Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Подостром мозгового Microhemorrhages, вызванных инъекции липополисахарида в крыс

6.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58423

⸱

17 октября 2018 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Second Hospital of Shanxi Medical University, 2Department of Neurology, PLA Army General Hospital, 3Department of Neurology, NO 261 Hospital of PLA

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем протокол побудить и обнаружить, что CMHs, вызванные LPS инъекций в крысах Sprague-Dawley, которые могут быть использованы в будущих исследований на патогенез CMHs.

Аннотация

Церебральным microhemorrhages (CMHs) являются общими у пожилых пациентов и связаны с различными нервно-психических расстройств. Этиология CMHs является сложным, и neuroinflammation часто наблюдаются как сопредседатель возникновение. Здесь мы описываем подостром CMHs крысы модель индуцированных инъекции липополисахарида (LPS), а также метод для обнаружения CMHs. Системные LPS инъекции является относительно простой, экономичный и экономически эффективным. Одним из основных преимуществ LPS инъекции является его стабильность, чтобы вызвать воспаление. CMHs, вызванные LPS инъекции могут быть обнаружены брутто наблюдения, гематоксилином и (он) эозином, Perl прусский окрашивание, Эванс синий (EB) двойной маркировки и магнитно резонансная томография восприимчивость взвешенный технологии визуализации (МРТ-SWI). Наконец другие методы разработки CMHs животных моделей, включая их преимущества и недостатки, также обсуждаются в настоящем докладе.

Введение

Классическая мозгового microhemorrhages (CMHs) относятся к крошечные периваскулярной отложения продуктов разложения крови как гемосидерин от красных кровяных клеток в мозг1. По данным сканирования исследования Роттердам CMHs можно найти почти 17,8% лиц в возрасте 60-69 лет, 38,3% в тех, кто старше 80 лет2. Распространенность CMHs в пожилом возрасте является относительно высокой, и корреляции между накоплением CMHs и когнитивные и психоневрологических дисфункции был установленным3,4. Недавно сообщалось несколько животных моделей CMHs, включая грызунов модели индуцированных типа IV коллагеназы стереотаксического инъекций5, APP трансгенных6, β-N-метиламино L-аланина воздействия7и8гипертонии с CMHs индуцированных внутрирастительного воспаления, как один из вариантов, наиболее широко признанным. Фишер и др. 9 впервые использован LPS, производные от сальмонеллы typhimurium разработать модель мыши острый CMHs. Впоследствии же группа сообщила о разработке подостром CMHs мыши модели с использованием же подход2.

LPS рассматривается как стандартизированные воспалительных стимул через внутрибрюшинной инъекции. Предыдущие исследования подтвердили, что LPS инъекции может привести к neuroinflammation, как свидетельствует большое количество Микроглия и экзоцитоз активации в животных моделей2,10. Кроме того положительная корреляция между активацией neuroinflammation активации и количество CMHs был установленным2,10. Основываясь на этих предыдущих исследований, мы были предложено разработать модель CMHs крыса внутрибрюшинной инъекцией LPS.

Достижения в обнаружения технологии привели к увеличению числа исследований на CMHs. Наиболее широко признается, методы обнаружения CMHs включают обнаружение красных кровяных клеток гематоксилином и эозином (он), окрашивание, обнаружения железа железа, лазурь, окрашивание9, обнаружение Эванс синий осаждения (EB), иммунофлюоресценции изображений и 7.0 Тесла магнитно резонансная томография восприимчивость взвешенных изображений (МРТ-SWI)10. Настоящее исследование стремится разработать метод скрининга для CMHs.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все методы, описанные здесь были одобрены животное уход и использование Комитета (ACUC) из госпиталя НОАК генерал армии.

1. материалы

  1. Подготовка LPS инъекции
    1. Добавьте 25 мл дистиллированной воды до 25 мг порошка LPS, производный от S. typhimurium до конечной концентрации 1 мг/мл. Магазин инъекции в стерильную пробирку при 4 ° C.
      Предупреждение: LPS является токсичным.
    2. Приготовляют раствор 2% EB в нормальный физиологический раствор 0,9% держать EB инъекций на рабочие концентрации.

2. Животные

  1. Администрировать LPS крысах Sprague-Dawley (SD), в возрасте 10 недель (средний вес: 280 ± 20 г) внутрибрюшинной инъекцией.
    Предупреждение: Если крысы закупаются из другой организации, то адаптивной фаза не следует менее чем за 7 дней.

