Здесь мы разделяем методы для измерения потребления митохондриальной кислорода, определяющих концепцию питания энергетики и Протон утечки, основной причиной неэффективности в митохондриальной генерации АТФ. Эти результаты можно приходится 30% энергии, потеряли в утилизации питательных веществ, чтобы помочь оценить функции митохондрий.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Измерение потребления кислорода печени митохондриальных и Протон утечки кинетики оценить митохондриальное дыхание в Гольштейн молочного скота
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Потребление кислорода, Протон мотив силы (PMF) и Протон утечки являются измерения митохондриальное дыхание, или насколько хорошо митохондрий в состоянии преобразовать NADH и ГВС в СПС. Так как митохондрии также основной сайт для использования кислорода и питательных веществ Окисление диоксида углерода и воды, насколько эффективно они используют кислород и производят АТФ непосредственно относится к эффективности обмена питательных веществ, потребности в питательных веществах животных, и состояние здоровья животного. Этот метод предназначен для изучения митохондриальное дыхание, который может использоваться для изучения воздействия различных препаратов, диеты и воздействия на окружающую среду на митохондриальной метаболизм. Результаты включают потребление кислорода, измеряется как Протон зависит от дыхания (статья 3) и Протон утечки зависит от дыхания (состояние 4). Отношение государства 3 / государственный 4 дыхания определяется как отношение дыхательных путей управления (RCR) и может представлять митохондриальной энергетической эффективности. Митохондриальной Протон утечки является процесс, который позволяет диссипации митохондриальной мембраны потенциальных (СПП) расцеплять окислительного фосфорилирования от ADP, снижается эффективность синтеза АТФ. Кислород и TRMP + чувствительной электроды с митохондриальных субстратов и ингибиторы цепи переноса электронов используются для измерения состояния 3 и 4 государства дыхания, Митохондриальные мембраны PMF (или потенциал для производства АТФ) и Протон утечки. Ограничения этого метода, что ткани печени должны быть как можно более свежей и все биопсии и анализы должны быть выполнены в менее чем 10 h. Это ограничивает количество выборок, которые могут быть собраны и обработаны один человек в день около 5. Однако только в 1 г ткани печени необходима, поэтому в крупных животных, таких как молочного скота, количество образцов необходимо мал по сравнению с печени размер и мало времени восстановления требуется.
Введение
Митохондрии являются очень чувствительными к стресс и их клеточной среды может способствовать широкий спектр метаболических заболеваний. Протон утечки в митохондриях и потребление кислорода являются показателями здоровья митохондрий. Методы, описанные в этой бумаге смета митохондриальной энергоэффективности с помощью RCR, основанные на потребление кислорода с и без утечки Протон. Эти результаты можно приходится 30% энергии, потеряли в утилизации питательных веществ1. Изменения в утечки Протон и потребления кислорода может идентифицировать митохондриальной дисфункции, которая способствует метаболические болезни и приводит к снижению энергетическ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все методы, протокол и исследований, описанных здесь были утверждены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из университета Калифорнии, Дэвис.
1. получение биопсия печени от Гольштейн молочные коровы
Примечание: Биопсия печени должны выполняться лицензированных ветеринаром. Биопсии печени может выполняться на узле молочные, где расположены коров. Молочных коров может продолжать нормально доят и молоко не нужно быть выведены от продуктов питания до или после процедуры. Рекомендуется, что по крайней мере 4 человек необходимы для выполнения биопсии печени на молочные коровы: ветеринар для выпо....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Позитивные результаты показаны RCR и Протон утечки кинетики показаны в таблице 1 и на рисунке 15, соответственно. В этом исследовании7, RCR и белка утечки кинетики были измерены в Гольштейн дойных коров на 70 дней в молоке после коров было подано 1 5 различных уровней, Cu, Zn и Mn в течение 28 дней. Состояние 4, максимальная Протон зависящих от утечки дыхания, имели тенденцию быть затронуты минеральных потребление и Cu.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Наиболее критической точки в протокол получения образца представитель ткани печени и начало изоляции митохондрий как можно скорее после биопсии. Вариации в измерениях дыхания является низкой (Таблица 1) из-за короткой транспортной время от коровы в лабораторию. Чтобы сократить время транспортировки, небольшая лаборатория была создана в офисе молочного, и печеночных проб были изгнаны в лаборатории офиса как каждый была собрана так что митохондрии были изолированы в течение 10 мин биопсии. Настройка и тест.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Это исследование было поддержано Оллтек и USDA Люк средства через центр здоровья животных пищевой UC Дэвис школа ветеринарной медицины.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Биопсия печени | |||
