков с длительностью короче, чем определенный порог (т.е., 150 s) могут потребоваться.
  6. Генерировать определенный канал совместно локализации для CD11c-рекламы ЯФП+ клетки, для того чтобы отделить CFP и рекламы ЯФП сигналов. С этой целью обозначить многоугольник шлюзовые (iiРисунок 2B), который выбирает только вокселей, имея положительный интенсивности в зелёном канале, но низкой интенсивности в канале синего.
    Примечание: представитель микроскопии, показаны сигналы от канала 1, канал 2, Сопредседатель локализации канала для СЛП, Сопредседатель локализации канала для рекламы ЯФП и сочетание всех каналов можно найти в Рисунок 2Biii.
  7. Реконструировать поверхности клеток CD11c-рекламы ЯФП+ и отслеживать их положение со временем (поверхности инструмента).
    Примечание: Ручная коррекция последующего отслеживания ошибок не требуется для этого шага. Действительно из-за сложной пространственно временной динамики DC, реконструировать их точное поверхности от 2 P-IVM данных является сложной задачей, которая не может быть достигнута с программным обеспечением доступных сегментации. Среди причин, которые делают эту задачу трудной тонкий выступов и вариации яркости не позволяют для использования определенных обработки изображений техники, такие как сглаживание фильтры или статические порога. Кроме того в сети постоянного тока, трудно отделить отдельные ячейки, основанные только на их появление в 2P-IVM данных. Для этих причин, а не пытаться точной сегментации, настроив параметры программного обеспечения мы предлагаем восстановить не точных поверхностей DC. Затем обрабатывайте возможные ошибки с помощью надежных показателей, как описано в 5,8.
  8. Мера миграции клеток.
    1. Экспортируйте классической миграции меры для CFP+ и CD11c-рекламы ЯФП+ клетки. Среди них «средняя скорость трек» указывает средняя скорость миграции клеток, а «трек прямолинейности» направленность клеток. Эти меры могут быть экспортированы в файл электронной таблицы из обработки изображений программное обеспечение.
    2. В экспортируемые таблицы файлов, вычислить «исправленные трек прямолинейности» (также упоминаемый как исправленные родов коэффициент) для CFP+ и CD11c-рекламы ЯФП+ клетки, которая определяется как «трек прямолинейности», умноженное на квадратный корень из «отслеживать длительность» разделена на квадратный корень длительность видео. Эта мера является более надежной, чем «трек прямолинейности» в присутствии короткие треки28, например возникая от отслеживания ошибок.
      Примечание: только видео такой же длины можно сравнить с этой мерой.
  9. Мера взаимодействия клеток.
    1. Определите контакта между CFP+ клеток и клеток CD11c-рекламы ЯФП+ , если их расстояние (ближайший вокселей) равно или меньше чем порогового значения (т.е. 2 мкм).
      Примечание: Этот порог должен быть достаточно строгим, чтобы обнаружить контакт только тогда, когда клетки находятся в непосредственной близости. Однако, мы рекомендуем держать этот порог больше 0, идеально N раз больше, чем радиус voxel (N > 2), потому что Сглаживание границы может сделать восстановление клеток меньше, чем размер фактические ячейки.
    2. Граф количество и продолжительность контактов между CFP+ и CD11c-рекламы ЯФП+ клетки. В программе обработки изображений это можно сделать например путем выполнения «поцелуй и запустить» подключить. Эти меры могут быть экспортированы в файл электронной таблицы на вкладке Статистика.
  10. Импорт ранее вычисляемые меры в статистическое программное обеспечение, создавать участки и выполняют статистические тесты.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этой работе мы описали подробный протокол учиться в vivo моторику и взаимодействия между нейтрофилов и DC во время инфекции гриппа в мышиных трахеи (рис. 3A). С этой целью мы изолированы CFP+ нейтрофилов (92% чистоты; Рисунок 3B) CK6-ECFP мышей и мы восприимчивую передало их в CD11c-рекламы ЯФП мышь инфицированных гриппом. После этого мы провели 2P-IVM трахеи на 3 день п.и. В этот момент времени мы наблюдали...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Эта работа представляет подробный протокол для поколения 4D изображения показаны миграции восприимчивую передаваемых нейтрофилов и их взаимодействия с DC во время инфекции гриппа в мыши трахеи. Описанные 2P-IVM модель будет отношение к изучению динамики иммунных клеток во время инфекции в дыхательных путях.