3. LPS инъекции

  1. Каждый крыса в дозе 1 мг/кг внутрибрюшинно придать ПЛАСТИНОК и вернуть их домой клетки крыс.
    Примечание: Анестезия не является необходимым.
  2. Шесть часов спустя, придать ту же дозу LPS инъекции в крыс.
  3. Шестнадцать часов спустя придать ту же дозу LPS в крыс.
    ВНИМАНИЕ: Инъекций SD крыс с ПЛАСТИНОК в дозе 1 мг/кг может привести к 5% смертности. Уровень смертности может дополнительно увеличить в молодых или старых крыс или беременных самок.
  4. Вернуть их клетках крыс после инъекции ПЛАСТИНОК и ad libitum доступ к еды и питья.
    Примечание: Крысы представят различные системного воспалительного ответа, и таким образом, важно, что клетки остаются чистыми на протяжении всего эксперимента. Крысы должны быть часто (2 x в день) мониторинг для веса, общий внешний вид и отношение после первой инъекции ПЛАСТИНОК. Если крысы начинают проявлять Сгорбленная осанка, нежелание двигаться, значительная потеря веса (> 20%), порфирина пятнать что они гуманно euthanized до 7 дней EB исследование конечной точки.

4. образец коллекции

  1. Инъекции EB
    1. Через семь дней после первой инъекции, анестезировать крыса, внутрибрюшинно согласно утвержденным протокол IACUC.
    2. Подождите 1 – 2 мин, пока крысы не показывать роговицы рефлекторные реакции. Выполните 5 – 8 мм-глубокой сердечной проколов на каждом крыса; puncturing точкой должно быть 5 мм до левого края грудины на 3-м и 4-м межреберье.
    3. Подождите, пока восстановление крови наблюдается и затем внедрить EB в дозе 0,2 мл/100 г веса тела в желудочка левого сердца.
      Предупреждение: Пункции сердца и EB впрыска должно тщательно выполняться. EB может быть введен в грудной полости или перикарда вместо желудочка левого сердца.
      1. Сосать обратно с пустой трубы и заменить этот объем EB трубки перед инъекцией, чтобы помочь уменьшить коэффициент отказа (например., инъекции, чтобы грудная клетка по ошибке).
    4. Держите крыса в лежачем положении на 10 мин.
      Примечание: Если образец не используется для обнаружения утечки EB в иммунофлуоресценции изображений, то этот шаг может быть опущен.
  2. Брутто наблюдения
    1. Выполняйте сердечной орошений, используя ледяной буфера 1 М фосфатный (PBS) очистить мозгового сосудистую и мозги.
      1. С помощью скальпеля, сделайте разреза брюшной полости через всю длину диафрагмы.
      2. Разрез через ребра просто слева от срединной линии грудной клетки.
      3. Откройте грудной полости. Используйте зажимы, подвергать сердце и облегчить дренажной крови и других жидкостей.
      4. Удерживая неуклонно сердце с щипцами (сердце по-прежнему должны избиение), напрямую вставить иглу в выступ левого желудочка продлить это на около 5 мм. Зафиксируйте иглы в этой позиции, зажимные вблизи точки входа.
        Предупреждение: Не чрезмерно расширить иглы, как он может пробить стену и нарушить циркуляцию решений.
      5. Освободите клапан, чтобы разрешить поток ледяной решения PBS (200 – 300 мл) со скоростью медленный и стабильный около 20 мл/мин с помощью перфузионного насоса. Если животные требуют фиксации вместо валового наблюдения, затем используйте той же дозе ледяные 0,9% физиологического раствора.
      6. С помощью острых ножниц, надрезать в атриуме, обеспечивая, что решение постоянно течет. Если жидкость не течет свободно или приходит от животного нос или рот, перемещения иглы.
    2. Экран для CMHs валовой наблюдения.
      Примечание: Если образец не используется в расчете числа CMHs валовой наблюдения, то этот шаг может быть опущен.
  3. Фиксация
    1. Выполняйте сердечной орошений, используя ледяной 0,9% соляной раствор (200 – 300 мл) очистить мозгового сосудистую и мозги.
    2. Выполняйте сердечной орошений, используя ледяной параформальдегида 4% для фиксации.
    3. Обезглавить крыса, изолировать мозга и погружать мозга в 20% растворе сахарозы для по крайней мере 6 часов.
    4. Изменить решение в 30% сахарозы и исправление еще 6 h.
  4. Подготовка 10 мм толстой мозга тканей разделов с помощью криостата.

5. он пятнать

Примечание: Эта процедура выполняется с помощью окрашивания комплект он.

  1. Вымойте слайды в дистиллированной воде.
  2. Пятно в растворе гематоксилином 8 мин мыть в проточной водой в течение 5 мин.
  3. Дифференцировать кислоты спиртовой 1% для 30 s. мыть в проточной водой за 1 мин.
  4. Пятно в 0,2% аммиачной воды (воронение) или насыщенных лития карбоната решение для 30 s до 1 мин вымыть проточной водой в течение 5 мин.
  5. Промыть в 95% спирте (10 провалы).
  6. Изображение с раствором эозина для 30 s до 1 мин.
  7. Обезвоживанию через 95% спирта, два изменения абсолютного алкоголя, 5 мин.
  8. В ксилоле 30 s.
  9. Прикрепите с помощью метода Лю в9.
  10. Анализ с помощью микроскопа флуоресценции brightfield.
    Примечание: красные кровяные клетки освобожден из кровеносных сосудов, которые являются компонентами CMHs, появляются в красно оранжевый под он пятнать.

