Мы представляем собой протокол для классического кондиционирования запрягали муравьев, что позволяет исследователям изучить визуального обучения и памяти формирования на уровне анализа не представляется возможным с свободно перемещающихся лиц.
Методическая статья
Мы представляем собой протокол для классического кондиционирования запрягали муравьев, что позволяет исследователям изучить визуального обучения и памяти формирования на уровне анализа не представляется возможным с свободно перемещающихся лиц.
Несколько видов насекомых стали модели систем для изучения формирования обучения и памяти. Хотя многие исследования сосредоточены на свободно перемещающихся животных, исследования, реализация парадигмы классический подготовлять с запрягали насекомых были важны для расследования точные сигналы, которые люди учиться и нейронные механизмы, лежащие в основе обучения и формирование памяти. Здесь мы представляем протокол для вызывающие визуальных ассоциативные обучения в древесных муравьёв через классический подготовлять. В этой парадигме муравьи запряженных и представлены с визуальной подсказкой (синий картона), условный раздражитель (CS), в паре с appetitive сахара наградой, безусловный раздражитель (США). Муравьи выполняют верхней челюсти-губы расширение рефлекс (Малер), безусловный ответ (УР), который может использоваться как индикация для обучения. Обучение состоит из 10 испытаний, разделенных с 5-минутным интервалом (ИТИ) intertrial. Муравьи также проверяются для сохранения памяти 10 минут или 1 час после тренировки. Этот протокол имеет потенциал позволяет исследователям анализировать, точные и контролируемым образом, детали формирования зрительной памяти и нейронных основы формирования обучения и памяти в древесных муравьёв.
Насекомых широко используется в качестве моделей для изучения обучения и памяти формирования1. Особенно успешным Вену исследований предполагает использование классический подготовлять сдержанной животных, что позволяет точно контролировать сигналы изучается и позволяет исследователям расследовать нейронные механизмы обучения и памяти. Большинство исследований были посвящены appetitive классический подготовлять рабочих пчел, Apis mellifera. Рабочие пчелы обучены связать CS с США, что вызывает UR. В этой парадигме, первоначально разработанный Такеда2 и Bitterman и др. 3, UR-Хоботок расширение рефлекс (%), США — сахар и CS является запах. Пчелы изучить связь между США и CS и могут формировать долгосрочную память этой ассоциации.
Был использован оригинальный парадигмы, с использованием процента как UR разгадать нервные пути, лежащие в основе обонятельных обучения в пчел4. Он был изменен в несколько способов тестирования обучения различных сенсорных стимулов, включая визуальные раздражители5,6,7, включить отрицательной обучения с использованием подавления %8 или расширением жало Рефлекс (SER)9 ур, а также для тестирования обучения в других видах, таких, как Шмели10 и дрозофил11. Хотя формирование памяти с несколькими условиями был изучен через классический подготовлять, визуального обучения по-прежнему трудно наблюдать, используя этот подход, даже у видов, которые показывают высокую степень способности визуального обучения во время нагула, такие как Медоносные пчелы.
Недавние исследования применяют аналогичный подход к насекомых, которые не имеют хоботок, таких, как саранча, которые выполняют Palp открытия ответ (POR)12и муравьи, которые выполняют верхней челюсти-губы расширение рефлекс (Малер)13. Это уже показал способности конкретного этапа обучения, которые совпадают фаза конкретных кормления стратегии двух разных пустынной саранчи фенотипов, стадный на всей территории отеля и в одиночной формы, закрепляющее идею, что формирование памяти должен соответствовать 14экологические потребности. Кроме того исследования обонятельного обучения в муравьи показал сходство между муравьев и пчел в формирование памяти и хранения, с долгосрочной памяти хранения, 72 часов после тренировки, зависимый от синтеза белка15.