Недавно несколько моделей, основанных на визуализации динамики клетки в дыхательных путях были развитые9,10,

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана швейцарского национального фонда (СНФ) гранты (176124, 145038 и 148183), Грант реинтеграции Мари Кюри Европейской Комиссии (612742) и SystemsX.ch на грант для D.U.P. (2013/124).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Gigasept instru AFSchü lke & Mayr GmbH4% раствор
CD11c-YFP мышиJackson Laboratories008829мыши были выведены собственными
мышами CK6-ECFPLaboratories004218мыши были выведены собственными
1x фосфатный буферный физиологический раствор Dulbecco's модифицированный без хорида кальция и хлорида магнияSigmaD8537-500ML
10x Фосфатный буферный физиологический раствор Дульбекко, модифицированный без хорида кальция и хлорида магнияSigmaD1408-500ML
Percoll PLUSSigmaE0414-1LХранить при 4° C
Ketamin LabatecLabatec Pharma7680632310024магазин в RT, магазин в 4 ° C при нахождении в растворе кет/ксиловой смеси
Ромпун 2% (Ксилазин)Байер6293841.00.00Хранить при РТ, хранить при 4°С; C при нахождении в растворе смеси кет/ксил
26 г 1 мл Sub-Q BD PlastipakBD Plastipak305501
30 г, 0,3 мл BD Micro-Fine Insulin ШприцыBD324826
Falcon 40 µ m Клеточный фильтрCorning352340
мл ШприцыBD Plastipak300185
Microlance 3x 18 G иглыBD304622
Introcan Safety 20 G (катетер)Braun4251652.01
6 Well Cell Culture ClusterCostar3516
RPMI medium 1640 + HEPES (1x)ThermoFisher Scientific42401-018Магазин по адресу 4° C
Liberase TL Research GradeRoche5401020001хранить при температуре -20 °de; С/коллагеназа (I и II) смесь
DNAse IAmresco (VWR)0649-50KUХранить при -20° C
CellTrace Фиолетовый морилкаThermoFisher ScientificC34557хранить при -20 °°; C
EDTASigmaEDS-500G
Фетальная бычья сывороткаGibco10270-106хранить при -20 °deg; C
PE-10 Микро медицинская трубка2Biological Instruments SNC#BB31695-PE/1
Хирургическая пластиковая лентаM Plast
ViscotearsBausch & LombStore at RT
PlasticineOhropax
High Tolerance Glass Coverslip 15 мм круглыйWarner Instruments64-0733
SomnoSuite Портативная система для анестезии животныхKent ScientificSS-01
Nuvo Lite mark 5GCE medline14111211
MiniTag (газовая анестезия и нагревательная столовая)Tem Sega
SURGICAL BOARDБернский университет TrimScope
II Двухфотонный микроскопLaVision Biotec
Chameleon Vision Ti:Sa лазерыCoherent Inc.
25X NA 1.05 объект для погружения в водуOlympusXLPLN25XWMP2
The Cube& Коробка инкубационной камеры и регулятора температурывизуализации жизни
Imaris 9.1.0Программное обеспечение для визуализациибитовой плоскости
GraphPad Prism 7Статистическое программное обеспечениеGraphPad
Jackson силами 2 Услуги

Ссылки

  1. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  2. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  3. Fein, M. R., Egeblad, M. Caught in the act: revealing the metastatic process by live imaging. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 580-593 (2013).
  4. Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).
  5. Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annual review of immunology. 26, 585-626 (2008).