| strong>Equipment | |||
| Schackelford-Courtney инструмент для биопсии печени крупного рогатого скота | Sontec Instruments Englewood CO | 1103-904 | |
| Шовный материал | Fisher Scientific | 19-037-516 | |
| Иглы для швов | NA | В комплекте со швами | |
| Скальпели | Sigma - | Aldrich S2896 / S2646 | # для ручки и лезвий |
| Хирургические полотенца | Fisher Scientific | 50-129-6667 | |
| Соколиные пробирки 50 мл | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Пинцет | Sigma - Aldrich | Z168750 | |
| шприцы 50 мл | Fisher Scientific | 22-314387 | |
| Иглы для инъекций (22, 2 1/2) | VWR | MJ8881-200342 | |
| Ловец для коров | Tractor Supply Co. | ||
| Ватный тампон | Fisher Scientific | 14-959-102 | |
| ватные марлевые квадраты (4x4) | Fisher Scientific | 22-246069 | |
| Медицинские ножницы | Sigma - Aldrich | Z265969 | |
| Chemicals | |||
| Coccidiosis Vaccine 0.75 флакон/корова | Предоставлено Ветеринарная | ||
| клостридии | Предоставлена ветеринаром | ||
| Антибиотики для биопсии печени excenel 2 куб.см/100 фунтов в течение 3 дней | Предоставлено ветеринаром | ||
| Providone Scrub | Aspen Veteterinary Resources | 21260221 | |
| этанол 70% | Sigma - Олдрич | 793213 | |
| Ксилазина гидрохлорид 100 мг/мл в/в в дозе 0,010-0,015 мг/кг Масса | Предоставлено ветеринаром | ||
| 2% лидокаина гидрохлорида (10-15 мл) | Предоставлено ветеринаром | ||
| 1 мг/кг внутривенное введение флуниксина меглумина | Предоставлено ветеринаром | ||
| <стронг>Изоляция митохондрий (печени) | |||
| <сильный>Оборудование | |||
| Уитон флакон 30 мл с тефлоновым пестиком с зазором 0,16 мм | Fisher Scientific | 02-911-527 | |
| Гомогенизатор Мотор | Cole Parmer | EW-04369-10 | |
| Гомогенизатор Зонд | Cole Parmer | EW-04468-22 | |
| Автопипетка (10 мл) | Cole Parmer | SK-21600-74 | |
| Стакан (500 мл) со льдом | Fisher Scientific | FB100600 | |
| Охлаждаемые микрофуги | Fisher Scientific | 75-002-441EW3 | |
| Микрофуге пробирки (1,5 мл) | Fisher Scientific | AM12400 | |
| Chemicals | |||
| Bicinchoninic acid (BCA) набор для анализа белка (микропланшеты для планшетного ридера) | abcam | ab102536 | |
| Sucrose | Sigma - Aldrich | S7903-1KG | |
| Tris-HCl | Sigma - Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma - Aldrich | EDS-1KG | |
| BSA (без жирных кислот) | Sigma - Aldrich | A7030-50G | |
| Mannitol | Sigma - Aldrich | M4125-1KG | |
| Деионизированная вода | Sigma - Aldrich | 38796 | |
| Hepes | Sigma - Aldrich | H3375-500G | |
| Используется для создания изоляционных сред митохондрий: 220 мМ маннита, 70 мМ сахарозы, 20 мМ HEPES, 20 мМ Tris-HCl, 1 мМ ЭДТА и 0,1% (w/v) без жирных кислот BSA, pH 7,4 при 4 °°; C, продержится 2 дня в холодильнике | |||
| <сильно>Митохондриальное кислородное соединение | |||
| <сильное>Оборудование | |||
| Настройка оксиграфа + кислородный электрод типа Кларка | Hansatech (PP Systems) | Терморегулируемый | |
| MLE2001 | |||
| Кислородный электрод типа Clark | NA NA | ||
| Автопипетка (1 мл) | Cole Parmer | SK-21600-70 | В комплекте с |
| Oxy1 Малая магнитная мешалка | Fisher Scientific | 14-513-95 | |
| Микропипетка (10 μ L) | Cole Parmer | SK-21600-60 | |
| pH-метр | VWR | ||
| strong>Chemicals | |||
| KCl | Sigma - Aldrich | P9333-1KG | |
| Hepes | Sigma - Aldrich | H3375-500G | |
| KH2PO4 | Sigma - Aldrich | P5655-1KG MgCl2 Sigma - Aldrich P5655-1KG | |
| MgCl2 | Sigma - Aldrich | M1028-100ML | |
| EGTA | Sigma - Aldrich | E3889-100G | |
| Используется для изготовления сред потребления кислорода в митохондриях: 120 мМ KCL, 5 мМ KH2PO4, 5 мМ MgCl2, 5 мМ Hepes и 1 мМ EGTA, pH 7,4 при 30 °°; C с 0,3% обезжиренным BSA | |||
| Rotenone (4 мМ раствор) | Sigma - Aldrich | R8875-5G | |
| Succinate (1 М раствор) | Sigma - Aldrich | S3674-250G | |
| ADP (100 мМ раствор) | Sigma - Aldrich | A5285-1G | |
| Олигомицин (раствор 8 мкм; г/мл в этаноле) | Sigma - Aldrich | 75351 | |
| FCCP | Sigma - Aldrich | C2920 | |
| Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force< | |||
| strong>Equipment | |||
| TPMP электрод | World Precision Instruments. | DRIREF-2 | |
| <сильно>Химические растворы не обязательно должны быть свежими, но их нужно хранить в морозильной камере между прогонами | |||
| Малонат (0,1 мМ раствор) | Sigma - Aldrich | M1296 | |
| Олигомицин (8 г/мл в этаноле), хранить в морозильной камере | Sigma - Aldrich | 75351 | |
| Nigericin (80 нг/мл в этаноле), хранить в морозильной камере | Sigma - Aldrich | N7143 | |
| FCCP | Sigma - Aldrich | C3920 | |
| TPMP | Sigma - Aldrich | T200 | |
| TPMP раствор: 10 мМ TPMP, 120 мМ KCL, 5 мМ Hepes и 1 мМ EGTA, pH 7,4 при 30 &d; C с 0,3% обезжиренного BSA |
Ссылки
- Brand, M. D., Divakaruni, A. S. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology. 26, 192-205 (2011).
- Stephenson, E. J., Hawley, J. A. Mitochondrial function in metabolic health: A genetic and environmental tug of war. Biochimica ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
