Миелоидных врожденной сигнальный путь регулирование MALT1 Paracaspase деятельности

Summary

MALT1 регулирует врожденного иммунитета, но как это происходит, остается нечетко. Мы использовали селективный ингибитор paracaspase MALT1 MLT-827 разгадать MALT1 вклад врожденной сигнализации вниз по течению от Толл подобные или C-типа Лектин подобные рецепторы, демонстрируя, что MALT1 регулирует производство миелоидного цитокинов и вниз по течению C-типа Лектин подобных рецепторов выборочно.

Abstract

Помимо своей функции в лимфоидных клетках, который рассматривался на многочисленные исследования, paracaspase MALT1 также играет важную роль в врожденной клеток по течению шаблон признание рецепторов. Лучше всего изучены являются Dectin-1 и Dectin-2 члены семьи Лектин подобный рецептор C-типа которые индуцируют SYK - и CARD9-зависимый сигнальный Каскад, ведущие к активации NF-κB, в зависимости от MALT1. С другой стороны, Толл подобные рецепторы (TLR), например TLR-4, распространять активацию NF-κB но сигнал через каскад MYD88/Ирак зависимых. Тем не менее ли MALT1 могли бы способствовать TLR-4 сигнализации остается неясным. Последние данные с MLT-827, мощным и селективный ингибитор MALT1 paracaspase деятельности, показывает, что TNF-производство по течению TLR-4 в миелоидных клеток человека независимо от MALT1, в отличие от TNF-производства Dectin-1, который является MALT1 зависимые. Здесь мы рассматривали избирательное участие MALT1 в распознавание зондирования дальше, используя разнообразные человека и мыши клеточных препаратов и стимуляции Dectin-1, MINCLE или TLR-4 дорожки. Мы также предоставили дополнительные идеи, исследуя цитокины ФНО-за и путем сравнения MLT-827 ингибитор SYK (Cpd11) и ингибитор IKK (AFN700). Коллективно, предоставленных данных дополнительных доказательств для MALT1-зависимость C-типа Лектин подобный рецептор — в отличие от сигнализации для TLR-сигнализации.

Introduction

Paracaspase активность MALT1 (слизистой оболочки связанных лимфоидной ткани лимфомы транслокации белка 1) было выявлено в 2008^1,2. С тех пор ряд исследований сообщали свой критический вклад антигена рецепторов ответы в лимфоцитах. Генетической модели в мышь также, как фармакология данных поддерживает ключевую роль в Т-клеток, Т-клеток зависит от аутоиммунных заболеваний и B-клеточной лимфомы параметры^3,4. В лимфоцитах, MALT1 paracaspase Активация происходит после Ассамблеи CARD11-BCL10-MALT1 комплекс⁵, который инициируется антиг....

Protocol

Эксперименты были проведены согласно руководящих принципов и стандартов человека Комитета по этике исследований Новартис.

1. Подготовка мононуклеаров периферической крови (получения) от человека Баффи пальто

Примечание: Мы получили Баффи пальто от здоровых добровольцев через один день после сбора, в мешках по 50 мл. Они были предусмотренных осознанного согласия и собранные Interregionale Blutspende Schweizeriches Rotes Kreuz. Мы обрабатывать их с помощью процедуры ниже, при комнатной температуре, если не указано иное.

1. Подготовьте стерильных и чистого пара ножницы и стакан емкос....

Results

В миелоидных клеток MALT1 реле сигналов по течению активации нескольких C-типа Лектин подобные рецепторы, такие как Dectin-1, Dectin-2 и MINCLE⁶. Эти пути полагаются на мотив содержащих рецепторов (Подол) ИТПМ (например, Dectin-1) или ИТПМ мотив содержащих Сопредседатель рецепторов (например, FcRγ, Dectin-2 и MINCLE), набирать и активировать SYK киназы (рис. 1). Это приводит к активации протеин киназы C изоформы, а им.......

