Здесь мы разделяем методы для измерения потребления митохондриальной кислорода, определяющих концепцию питания энергетики и Протон утечки, основной причиной неэффективности в митохондриальной генерации АТФ. Эти результаты можно приходится 30% энергии, потеряли в утилизации питательных веществ, чтобы помочь оценить функции митохондрий.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Измерение потребления кислорода печени митохондриальных и Протон утечки кинетики оценить митохондриальное дыхание в Гольштейн молочного скота
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Потребление кислорода, Протон мотив силы (PMF) и Протон утечки являются измерения митохондриальное дыхание, или насколько хорошо митохондрий в состоянии преобразовать NADH и ГВС в СПС. Так как митохондрии также основной сайт для использования кислорода и питательных веществ Окисление диоксида углерода и воды, насколько эффективно они используют кислород и производят АТФ непосредственно относится к эффективности обмена питательных веществ, потребности в питательных веществах животных, и состояние здоровья животного. Этот метод предназначен для изучения митохондриальное дыхание, который может использоваться для изучения воздействия различных препаратов, диеты и воздействия на окружающую среду на митохондриальной метаболизм. Результаты включают потребление кислорода, измеряется как Протон зависит от дыхания (статья 3) и Протон утечки зависит от дыхания (состояние 4). Отношение государства 3 / государственный 4 дыхания определяется как отношение дыхательных путей управления (RCR) и может представлять митохондриальной энергетической эффективности. Митохондриальной Протон утечки является процесс, который позволяет диссипации митохондриальной мембраны потенциальных (СПП) расцеплять окислительного фосфорилирования от ADP, снижается эффективность синтеза АТФ. Кислород и TRMP + чувствительной электроды с митохондриальных субстратов и ингибиторы цепи переноса электронов используются для измерения состояния 3 и 4 государства дыхания, Митохондриальные мембраны PMF (или потенциал для производства АТФ) и Протон утечки. Ограничения этого метода, что ткани печени должны быть как можно более свежей и все биопсии и анализы должны быть выполнены в менее чем 10 h. Это ограничивает количество выборок, которые могут быть собраны и обработаны один человек в день около 5. Однако только в 1 г ткани печени необходима, поэтому в крупных животных, таких как молочного скота, количество образцов необходимо мал по сравнению с печени размер и мало времени восстановления требуется.
Введение
Митохондрии являются очень чувствительными к стресс и их клеточной среды может способствовать широкий спектр метаболических заболеваний. Протон утечки в митохондриях и потребление кислорода являются показателями здоровья митохондрий. Методы, описанные в этой бумаге смета митохондриальной энергоэффективности с помощью RCR, основанные на потребление кислорода с и без утечки Протон. Эти результаты можно приходится 30% энергии, потеряли в утилизации питательных веществ1. Изменения в утечки Протон и потребления кислорода может идентифицировать митохондриальной дисфункции, которая способствует метаболические болезни и приводит к снижению энергетической эффективности. Эти методы могут также использоваться для изучения влияния различных методов лечения на митохондриальное дыхание. Общая цель измерения потребления митохондриальной кислорода и Протон утечки кинетики — оценить функции митохондрий и энергетической эффективности.
Печеночная митохондриальной дисфункции был связан с несколькими заболеваниями в молочном скотоводстве. Клеточный метаболизм возможность переключения между углеводного и липидного топлива, когда сталкиваются с дефицит энергии в начале кормления зависит от числа и функции митохондрий в ячейки2. Дефекты в митохондриях способность адаптироваться к увеличению спроса на энергию и увеличение β-окисления может привести к накоплению внутриклеточного липидов, связанные с сопротивлением инсулина и может привести к формированию жирной печени в начале кормления дойных коров. Митохондрии, как сайт кетоновые тела производства и использования, могут играть ключевую роль в кетоз в молочных коров3. Отсутствие митохондрий или митохондриальной дисфункции повлияет на доступность топлива к периферии и отражены изменения в потреблении кислорода или RCR.