6. Perl лазурь пятнать

Примечание: Эта процедура выполняется с помощью Перлз Комплект окрашивание.

  1. Вымойте слайды с дистиллированной водой.
  2. Пятно в реакции раствора с смесь равных частей Ферроцианид и соляной кислоты на 10 мин.
  3. Обезвоживать, очистить, смонтировать и анализировать слайды, как описано в шагах 5,7-5.10.

7. EB двойной окрашивание

Примечание: Эта процедура следующим шагом 4.1.3.

  1. Вымойте слайды с PBS три раза за 5 мин.
  2. Инкубируйте слайды с 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) решение для 15 мин при комнатной температуре.
  3. Вымойте слайды с PBS решения три раза за 5 мин и смонтировать слайды с PBS-глицерола раствор.
  4. Анализ изображений на флуоресцентным микроскопом. Осаждения EB обозначается красной флуоресценцией; ядра помечаются голубой флуоресценцией.

8. МРТ SWI

  1. Выполните МРТ на магнит 7-T оснащены системой активно экранированный градиента (внутренний диаметр 16 см).
  2. Через семь дней после лечения, анестезировать крысы вдыханием маску изофлюрановая 1,5 – 2,0%, с использованием системы изофлюрановая анестезии.
  3. Примените мазь ветеринар на глазах крысы для предотвращения сухости под наркозом.
  4. Держите крыс в лежачем положении и выполнить проверку МРТ-SWI.
  5. Получения SWI взвешенный сканирование с помощью последовательности быстро спиновое эхо, используя следующие параметры: эхо времени (TE) 8 мс, повторение время (TR) 40 мс, флип угол = 12°, поле зрения (FOV) 35 mm × 35 мм, приобретение матрица 384 × 384, приобрести 1 мм толщиной ломтиками.
  6. Определить CMHs в МРТ-SWI согласно Гринберг и др. 11, которая включала следующие критерии: (1) диаметром крупностью до 10 мм и (2) круговой, изолированных и низким сигнал интенсивность пятен.
  7. В конце эксперимента усыпить крыс с помощью метода передозировке двуокиси углерода (расход 6 Л/мин) или 30% от объема контейнера.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

CMHs могут быть обнаружены с использованием различных подходов. Наиболее широко признанным методы включают следующее: (1) валового наблюдение и оценку поверхности CMHs (показано на рис. 1, верхняя группа); (2) он пятная для обнаружения красных кровяных клеток (показано на рисунке 2А, верхняя панель) или прусского пятнать детектирования железа железа производный от lysis красных кровяных клеток (рис. 2A

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Исследования на CMHs увеличились в последние несколько лет. Однако механизм CMHs остается неясным, что побудило ученых создать Животные модели, которые имитируют это особое состояние. Например, Хоффман и др. разработал гипоксия индуцированной CMHs мыши модель, которая показывает, что CMHs вызванных гипоксией и нарушение цереброваскулярные саморегуляции12. Рейтера и др. 5 создана модель CMHs в APP23-трансгенных мышей, которые показали, что Церебральный амил...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы благодарим учитель Цзянь Фэн леев и коллеги из столицы медицинский университет для указания во время МРТ. Мы также благодарим Цзэн Цзин от кафедры неврологии, Yichang второй человек госпиталь для оказания технической поддержки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ЛПСSigma-AldrichL-2630для индукции воспаления
EBSigma-aldrichE2129для обнаружения утечки ЭБ
DAPI умирающий растворServicbioG1012для подсчета среды для IF
Perl' s Прусское окрашиваниеSolarbioG1424Набор для прусского окрашивания
HE-окрашиваниеSolarbioG1120Набор для окрашивания HE
хлоралгидратSigma-Aldrich47335UДля анестезии
фосфатный буферный раствор (PBS)SolarbioP1022разновидность буферного раствора, обычно используемого в эксперименте
0,9% физиологического раствораHainan DonglianChangfu Pharmaceutical Co., Ltd., Китайраствор для перфузии
параформальдегидSigma-Aldrich158127вид раствора, обычно используемый для фиксации
20% раствор сахарозыSolarbioG2461вид раствора, обычно используемый для фиксации
30% раствор сахарозыSolarbioG2460вид раствора, обычно используемый для фиксации
ветеринарная мазьSolcoseryl eye gel, Bacel, Швейцариядля защиты глаз от крыс