Эти приспособления оригинальные парадигмы позволили учить и память формирования быть изучены многие формы и несколько видов модели. Это имеет важное значение для выявления механизмов формирования общей памяти для насекомых, но и для выявления различий, которые отражают особую экологии, обучения и памяти в разных видов. Основная цель протокола, которую мы опишем здесь является предоставление способа для выполнения классический подготовлять эксперименты с использованием визуального условного стимула с широко изучены муравьи, Руфа Formica. Он выпускается из нашего исследования визуального обучения в древесных муравьёв16, который также является адаптация визуальных классический подготовлять парадигм.
1. поддержание Formica Руфа колоний
Примечание: Колонии древесных муравьёв (Formica Руфа, L.), используется для этого исследования были собраны от Ashdown лес, Суссекс, Великобритания (N 51 4.680, E 0 1.800). В Великобритании F. Руфа колоний должны быть собраны в период с июля по август. Значительная часть гнезда должны быть удалены, включая поддерживается несколько сотен рабочих и расплодом, обеспечить колонии и активных для более длительных периодов времени (до одного года). Разрешения следует добиваться от соответствующих органов до удаления гнезда.
2. Выбор и освоение муравьи
Примечание: Для использования муравьи, необходима по заказу владельца. Это могут быть построены с использованием моделирования глины и картона с разрезом открытия прилагается к нему по горизонтали. Верхняя поверхность картона должны быть частично покрыты воском, позволяя насекомых булавки прилагается при фиксации. Тщательной обработки необходим на каждом шагу этого протокола (включая техническое обслуживание, транспорт и эксперимент), но в частности когда освоение муравьи, чтобы избежать, подвергая их высокий уровень стресса до подготовки.
3. обучение и тестирование
4. сбор данных и анализ
В ходе экспериментов классический подготовлять CS не должны побудить спонтанной реакцией в животных. В экспериментах, которые мы провели только 3% - 4% муравьев исполнении Малер в ответ на визуальный сигнал на первый судебный процесс, до подготовки. Муравьи, которые переживают парных обучение осуществляется все больше и больше Малер в ответ на CS (Рисунок 3А; логистической регрессии, N = 51, степеней свободы (df) = 507, z = 5.949, p < 0.01). Процент парных муравьев, которые отвечают на CS перестала расти около 50%, от года третий судебный процесс. Напротив, непарных муравьи, не показали существенного увеличения в Малер во время обучения (рисунок 3B; логистической регрессии, N = 29, df = 287, z = 0.758, p = 0,45). Возникновение Малер в ответ на визуальный сигнал был значительно выше во время паре чем непарные обучение (логистической регрессии, N = 80, df = 796, z =-5.306, p < 0.01), что было верно для каждого судебного разбирательства, за исключением первой (Таблица 1).
Для изучения их кратко - и среднесрочной перспективе памяти15, муравьи были протестированы 10 мин или 1 час после последнего судебного процесса обучения. Для обоих тестов доля муравьев, выполнении Малер в ответ на CS был значительно выше, когда они прошли подготовку парных вместо непарных (рис. 3 c и 3D; Таблица 1).
Во время обучения, индивидуальных муравьи показали существенные вариации в количество и тип Малер, что они отображаются (Рисунок 4A и 4B). Только 14% парных муравьи ответил каждый суда от второй или третий судебный процесс вперед, в то время как большинство муравьёв чередовались между испытаниями, в которых они ответили, и в котором они не. На этих учебных судебных процессов, в которых ответил муравьи степень которой они расширена и переехал их ротовые разнообразны. Таким образом, мы разделили Малер на три различных типа: FEM, FE или PE. Как правило муравьи выполняется чаще, чем FE FEM или PE. Однако только несколько муравьев последовательно выполнить тот же тип реагирования; в большинстве случаев муравьи показали мало согласованности на типе Малер они исполнили (рис. 4).