Изменения потребления в митохондриальной кислорода в ответ на воспаление. 7 день старое бройлеров были случайным образом распределены к группе заражены эймериями Максима и управления группы4. Бройлеров, которые не проходят кокцидиоза вызов имел меньшее потребление кислорода из-за утечки Протон и выше RCR, указывающее, что митохондрий печени реагировать иммунной проблема увеличения Протон утечки. Во время Протон утечки и реактивной видов кислорода считалось признаком митохондриальной мембраны дисфункции и наносит ущерб энергетической эффективности, сейчас известно, что важно для импорта белков и кальция в митохондриях5 и для генерации тепла1.
Электрон утечки из дыхательной цепи делает митохондрий подвержены реактивнооксигенных видов производства и окислительного повреждения митохондриальной мембраны белки, липиды и митохондриальной ДНК. Как возраста митохондрии ущерб может накапливаться, достигая особенно митохондриальной ДНК, вызывая дальнейшее дисфункции в митохондриальной метаболизм6 и большей восприимчивости к болезням коровы. На практике многие скота животных кормят высокого уровня добавки, такие как Cu, Zn и Mn увеличить Антиоксидантная функция. Однако кормления высокий уровень Cu, Zn и Mn сократилось производство молока и увеличение потребления кислорода вследствие Протон утечки (4 состояния дыхания)7.
Предыдущие исследования по вопросу о роли митохондриальной функции в области энергоэффективности в крупного рогатого скота была сосредоточена на изменения в Протон утечки и потребления митохондриальной кислорода. Очень мало исследований были опубликованы в молочном скотоводстве и большинство работ сравнить эффективность производства в виде остаточного потребления корма (RFI) для функции митохондрий в крупного рогатого скота. Изменчивость в митохондриальное дыхание, ставки были рассмотрены путем измерения состояние 3, состояние 4 и RCR в печень из кормящих голштынов и кормящих говядина коровы (Ангус, Брангус и Херефорд)8. Исследователи не нашли каких-либо корреляции в митохондриальное дыхание с роста или доения черты для крупного рогатого скота, но доклад корреляции между митохондриальное дыхание и доения черты для голштины. В двух исследованиях RFI сравнивали в мясном скотоводстве митохондриальное дыхание ставки (состояние 3, состояние 4 и RCR) в мышечных митохондрий9,10. Митохондриальное дыхание ставки изменилась в ответ на DMI и низкие ставки были связаны с менее эффективным говядины Бычков. В другом исследовании RFI Бычков из высоких или низких быков ЗПИ были сопоставлены с митохондриальное дыхание ставки и кинетика утечки протона между двумя группами потомства11. Различия обусловлены получить подтверждающие что делает вывод, что получить не воздействия митохондриальное дыхание в крупного рогатого скота.
В этом документе эксперимент, изучении печени, RCR в ответ на питание 3 антиоксидант минералов для кормящих молочного скота иллюстрирует использование методов измерения потребления кислорода во время 4 и 3 дыхания и PMF.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все методы, протокол и исследований, описанных здесь были утверждены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из университета Калифорнии, Дэвис.
1. получение биопсия печени от Гольштейн молочные коровы
Примечание: Биопсия печени должны выполняться лицензированных ветеринаром. Биопсии печени может выполняться на узле молочные, где расположены коров. Молочных коров может продолжать нормально доят и молоко не нужно быть выведены от продуктов питания до или после процедуры. Рекомендуется, что по крайней мере 4 человек необходимы для выполнения биопсии печени на молочные коровы: ветеринар для выполнения биопсии, дрессировщик стоять на коровье бедра для защиты области биопсии и ветеринар, лаборант на внешней стороне пера для ПРЕОБР ER инструменты, материалы и биопсии образца и от ветеринара и поддерживать чистой зоне, которая может быть задней части транспортного средства (рис. 1) и техник для получения печени образца и начать митохондриальной изоляции.
- За один месяц до биопсии печени, дают коровы клостридий вакцинации. Создание хирургической пакеты автоклавирования хирургические полотенца, инструмент биопсии, Держатели скальпель и хирургическое оборудование.