Discussion

В этой работе мы использовали простой экспериментальной установки для изучения сигнальных путей в человека и врожденной клетки мыши и допрашивать их зависимость MALT1 протеолитической функции. Расширение на предыдущей работе¹¹, наши исследования показали, что MALT1 paracaspase деятельности контролирует тип C Лектин подобный рецептор индуцированной цитокина производства, включая ФНО α. В противоположность этому индуцированных TLR-4 ФНО α независима от MALT1 в обоих видов. Вместе эти данные подтверж.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 &микро; m нейлоновое сетчатое фильтр	Sigma	CLS431752
14 мл Falcon туба	BD Falcon 352057
15 мл Falcon туба	Falcon	352090
50 мл Falcon пробирка	Falcon	352070
6 лунок	Costar	3516
96 лунок плоскодонная пластина, с крышкой с низким испарением	Costar	3595
96-луночная пластина с V-образным дном	Costar	734-1798
Хлорид аммония - NH4Cl	Sigma	A9434
Разбавитель для анализа RD1-W ELISA	R& D	895038	Разбавитель
Клеточная культура микропланшет, 384 лунка, черный	Грейнер	781986
Обедненный Зимосан	Invivogen	tlrl-dzn	сейчас: tlrl-zyd
Диметилсульфоксид	Sigma	D2650	DMSO
EDTA-Na2	Sigma	E5134	Этилендиаминтетрауксусная кислота дигидрат динатриевой соли
ИФА muTNF-α	НИР D	SMTA00
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-03
gentleMACS C tubes	MACS Miltenyi Biotec	130-096-334
gentleMACS dissociator	MACS Miltenyi Biotec	130-093-235
GM-CSF	Novartis-Термоинактивированная
фетальная бычья сыворотка	Gibco	10082	FBS
HTRF hu IL-23	CisBio	62HIL23PEG
HTRF hu TNF-α	CisBio	62TNFPEC
HTRF восстанавливающий буфер	CisBio	62RB3RDE	50mM Фосфатный буфер, pH 7.0, 0.8M KF, 0.2% BSA
ИФН-&гамма;	НИР D	L4516
IL-4	Novartis-Isoflurane
	Abbott	Forene
Lipopolysaccharides (LPS)	Sigma	L4391	LPS используется в образцах человека
Липополисахариды	Sigma	L4516	LPS используется в образцах мышей
Буфер для лизиса	Self-made-155		mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 1 mM EDTA, pH 7,4
Магнитная	стволовая клетка	18001
Микропланшет, 384 лунки белый	Грейнер	784075
набор для обогащения моноцитов	стволовая клетка	19059
Nalgene Mr. Frosty Cryo 1° C Морозильный контейнер	Nalgene	5100-0001	охлаждающее устройство (содержащее пропанол-2)
PBS 1x pH 7,4 [-] CaCl2 [-] MgCl2	Gibco	10010	Фосфатно-солевой буфер
Пенициллин/стрептомицин	Gibco	15140	Pen/Strepping
Бикарбонат калия - KHCO3	Sigma	P9144
PrestoBlue	Invitrogen	A13262	Раствор резазурина для оценки жизнеспособности
Propanol-2	Merck	1.09634
Буфер для чтения	MesoScale Discovery	R92TC-3	Буфер на основе триса, содержащий трипропиламин
Восстановление клеточной культуры замораживающая среда	Gibco	12648-010	замораживающая среда
Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) с Glutamax	Gibco	61870	+ 10% FBS для iMoDCs + 10% FBS + 1 мМ пируват натрия + 100 Ед/мл Pen/Strep + 5 & микро; M β-меркаптоэтанол для PBMC человека и моноцитов + 10% FBS + Pen/Strepping + 5 &m; M β-меркаптоэтанол для мышиных спленоцитов
Разделительный буфер	Self-made-PBS pH 7,4 + 2% FBS + 1 mM EDTA pH 8,0
Пируват натрия	Gibco	11360
Трегалоза-6,6-дибехенат	Invivogen	tlrl-tdb	TDB
Tween 20	Sigma	P7949	Полисорбат 20
UltraPure 0,5 M EDTA pH 8,0	Invitrogen	15675	Этилендиаминтетрауксусная кислота
Герметик	Viewseal Greiner BioOne	676070
V-PLEX Провоспалительная панель 1 Набор для человека	MesoScale Discovery	K15049D	электрохемилюминесцентного мультиплексного анализа (IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8)
β-меркаптоэтанол	Gibco	31350