Рисунок 1 : Экспериментальная установка и схема обучения. (A) исправить муравей с воском для закрепления насекомых прилагается к моделированию глиной цилиндр (оранжевый) и место на заказ держатель под его разрешить натуралистический позицию. Поместите его белая акриловая коробка, освещается двумя источниками света, непосредственно под камерой. Используйте как условный раздражитель (CS) картона (синий квадрат) прилагается к шприцу, который обеспечивает стимул unconditioned (США), сахар награду. Врезные показывает в увеличенном муравей в держателе. (B) кончик шприца игла перемещается как можно ближе муравья голову, но не касаясь антенн, как показано в этой схеме. Паре муравьи поезд через либо (C) или (D) непарные обучения. Эта цифра была изменена от Фернандес и др. 16. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Ответ расширения верхней челюсти-губы древесных муравьёв. Отдельные кадры из видео записи показывают Муравьиные рот часть движения во время тренировки. (A) Эта группа показывает никакого ответа. (B) Эта группа показывает полное расширение (FE) верхней челюсти губы, которая завершает в Глосса. (C) Эта группа показывает частичное расширение (PE) с только верхнечелюстной palpus видны. (D) Эта группа показывает частичное расширение (PE) структур верхней челюсти губы. (E) муравьи, проходящими подготовку парных (N = 51) выполнить полное расширение с движением (FEM, темно-коричневый), FE (средний коричневый) или PE (светло-коричневый). Эта цифра была изменена от Фернандес и др. 16. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 : Дерево муравьи формы ассоциативного воспоминания о визуальной подсказкой в паре с награду сахар. (A) доля парных муравьи (N = 51) выполнении Малер в ответ на представление CS существенно увеличилась на протяжении всего обучения. (B) процент муравьев, выполняя Малер не увеличивается существенно всей непарных обучения (N = 29). Муравьи были протестированы (C) 10 минут (парные: N = 15; непарные: N = 15) или (D) 1 час (парные: N = 15; непарные: N = 14) после последнего судебного процесса обучения. Процент муравьев, отвечая на CS, во время и после парные и непарные обучения представлены в коричневый или серый, соответственно. В темноте (FEM), средний (FE) и тонов света (PE) представлены три типа Малер. Эта цифра была изменена от Фернандес и др. 16. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4 : Индивидуальной производительности во время обучения муравьев. Эти панели показывают индивидуальные выступления (A) парные муравьи и (B) непарные муравьи. Три типа Малер представлены в темноте (FEM), средний (FE) и свет (PE) коричневый или серый. Эта цифра была изменена от Фернандес и др. 16. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Судебное разбирательство | N | DF | G (с поправкой) | P |
| 1 | 80 | Na | Na | > 0,1 |
| 2 | 80 | 1 | 3.86 | < 0,05 |
| 3 | 80 | 1 | 8.41 | < 0.01 |
| 4 | 80 | 1 | 6.63 | < 0.01 |
| 5 | 80 | 1 | 8.41 | < 0.01 |
| 6 | 80 | 1 | 7.5 | < 0.01 |
| 7 | 80 | 1 | 10,69 | < 0.01 |
| 8 | 80 | 1 | 11.76 | < 0.01 |
| 9 | 80 | 1 | 17.13 | < 0.01 |
| 10 | 80 | 1 | 17.13 | < 0.01 |
| 10 мин | 59 | 1 | 5.5 | < 0,05 |
| 1 ч | 59 | 1 | 4.42 | < 0,05 |
Таблица 1: сравнение Малер ответы на CS между муравьи, которые подверглись парные и непарные обучения, для каждого судебного разбирательства и test. Количество муравьев (N), степеней свободы (df), G-тест независимости (G) и p-значения отображаются. Первый судебный процесс был проанализирован с точный тест Фишера. Эта таблица была изменена от Фернандес и др. 16.
Классический подготовлять является одним из наиболее устоявшихся парадигмы для изучения, обучения и памяти. Протокол, который мы представили здесь является адаптация парадигмы для мед пчелы работников2,3 и впоследствии используется с несколькими других видов, таких, как Шмели, плодовых мух, которые также используют % как индикация для обучения10 ,11и саранча и муравьи, которые используют POR и Малер, соответственно12,13. Используя этот протокол, можно обучить запрягали древесины муравьи изучать связь между визуальными подсказками и вознаграждение сахара и анализировать сохранение этой короткой - (10 мин) и среднесрочной (1 час) памяти16.