Ссылки

  1. Sumbria, R. K., et al. A murine model of inflammation-induced cerebral microbleeds. J Neuroinflammation. 13 (1), 218(2016).
  2. Vernooij, M. W., et al. Prevalence and risk factors of cerebral microbleeds the Rotterdam Scan Study. Neurology. 70 (14), 1208-1214 (2009).
  3. Pettersen, J. A., et al. Microbleed topography, leukoaraiosis, and cognition in probable Alzheimer disease from the Sunnybrook dementia study. Archives of Neurology. 65 (6), 790-795 (2008).
  4. Xu, X., et al. Cerebral microbleeds and neuropsychiatric symptoms in an elderly Asian cohort. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 88 (1), 7-11 (2017).
  5. Mcauley, G., Schrag, M., Barnes, S., Obenaus, A., Dickson, A., Kirsch, W. In vivo iron quantification in collagenase-induced microbleeds in rat brain. Magnetic Resonance in Medicine. 67 (3), 711-717 (2012).
  6. Reuter, B., et al. Development of cerebral microbleeds in the APP23-transgenic mouse model of cerebral amyloid angiopathy-a 9.4 tesla MRI study. Frontiers in Aging Neuroscience. 8 (8), 170(2016).
  7. Scott, L. L., Downing, T. G. A single neonatal exposure to BMAA in a rat model produces neuropathology consistent with neurodegenerative diseases. Toxins. 10 (1), E22(2018).
  8. Toth, P., et al. Aging exacerbates hypertension-induced cerebral microhemorrhages in mice: role of resveratrol treatment in vasoprotection. Aging Cell. 14 (3), 400-408 (2015).
  9. Liu, S., et al. Comparative analysis of H&E and Prussian blue staining in a mouse model of cerebral microbleeds. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (11), 767-773 (2014).
  10. Zeng, J., Zhào, H., Liu, Z., Zhang, W., Huang, Y. Lipopolysaccharide induces subacute cerebral microhemorrhages with involvement of Nitric Oxide Synthase in rats. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 27 (7), 1905-1913 (2018).
  11. Greenberg, S. M., et al. Cerebral microbleeds: A guide to detection and interpretation. Lancet Neurology. 8 (2), 165-174 (2009).
  12. Hoffmann, A., et al. High-Field MRI reveals a drastic increase of hypoxia-induced microhemorrhages upon tissue reoxygenation in the mouse brain with strong predominance in the olfactory bulb. Plos One. 11 (2), e0148441(2016).
  13. Sumbria, R. K., et al. Effects of phosphodiesterase 3A modulation on murine cerebral microhemorrhages. Journal of Neuroinflammation. 14 (1), 114(2017).
  14. Sumbria, R. K., et al. Aging exacerbates development of cerebral microbleeds in a mouse model. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 69(2018).
  15. Mello, B. S. F., et al. Sex influences in behavior and brain inflammatory and oxidative alterations in mice submitted to lipopolysaccharide-induced inflammatory model of depression. Journal of Neuroimmunol. 320, 133-142 (2018).
  16. Souza, D. F. D., et al. Changes in astroglial markers in a maternal immune activation model of schizophrenia in Wistar rats are dependent on sex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (489), (2015).
  17. Dutta, G., Zhang, P., Liu, B. The Lipopolysaccharide Parkinson's disease animal model: mechanistic studies and drug discovery. Fundamental & Clinical Pharmacology. 22 (5), 453-464 (2008).
  18. El-Sayed, N. S., Bayan, Y. Possible role of resveratrol targeting estradiol and neprilysin pathways in lipopolysaccharide model of Alzheimer disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 822 (822), 107-118 (2015).
  19. Combrinck, M. I., Perry, V. H., Cunningham, C. Peripheral infection evokes exaggerated sickness behaviour in pre-clinical murine prion disease. Neuroscience. 112 (1), 7-11 (2002).
  20. Pantoni, L. Cerebral small vessel disease: from pathogenesis and clinical characteristics to therapeutic challenges. Lancet Neurology. 9 (7), 689-701 (2010).
  21. Rosand, J., et al. Spatial clustering of hemorrhages in probable cerebral amyloid angiopathy. Annals of Neurology. 58 (3), 459-462 (2005).
  22. Robinson, S., et al. Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice. Journal of Neuroscience Research. 95 (4), 1025-1035 (2017).
  23. Kraft, P., et al. Hypercholesterolemia induced cerebral small vessel disease. Plos One. 12 (8), e0182822(2017).
  24. Schreiber, S., Bueche, C. Z., Garz, C., Baun, H. Blood brain barrier breakdown as the starting point of cerebral small vessel disease? - New insights from a rat model. Experimental & Translational Stroke Medicine. 5 (1), 4(2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Подостром мозгового Microhemorrhages, вызванных инъекции липополисахарида в крыс
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.