- Один день до биопсии печени, придать коровы с 0,044 мл/кг веса Цефтиофур гидрохлорида подкожно в области шеи. Контролировать температуру корова, потребление и фекальных оценки для использования в качестве основы для нормальной функции.
- Создайте митохондрий изоляции СМИ (MIM) содержащее 220 мм маннитол, сахароза 70 мм, 20 мм HEPES, 1 мм ЭДТА и 0,1% (w/v) жирных кислот бесплатно BSA, рН 7,4 при 4 ° C. Будет необходимо около 30 мл на сэмпл.
- Останови корова физически используя headlock с halter, при необходимости (рис. 2). С помощью Холтер, галстук голову к левой стороне стойки. При необходимости, химическая сдержанность (Ксилазина гидрохлорид 100 мг/мл IV на 0,010-0,015 мг/кг веса тела) может быть использован.
- Области биопсии находится на право 10 - 11 межреберное пространство (рис. 3). Рисование прямой линии от правой тазобедренному бугру до точки правого плеча. Биопсия сайт находится, где эта линия пересекается с 10-11 межреберное пространство. Стерилизуйте области корову, чтобы быть биопсию после бритья площадь 10 см (рис. 4). Промойте области с 10% providone скраб (рис. 5) с помощью кругового движения. Спрей области с 70% этанола раствор (рис. 6). Повторите смывки providone и этанола.
Примечание: В печени подвергается в несколько иной позиции в Гольштейн молочного скота, по сравнению с крупного рогатого скота. - Внедрить 2% лидокаин HCl (10-15 мл) локально в этот район для обеспечения анестезии кожи и мышц и соединительной ткани (рис. 7). Повторите providone и 70% этанол моет.
Примечание: Нервных окончаний в кожу и мышцы, но не внутренних органов, поэтому только местное anesthestic необходима. В большинстве корова только должны чувствовать некоторое давление и никакой боли во время процедуры биопсии. - Сделайте 1-2 см удар разрез через кожу межреберное пространство 10-11 (рис. 8). Пройти Schackelford-Кортни говядину биопсии печени инструмент через кожу и прямой инструмент биопсии в небольшой черепной направлении, продолжая через диафрагму и в печени (рис. 9, рис. 10). Получение выборки 1 g печени и удалить инструмент (рис. 11). Закройте кожи с размещением швов (Рисунок 12).
- Место печени образца в конической трубки с достаточно MIM для покрытия образца, на льду для немедленного митохондрий изоляции
- Проверка разрез для каких-либо покраснение, опухоль, тепло, или боль в течение 24 часов после биопсии и вводить коровы с 0,044 мл/кг веса Цефтиофур гидрохлорида подкожно в области шеи один раз в день в течение 3 дней (рис. 13). Контролировать температуру, потребление и фекальных баллы коровы ежедневно за 1 неделю после биопсии печени. Если развивается лихорадка, продолжают антибиотиков на усмотрение ветеринара.
Примечание: Если корова проявляет признаки боли, например ногами на разрез сайта, recumbancy, покраснение, тепло или реакции на ощупь в течение 1 ч после биопсии печени, 1 мг/кг веса тела IV инъекции меглумин flunixin может использоваться для облегчения боли и воспаления. Вторая инъекция может управляться при необходимости. - Удаление швов через 7 дней после биопсии.
2. изоляция митохондрий от коровы печени
- Как можно скорее после печени образец удаляется от коровы, мыть печени образца в MIM (шаг 1.3) для удаления красных кровяных клеток и мелко фарш образца с ножницами. Функции печени следует фарша в охлажденный стакан, содержащие достаточно изоляции СМИ держать влажной ткани.
- Положите фарш печени в стеклянный флакон 30 мл с тефлоновым пестиком 0,16 мм зазор инкубировали в лед и содержащие MIM (1:4 w/v).
- Однородный печени образца в тефлоновой пестиком в 500 об/мин мин с 4 тактов/мин.