В любой поведенческих эксперимент это необходимо принимать во внимание важные шаги, которые можно свести к минимуму изменчивость в ответах животных. В протоколе, представленные здесь несколько мер для сведения к минимуму колебаний до и во время обучения. До начала экспериментов колонии должна быть starved для по крайней мере два дня и муравьи должны отбираться на основе их желание съесть от падение сахара в поле Холдинг. При выборе муравьи таким образом предназначен для максимизации шансов обучения муравьев, которые мотивированы, чтобы кормить. Осторожны, обработка также является важным фактором, потому что это может помочь снизить уровень стресса, который нарушает обучения, если оно является слишком интенсивным21. С этой целью следует наркозом муравьи с холодной, чтобы остаться неподвижно, пока используется, потому что любое движение (для экранирования) во время этой процедуры может быть источником стресса. Кроме того контакты между муравей и воск должно быть минимальным, избегая контакта между антеннами и горячим воском или провод, который может привести к повреждению. Хотя эти замечания не были проанализированы формально, усики, казалось, двигаться с конкретным шаблоном во время обучения.
Во время экспериментов тщательно поставки сахара важно также сохранить муравьи мотивированы. Опять же хотя это не были проанализированы формально, резкие доставки казалось наносить дополнительный стресс муравей, который в свою очередь привело к отсутствию мотивации и обучения. Кроме того, сахароза, доставлены в ходе подготовки должно быть снижение концентрации (200 г/Л) чтобы избежать насыщения до конца обучения и тестирования. Это позволяет Малер быть хорошим кандидатом безусловный ответ, потому что, вместе с низкой спонтанное производительность этой реакции на визуальную подсказку, он также не насыщают за испытаний. И наконец, в отличие от большинства классический подготовлять исследования2,3,5,6,,78,9,10, 11 , 12 , 13, мы провели обучение один муравей в то время до конца эксперимента, оставляя его в место между испытаниями, вместо того, чтобы удалить его для проверки другой муравей. Обучение несколько муравьев вместе, как представляется, результаты более переменных, которые могут быть благодаря увеличению стресса и/или конфликт между визуальной информации, вызванные полной смены декораций. Чтобы уменьшить продолжительность каждого эксперимента, мы использовали ITI 5-ти минутах вместо 10 минутах ITI, используемых в большинстве классический подготовлять исследования16. Хотя все эти соображения должны помочь обеспечить, что муравьи мотивированы, чтобы накормить и учиться во время обучения, нельзя избежать некоторых изменчивости. Мы рекомендуем использовать муравьи, которые казалось бы нормальное поведение социальных, appetitive и передвижения и исключая муравьев от анализа момент, когда они не могут прокормить на пробу обучения или тест.
Характер CS не тестировалось в этом исследовании. Хотя мы использовали синий визуальный стимул, потому что муравьи рода же чувствительны к этих волн18, другие цвета также можно извлечь в ассоциации с наградой. Дальнейшие эксперименты потребуется полностью характеризуют цвета видел и узнал в этой настройке. Это также верно для разных форм и размеров визуальной подсказки. Мы не испытали если муравьев пространственное разрешение будет достаточно для отличительные визуальный стимул, представленные здесь, на расстоянии от глаз муравьев был представлен на. Хотя древесины муравьи Составные глаза были описаны с точки зрения размера и количества граней22, к нашему знанию, их пространственное разрешение не описана полностью еще. Однако это был рассчитан для Melophorus magoti23. Похожие характеристики древесины муравьев, или других протестированных насекомых глаза способствовало бы ясно исследование особенностей визуальную подсказку, наблюдается и узнал на животных. Кроме того мы включили движения при представлении зрительный стимул муравей, потому что он показал играть определенную роль в обучении ассоциативные пчелы во время классический подготовлять6. Однако это также не тестировалось в этом исследовании и ввиду различных движения летающих насекомых, по сравнению с прогулки насекомых, можно наблюдать различия между медоносных пчел и муравьев визуальные классический подготовлять.