  6. Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A Decade of Imaging Cellular Motility and Interaction Dynamics in the Immune System. Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).
  7. Coombes, J. L., Robey, E. A. Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo. Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).
  8. Pulendran, B., Maddur, M. S. Innate Immune Sensing and Response to Influenza. Life Science Journal. 6 (4), 23-71 (2014).
  9. Lim, K., et al. Neutrophil trails guide influenza- specific CD8 + T cells in the airways. Science. 349 (6252), (2015).
  10. Kim, J. K., et al. In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration. American journal of respiratory cell and molecular biology. 47 (6), 864-868 (2012).
  11. Kretschmer, S., et al. Autofluorescence multiphoton microscopy for visualization of tissue morphology and cellular dynamics in murine and human airways. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 96 (8), 918-931 (2016).
  12. Veres, T. Z., et al. Intubation-free in vivo imaging of the tracheal mucosa using two-photon microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 694(2017).
  13. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature. 8 (1), 91-96 (2011).
  14. Thornton, E. E., Krummel, M. F., Looney, M. R. Live Imaging of the Lung. Current Protocols in Cytometry. 60 (1), (2012).
  15. Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
  16. Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
  17. Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. Intravital microscopy in historic and contemporary immunology. Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).
  18. Lambrecht, B. N., Hammad, H. Lung Dendritic Cells in Respiratory Viral Infection and Asthma: From Protection to Immunopathology. Annual Review of Immunology. 30 (1), 243-270 (2012).
  19. Camp, J. V., Jonsson, C. B. A role for neutrophils in viral respiratory disease. Frontiers in Immunology. 8, (2017).
  20. van Gisbergen, K. P. J. M., Sanchez-Hernandez, M., Geijtenbeek, T. B. H., van Kooyk, Y. Neutrophils mediate immune modulation of dendritic cells through glycosylation-dependent interactions between Mac-1 and DC-SIGN. The Journal of experimental medicine. 201 (8), 1281-1292 (2005).
  21. Gonzalez, S. F., et al. Capture of influenza by medullary dendritic cells via SIGN-R1 is essential for humoral immunity in draining lymph nodes. Nature Immunology. 11 (5), 427-434 (2010).
  22. Lindquist, R. L., et al. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nature immunology. 5 (12), 1243-1250 (2004).
  23. Li, H., et al. Human Vγ9Vδ2-T cells efficiently kill influenza virus-infected lung alveolar epithelial cells. Cellular and Molecular Immunology. 10 (2), 159-164 (2013).
  24. Tran Cao, H. S., et al. Development of the transgenic cyan fluorescent protein (CFP)-expressing nude mouse for "technicolor" cancer imaging. Journal of Cellular Biochemistry. 107 (2), 328-334 (2009).
  25. Jaber, S. M., et al. Dose regimens, variability, and complications associated with using repeat-bolus dosing to extend a surgical plane of anesthesia in laboratory mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 53 (6), 684-691 (2014).
  26. Pizzagalli, D. U., et al. Leukocyte Tracking Database, a collection of immune cell tracks from intravital 2-photon microscopy videos. Scientific Data. , In press (2018).
  27. Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 230-233 (2011).
  28. Beltman, J. B., Marée, A. F. M., De Boer, R. J. Analysing immune cell migration. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 789-798 (2009).
  29. Keller, H. U. Motility, cell shape, and locomotion of neutrophil granulocytes. Cell motility. 3 (1), 47-60 (1983).
  30. Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. Intravital Microscopy. Immunity. 21 (3), 315-329 (2004).
  31. Lambert Emo, K., et al. Live Imaging of Influenza Infection of the Trachea Reveals Dynamic Regulation of CD8+ T Cell Motility by Antigen. PLOS Pathogens. 12 (9), e1005881(2016).
  32. Kjos, M., et al. Bright fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions. Journal of bacteriology. 197 (5), 807-818 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Percoll
Изображений взаимодействия клеток в слизистой оболочки трахеи во время инфекции вируса гриппа с помощью двух Фотон прижизненной микроскопии
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.