Примечание: Печени огневки хранится в стакан льда Упакованные в МИМ в течение всего процесса, и выполнены все следующие шаги центрифугированием при температуре 4 ° C - Центрифуга огневки на 500 g x 10 мин, отменить Пелле, передача супернатант в охлажденной центрифуге трубку и затем центрифуга результате супернатант в 10000 x g за 10 мин до получения митохондриальной Пелле.
- Ресуспензируйте и помыть лепешка в 10 мл МИМ с BSA бесплатные жирные кислоты и центрифуги на 8100 x g для 10 минут удалить супернатант.
- Ресуспензируйте и помыть лепешка в 10 мл MIM без бесплатно ЗБТ жирные кислоты и центрифуги на 8100 x g для 10 минут удалить супернатант.
- Приостановить гранулы в 200 мкл изоляции СМИ и место на льду пока не используется для потребления кислорода и Протон утечки кинетическая анализов.
- Определите концентрацию белка гранул суспензии (1/100 разрежения) с помощью Bicinchoninic кислоты (BCA) комплект на производителя протокол с BSA как стандарт. Считается, что все белков митохондриальных белок.
3. измерение потребления митохондриальной кислорода (состояние государственных и 3 4)
- Создание СМИ потребления кислорода (OCM) из 120-мм KCl, 5 мм х2PO4, 5 мм MgCl2, 5 мм Hepes и 1 мм EGTA, рН 7,4 на 30 ° C с 0,3% обезжиренная BSA. Будет необходимо около 3 мл на сэмпл. Также подготовьте раствор 8 мкг/мл oligomycin в этиловом спирте.
- Инкубируйте OCM на 30 ° C. Настройка камеры, насос и кислорода электрода дыхания согласно инструкциям производителя (oxygraph система). Программное обеспечение oxygraph должен быть установлен на компьютере.
- 1 мл раствора OCM в камеру дыхания и размешивать энергично. Это поможет гарантировать, что решение становится насыщенным с воздухом.
- Добавить 0,35 мг белка митохондриальных белок в зале дыхания и поддержания температуры в 30 ° C.
- Запись потребление кислорода для примерно 5 мин. Так как дыхание увеличивает, концентрация кислорода уменьшается концентрация кислорода oxygraph системы записи. Когда потребление кислорода становится константа (снижение прямой), потребление кислорода записи (наклон линии = концентрация кислорода и времени). Это базовый уровень потребления кислорода.
- 1,25 мкл раствора ротенон 4 мм для ингибирования комплекс I и затем добавить 5 мкл раствора сукцината 1 М до конечной концентрации в зале дыхания сукцината 5 мм. Это состояние 4 дыхания.
- 1 мкл раствора ADP 100 мм до конечной концентрации в зале дыхания 100 мкм. Концентрация кислорода будет уменьшаться (увеличение дыхание) и затем после примерно 5 минут становится прямой линии. Записать потребление кислорода (наклон линии = концентрация кислорода и времени). Это состояние 3 дыхания.
- Дополнительно: В конце выполнения, добавьте FCCP (общий объем 0.2 мкм) чтобы побудить максимальной дыхания. Запись дыхания для около 5 минут (примерно). Когда потребление кислорода становится потребление кислорода постоянной, запись. Это потребление кислорода Максимальная.
- Вычислить дыхательных путей управления соотношение (RCR) с помощью уравнения состояния 3 потребление кислорода / государственный 4 потребление кислорода.
- Аспирационная все решения из камеры дыхания. Промойте отсек несколько раз с двойной деионизированной водой.
4. Измерение митохондриальной мембраны потенциал (СПП) и Протон движущей силой (PMF)
- Готовят раствор 80 nigericin нг/мл в этиловом спирте.
Примечание: Эти химические вещества растворяются в спирте, и следует приложить все усилия для ограничения количества этанола, который добавляется к менее чем в 1 мкл, поскольку этанол может расцепить транспортная система электронов и вызывают mitchondrial дисфункции. - После ополаскивания тщательно в камеру с двойной деионизированной воды, место 1 мл OCM в зале дыхания и размешивать энергично с баром магнитные перемешать. Это поможет гарантировать, что решение становится насыщенным с воздухом. Добавление метил илидами фосфониевых (TPMP +) чувствительных электрода для камеры установки. TPMP + Установка электрода должен быть подключен к рН метр, и значения считываются из рН метр.