На Последнее замечание мы смогли изучить долговременного хранения в памяти, потому что муравьи не выжить, используется для таких длительных периодов после тренировки. Однако в последующие наборы экспериментов, мы сохранили муравьи жив и мотивированы, чтобы поесть и узнать когда запряг и оставил их на ночь в темной и влажной среде (поместив поле над ними). Таким образом эта парадигма может использоваться для разгадать долгосрочное сохранение памяти древесных муравьёв, помимо краткосрочной и среднесрочной перспективе памяти.
С этой простой процедуры адаптировано из общего классический подготовлять парадигмы это возможно для изучения приобретение и сохранение визуального воспоминания в запряженных древесины муравьи, которые были широко изучены парадигм, с помощью свободного перемещения животных. Эта парадигма имеет потенциал, чтобы быть использованы для анализа нейронной основе визуального обучения в весьма прочные модели для насекомых навигации.
Авторы не имеют ничего сообщать.
Авторы благодарят Tom Коллетт и Корнелия Buehlmann для обмена ценной информацией относительно сбора и поддержание дерева муравей колонии. Авторы также поблагодарить Justine Кревель за комментируя предыдущей версии этой статьи.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Fluon | Blades Biological Ltd, Эденбридж, Великобритания | ACS 109; САУ 112; ACS 114 | Для предотвращения нападения насекомых |
| Crickets | Blades Biological Ltd, Edenbridge, UK | LZJ 217 | Дается колониям муравьев в качестве источника белка |
| Натуральная сосновая канифоль/смола | Minerals-water Ltd, Рейнхэм, Великобритания | 500г | Дается колониям муравьев для санитарии |
| Austerlitz Insect Pin | Fine Science Tools GmbH, Гейдельберг, Германия | 26000-40 | Для обуздания муравьев |
| Высокоскоростная камера | Edmund Optics Inc., Баррингтон, США | eo-13122M | MaLER записи во время обучения и тестирования |
| Macrolens | Cannon, Суррей, Великобритания | EF 100 mm f/2.8 L Macro IS USM | Записи MaLER во время обучения и тестирования |
| программного обеспечения | IDS Imaging Development Systems GmbH | uEye64 | Записи MaLER во время обучения и тестирования |
| Blue Cardboard | John Smith's at Union Store, University of Sussex | JACK-PJM41358 | Представляет собой условный стимул |
| Шприц Fisher | Scientific LTD, Loughborough, UK | BD Пластипак 300185корпус; Код товара.12369289 | US and CS (прилагается) презентационная |
| игла (0,5 x 16 мм) | Fisher Scientific LTD, Лафборо, Великобритания | BD Microlance 300600; Код товара:10442204 | Презентация в США и СНГ (прилагается) |
Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE
Запросить разрешениеAn erratum was issued for: Visual Classical Conditioning in Wood Ants. The Acknowledgments section was updated, and a supplemental figure was added.
The Acknowledgments sections was updated from:
The authors thank Tom Collett and Cornelia Buehlmann for sharing valuable information regarding collection and maintenance of wood ant colonies. The authors also thank Justine Crevel for commenting on previous versions of this article.
to:
The authors thank Tom Collett and Cornelia Buehlmann for sharing information regarding collection and maintenance of wood ant colonies. The authors also thank Justine Crevel for commenting on previous versions of this article, and Nora Nevala for measuring the spectrum intensity of the visual stimulus. This work was supported by a BBSRC grant to JEN (grant number BB/R005036/1). All the data pertaining to this manuscript are published in the University of Sussex Research Data Repository online database (10.25377/sussex.5794386).
The following supplemental figure was added to the end of the Representative Results section:

Figure S1: Normalized intensity of the conditional stimuli (CS). The CS has a peak intensity at 545 nm (in the green range) and another at 435 nm (in the blue range).