- Добавьте 0,35 мг митохондриальных белок в зале дыхания.
- 1,25 мкл раствора 4 мм ротенон подавляют дыхание сложных I. запись для 2-5 мин (приблизительно). Когда потребление кислорода становится потребление кислорода постоянной, запись.
- Добавление 0,56 мкл 8 мкг/мл oligomycin раствора для конечной концентрации 2,8 мкг oligomycin /0.35 мг митохондриальных белок, чтобы препятствовать использованию ADP. Запись дыхания для 2-5 мин (приблизительно). Когда потребление кислорода становится потребление кислорода постоянной, запись.
- Добавьте 0,112 мкл 80 нг/мл nigericin решение упразднить градиента рН через внутреннюю мембрану митохондрий. Запись дыхания для 2-5 мин (приблизительно). Когда потребление кислорода становится потребление кислорода постоянной, запись.
Примечание: Ротенон и oligomycin используются для блокировки электрон-транспортной цепи в комплексе I и АТФ-синтаза, соответственно. Nigericin добавляется для преобразования трансмембранного H + градиент градиент K +, которая может быть измерена с электрода. - Подготовьте калибровочной кривой для TPMP +, добавив 5 мкл 10 мм TPMP + решения митохондриальной инкубации. Повторите этот шаг четыре раза, до тех пор, пока общая концентрация 2,5 мкм TPMP + была добавлена.
- Инициировать дыхания, добавив 5 мкл 1M сукцината в палату.
- Запись дыхание, до тех пор, пока вы достигли стабильного трассировки, а затем Титруйте системы путем добавления Дендримерные. Дополнения Дендримерные должна быть 0,5 мкл, 1 мкл, 1.5 мкл, 3.0 мкл, 6.0 мкл, 9.0 мкл, затем 12,5 мкл 0,1 Дендримерные решение для достижения последовательных добавлений Дендримерные концентраций в камере инкубации 0,1, 0,2, 0,3, 0,6, 1.2, 1.8 и 2,5 мм.
- Сбор данных из двух электродов (кислорода и TPMP+). Программное обеспечение для сбора данных от системы oxygraph может использоваться для сбора одновременного измерения потребления митохондриальной кислорода и митохондриальной мембранного потенциала и наблюдать за изменениями в потреблении кислорода в режиме реального времени. На рисунке 14 показано, как oxygraph система записывает потребление кислорода в ходе эксперимента.
- Вычислите ММП в МВ на основе уравнения Нернста:
ММП = 61,5 журнал ([TPMP +] добавлены – внешние [TPMP +]) x TPMP+ привязки коррекция / (0,001 x мг белка/мл x [TPMP +])
Используется привязка коррекция TPMP + 0,4 мг/мкл митохондриальных белок-1 .
Пример вычисления, основанные на концентрации в протоколе:
ММП = 61,5 x журнал (5 мкм-2 мкм) x 0,4 / (0,001 x 0,35 мг митохондриальных белок/мл x 2 µM)
ММП = 198,9 МВ - Оценка PMF путем построения графа ММП против потребления кислорода (рис. 15). PMF сообщается как потребление кислорода в мембранный потенциал 165 МВ.
Примечание: Титрования электрон-транспортной цепи с Дендримерные (0,1 до 2,5 мм) показывает кинетической ответ Протон утечки ММП. Затем заговор против потребления кислорода ММП определяет Протон утечки кинетики. PMF определяется путем расчета потребления кислорода на общих мембранного потенциала (165 МВ). - В конце последнего запуска образца добавьте FCCP (общий объем 0.2 мкм) вызвать максимальное дыхания и освободить TPMP + для коррекции базовой линии.
- Аспирационная все решения из камеры дыхания. Промойте отсек несколько раз с двойной деионизированной водой. В конце дня палата должна также быть промыть несколько раз этанола.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Позитивные результаты показаны RCR и Протон утечки кинетики показаны в таблице 1 и на рисунке 15, соответственно. В этом исследовании7, RCR и белка утечки кинетики были измерены в Гольштейн дойных коров на 70 дней в молоке после коров было подано 1 5 различных уровней, Cu, Zn и Mn в течение 28 дней. Состояние 4, максимальная Протон зависящих от утечки дыхания, имели тенденцию быть затронуты минеральных потребление и Cu...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Наиболее критической точки в протокол получения образца представитель ткани печени и начало изоляции митохондрий как можно скорее после биопсии. Вариации в измерениях дыхания является низкой (Таблица 1) из-за короткой транспортной время от коровы в лабораторию. Чтобы сократить время транспортировки, небольшая лаборатория была создана в офисе молочного, и печеночных проб были изгнаны в лаборатории офиса как каждый была собрана так что митохондрии были изолированы в течение 10 мин биопсии. Настройка и тест...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Это исследование было поддержано Оллтек и USDA Люк средства через центр здоровья животных пищевой UC Дэвис школа ветеринарной медицины.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Биопсия печени | |||
| strong>Equipment | |||
| Schackelford-Courtney инструмент для биопсии печени крупного рогатого скота | Sontec Instruments Englewood CO | 1103-904 | |
| Шовный материал | Fisher Scientific | 19-037-516 | |
| Иглы для швов | NA | В комплекте со швами | |
| Скальпели | Sigma - | Aldrich S2896 / S2646 | # для ручки и лезвий |
| Хирургические полотенца | Fisher Scientific | 50-129-6667 | |
| Соколиные пробирки 50 мл | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Пинцет | Sigma - Aldrich | Z168750 | |
| шприцы 50 мл | Fisher Scientific | 22-314387 | |
| Иглы для инъекций (22, 2 1/2) | VWR | MJ8881-200342 | |
| Ловец для коров | Tractor Supply Co. | ||
| Ватный тампон | Fisher Scientific | 14-959-102 | |
| ватные марлевые квадраты (4x4) | Fisher Scientific | 22-246069 | |
| Медицинские ножницы | Sigma - Aldrich | Z265969 | |
| Chemicals | |||
| Coccidiosis Vaccine 0.75 флакон/корова | Предоставлено Ветеринарная | ||
| клостридии | Предоставлена ветеринаром | ||
| Антибиотики для биопсии печени excenel 2 куб.см/100 фунтов в течение 3 дней | Предоставлено ветеринаром | ||
| Providone Scrub | Aspen Veteterinary Resources | 21260221 | |
| этанол 70% | Sigma - Олдрич | 793213 | |
| Ксилазина гидрохлорид 100 мг/мл в/в в дозе 0,010-0,015 мг/кг Масса | Предоставлено ветеринаром | ||
| 2% лидокаина гидрохлорида (10-15 мл) | Предоставлено ветеринаром | ||
| 1 мг/кг внутривенное введение флуниксина меглумина | Предоставлено ветеринаром | ||
| <стронг>Изоляция митохондрий (печени) | |||
| <сильный>Оборудование | |||
| Уитон флакон 30 мл с тефлоновым пестиком с зазором 0,16 мм | Fisher Scientific | 02-911-527 | |
| Гомогенизатор Мотор | Cole Parmer | EW-04369-10 | |
| Гомогенизатор Зонд | Cole Parmer | EW-04468-22 | |
| Автопипетка (10 мл) | Cole Parmer | SK-21600-74 | |
| Стакан (500 мл) со льдом | Fisher Scientific | FB100600 | |
| Охлаждаемые микрофуги | Fisher Scientific | 75-002-441EW3 | |
| Микрофуге пробирки (1,5 мл) | Fisher Scientific | AM12400 | |
| Chemicals | |||
| Bicinchoninic acid (BCA) набор для анализа белка (микропланшеты для планшетного ридера) | abcam | ab102536 | |
| Sucrose | Sigma - Aldrich | S7903-1KG | |
| Tris-HCl | Sigma - Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma - Aldrich | EDS-1KG | |
| BSA (без жирных кислот) | Sigma - Aldrich | A7030-50G | |
| Mannitol | Sigma - Aldrich | M4125-1KG | |
| Деионизированная вода | Sigma - Aldrich | 38796 | |
| Hepes | Sigma - Aldrich | H3375-500G | |
| Используется для создания изоляционных сред митохондрий: 220 мМ маннита, 70 мМ сахарозы, 20 мМ HEPES, 20 мМ Tris-HCl, 1 мМ ЭДТА и 0,1% (w/v) без жирных кислот BSA, pH 7,4 при 4 °°; C, продержится 2 дня в холодильнике | |||
| <сильно>Митохондриальное кислородное соединение | |||
| <сильное>Оборудование | |||
| Настройка оксиграфа + кислородный электрод типа Кларка | Hansatech (PP Systems) | Терморегулируемый | |
| MLE2001 | |||
| Кислородный электрод типа Clark | NA NA | ||
| Автопипетка (1 мл) | Cole Parmer | SK-21600-70 | В комплекте с |
| Oxy1 Малая магнитная мешалка | Fisher Scientific | 14-513-95 | |
| Микропипетка (10 μ L) | Cole Parmer | SK-21600-60 | |
| pH-метр | VWR | ||
| strong>Chemicals | |||
| KCl | Sigma - Aldrich | P9333-1KG | |
| Hepes | Sigma - Aldrich | H3375-500G | |
| KH2PO4 | Sigma - Aldrich | P5655-1KG MgCl2 Sigma - Aldrich P5655-1KG | |
| MgCl2 | Sigma - Aldrich | M1028-100ML | |
| EGTA | Sigma - Aldrich | E3889-100G | |
| Используется для изготовления сред потребления кислорода в митохондриях: 120 мМ KCL, 5 мМ KH2PO4, 5 мМ MgCl2, 5 мМ Hepes и 1 мМ EGTA, pH 7,4 при 30 °°; C с 0,3% обезжиренным BSA | |||
| Rotenone (4 мМ раствор) | Sigma - Aldrich | R8875-5G | |
| Succinate (1 М раствор) | Sigma - Aldrich | S3674-250G | |
| ADP (100 мМ раствор) | Sigma - Aldrich | A5285-1G | |
| Олигомицин (раствор 8 мкм; г/мл в этаноле) | Sigma - Aldrich | 75351 | |
| FCCP | Sigma - Aldrich | C2920 | |
| Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force< | |||
| strong>Equipment | |||
| TPMP электрод | World Precision Instruments. | DRIREF-2 | |
| <сильно>Химические растворы не обязательно должны быть свежими, но их нужно хранить в морозильной камере между прогонами | |||
| Малонат (0,1 мМ раствор) | Sigma - Aldrich | M1296 | |
| Олигомицин (8 г/мл в этаноле), хранить в морозильной камере | Sigma - Aldrich | 75351 | |
| Nigericin (80 нг/мл в этаноле), хранить в морозильной камере | Sigma - Aldrich | N7143 | |
| FCCP | Sigma - Aldrich | C3920 | |
| TPMP | Sigma - Aldrich | T200 | |
| TPMP раствор: 10 мМ TPMP, 120 мМ KCL, 5 мМ Hepes и 1 мМ EGTA, pH 7,4 при 30 &d; C с 0,3% обезжиренного BSA |
Ссылки
- Brand, M. D., Divakaruni, A. S. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology. 26, 192-205 (2011).
- Stephenson, E. J., Hawley, J. A. Mitochondrial function in metabolic health: A genetic and environmental tug of war. Biochimica et Biophysica Acta. 1840, 1285-1294 (2014).
- Bartlett, K., Eaton, S. Mitochondrial B oxidation. European Journal of Biochemistry. 271, 462-469 (2004).
- Acetoze, G., Kurzbard, R., Klasing, K. C., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Oxygen Consumption, Respiratory Control Ratio (RCR) and Mitochondrial Proton Leak of broilers with and without growth enhancing levels of minerals supplementation challenged with Eimeria maxima (Ei). Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 101, e210-e215 (2016).
- Wallace, D. C., Fan, W. Energetics, epigenetics, mitochondrial genetics. Mitochondrion. 10, 12-31 (2010).
- Paradies, G., Petrosillo, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M. Oxidative stress, mitochondrial bioenergetics and cardiolipin in aging. Free Radicals in Biology and Medicine. 48, 1286-1295 (2010).
- Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Liver mitochondrial oxygen consumption and efficiency of milk production in lactating Holstein cows supplemented with Copper, Manganese and Zinc. Journal of Animal Physiology Animal Nutrition. 102, e787-e797 (2017).
- Brown, D. R., DeNise, S. K., McDaniel, R. G. Mitochondrial respiratory metabolism and performance of cattle. Journal of Animal Science. 66, 1347-1354 (1988).
- Golden, M. S., Keisler, J. W., H, D. The relationship between mitochondrial function and residual feed intake in Angus steers. Journal of Animal Science. 84, 861-865 (2006).
- Lancaster, P. A., Carstens, G. E., Michal, J. J., Brennan, K. M., Johnson, K. A., Davis, M. E. Relationships between residual feed intake and hepatic mitochondrial function in growing beef cattle. Journal of Animal Science. 92, 3134-3141 (2014).
- Acetoze, G., Weber, K. L., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. Relationship between liver mitochondrial respiration and proton leak kinetics in low and high RFI steers from two lineages of RFI Angus bulls. ISRN Vet Sci. 2015 (194014), (2015).
- Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. Protection against oxidants in biological systems: The superoxide theory of oxygen toxicity. Free Radicals in Biology and Medicine. , Oxford University Press. Oxford. 186-187 (1989).
- National Research Council. Nutrient Requirements of Dairy Cattle. , 7th revised edition, National Academy Press. Washington, DC. (2001).
- Ramsey, J. J., Harper, M. E., Weindruch, R. Restriction of energy intake, energy expenditure, and aging. Free Radical Biology and Medicine. 29, 946-968 (2000).
- Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. Mitochondrial control of immunity: beyond ATP. Nature. 17, 608-620 (2017).
- Kirby, D. M., Thorburn, D. R., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. Biochemical assays of respiratory chain complex activity. Methods in Cell Biology. 80, 93-119 (2007).
- Alex, A. P., Collier, J. L., Hadsell, D. L., Collier, R. J. Milk yield differences between 1x and 4x milking are associated with changes in mammary mitochondrial number and milk protein gene expression, but not mammary cell apoptosis or SOCS gene expression. Journal of Dairy Science. 98, 4439-4448 (2015).
- Lossa, S., Lionetti, L., Mollica, M. P., Crescenzo, R., Botta, M., Barletta, A., Liverini, G. Effect of high-fat feeding on metabolic efficiency and mitochondrial oxidative capacity in adult rats. British Journal of Nutrition. 90, 953-960 (2003).
- Boily, G., Seifert, E. L., Bevilacqua, L., He, X. H., Sabourin, G., Estey, C., Moffat, C., Crawford, S., Saliba, S., Jardine, K., Xuan, J., Evans, M., Harper, M. E., McBurney, M. W. SirT1 regulates energy metabolism and response to caloric restriction in mice. PloS One. 3 (3), e1759(2008).
- Chen, Y., Hagopian, K., Bibus, D., Villaba, J. M., Lopez-Lluch, G., Navas, P., Kim, K., McDonald, R. B., Ramsey, J. J. The influence of dietary lipid composition on liver mitochondria from mice following 1 month of calorie restriction. Bioscience Reports. 33, 83-95 (2013).
- Chacko, B. K., Kramer, P. A., Ravi, S., Benavides, G. A., Mitchell, T., Dranka, B. P., Ferrick, D., Singal, A. K., Ballinger, S. W., Bailey, S. M., Hardy, R. W., Zhang, J., Zhi, D., Darley-Usmar, V. M. The bioenergetic health index: a new concept in mitochondrial translational research. Clinical Science. 127, 367-373 (2014).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
