Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Внеклеточный протеин технология Microarray для высокой пропускной способности обнаружения низкого сродства рецептор лиганд взаимодействий

6.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58451

⸱

7 января 2019 г.

 ,  ,  , 
1Receptor Discovery group, Microchemistry, Proteomics and Lipidomics Department, Genentech, 2Portfolio Management and Operations, Genentech

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол для экрана внеклеточный протеин microarrays для идентификации Роман рецептор лиганд взаимодействий в высокой пропускной способности. Мы также описывают метод для улучшения обнаружения переходных белок белковых взаимодействий с помощью белка microbead комплексов.

Аннотация

Выделяется факторы, мембрана привязанный рецепторов и их взаимодействия партнеров являются основными регуляторами сотовой связи и начало сигнальные каскады во время гомеостаза и болезней и как таковые представляют собой премьер терапевтических целей. Несмотря на их актуальности эти сети взаимодействия по-прежнему значительно недопредставлены в текущих базах данных; Таким образом наиболее внеклеточных белков у партнера не документированы привязки. Это расхождение обусловлено прежде всего проблемы, связанные с изучением внеклеточных белков, включая выражение функциональных белков и слабый, низкий сродство, взаимодействий протеина, часто создаваемых между поверхности рецепторы клеток. Этот метод предназначен для описания печать библиотеки внеклеточных белков в формате microarray для скрининга белок белковых взаимодействий. Чтобы включить обнаружение слабых взаимодействий, описан метод, основанный на multimerization белка запроса под исследование. Связан этот подход на основе microbead multimerization для увеличения поливалентность, microarray протеина позволяет надежного обнаружения переходных белок белковых взаимодействий в высокой пропускной способности. Этот метод предлагает пример быстрого и низкого потребления подход для идентификации новых взаимодействий, применимым к любой внеклеточных белков. Описаны протеина microarray печати и скрининга протокол. Эта технология будет полезным для следователей, ищущих надежный метод для обнаружения белковых взаимодействий в внеклеточного пространства.

Введение

Метод, рассмотрели здесь описывает печать коллекции внеклеточных белков в формате microarray дна, а затем с помощью метода для проверки целевого интерес против этой библиотеки. Мы выявили белок multimerization как решающий шаг для обнаружения взаимодействий, характеризуются низкой привязки сродства. Для улучшения обнаружения этих взаимодействий, мы описываем протокол, основанный на multimerization запроса протеина интереса, используя микрошарики.

Выделяется и клеток выражена поверхности белки (собирательно именуются внеклеточные белки) наряду с их взаимодействия партнеров являются ключевые регуляторы сотовой связи, сигнализации и взаимодействия с микроокружения. Таким образом, они имеют важное значение в регуляции многих физиологических и патологических процессов. Около четверти генома человека (≈5, 000 белки) кодирует внеклеточных белков, который, учитывая их важность и доступность для систематически поставляемых наркотиков, представляют собой ключевые цели развития наркотиков1. Следовательно внеклеточные белки представляют более чем 70% белковых мишеней с известных фармакологических действий для утвержденных лекарств на рынке, известный как «druggable протеом». Несмотря на их важность и изобилия внеклеточный протеин взаимодействия (ePPI) сетей по-прежнему удивительно недопредставлены в доступных баз данных. Это принципиально ввиду сложных биохимических внеклеточных белков, который исключает их характеристик с помощью самых доступных технологий2. Во-первых мембранные белки трудны для того солюбилизировать последнего, процесс, который часто включает в себя тяжелые Стиральная условий и моющих средств; Во-вторых внеклеточные белки часто не хватает соответствующих столб-поступательные изменения таких как гликозилирования, отсутствуют когда эти белки выражаются в часто используемые гетерологичных систем. Наконец, взаимодействие между рецепторов, таких как сопредседатель рецепторов, выраженные на иммунные клетки, часто переходных и характеризуется очень низкой работоспособностью (D K в ~ 1 мкм для > 100 мкм диапазон). В общей сложности характер этих белков и их привязки, которые партнеры оказывают наиболее широко используемых технологий, таких как сродства очищения/масс-спектрометрии (AP/МС) или дрожжи 2 гибрида, непригодных для обнаружения взаимодействий в пространстве внеклеточного 2 , 3.

В попытке преодолеть эти технические проблемы и ускорить открытие новых взаимодействий для внеклеточных белков мы разработали высокий охват внеклеточный протеин microarray дна4,5. Microarrays предлагают преимущество создания высокой плотности поверхности с небольшим количеством образца и обычно поддаются исследования высокой пропускной способности. Исследования на основе microarray протеина ранее предоставили соответствующие понимание взаимодействия протеина для нескольких модельных организмов, хотя главным образом на цитозольной взаимодействия или на конкретных белка семьи6,7, 8. В отличие от ограниченных была проделана расследовать внеклеточный протеин взаимодействия с использованием этой технологии. Мы разработали метод microarray протеина для включения исследований ePPIs путем создания всеобъемлющего и весьма разнообразных библиотека очищенного секретируемые белки и одного трансмембранные рецепторы (СТМ) выражена как рекомбинантной внеклеточных доменов (ECD) сливается с общие теги для очищения сродства4. Успех на экранах microarray протеина опирается на создание высокого качества белка библиотеки. Для выражения запроса, так и библиотека белка mammalian клетки или клетки, насекомых преференциально были выбраны как гетерологичных выражение системы, для обеспечения правильного сложения столб-поступательные изменения таких облигаций гликозилирования или дисульфида. SDS-PAGE, размер гель-проникающей хроматографии и мульти-угол лазерного рассеяния света являются методы обычно используются для оценки качества рекомбинантных белков. Белка библиотека затем увидел на epoxysilane слайды и температуре-20 ° C для долгосрочного использования. Концентрация белка выше 0,4 мг/мл рекомендуются для протокола, описанных ниже. Таким образом низкий выражая белков может потребовать концентрации шаг до печати выборки и хранения. Тем не менее, основным преимуществом этого метода является небольшой объем белка требуется (50 мкг белка достаточно выполнить > 2000 экраны), наряду с минимальным запроса потребление белка (20-25 мкг за дубликаты экран). С использованием протокола и оборудования описано здесь, и если имеются библиотеки, результаты для отдельных запросов белки могут быть получены в течение одного рабочего дня.

Одной из основных задач при выявлении взаимодействий протеина в внеклеточных среды вытекает из их характерно слабое или временный характер, что исключает возможность идентификации, наиболее часто используемых методологий. Расширения привязки алчность значительно улучшает чувствительность для обнаружения слабых белковых взаимодействий9,10,11. Основываясь на этом принципе, мы разработали метод multimerize запроса белки (выражается как ФК fusion) с помощью белка A-покрытием бусины4,5. Чтобы избежать любой потенциальной инактивации белка запроса путем случайных маркировки, мы вместо этого метка не значения человеческого иммуноглобулина G с Cy5 и добавить его вместе с запроса белка белка А бусы, таким образом устраняя любые артефакты из-за прямого сопряжения краситель для протеина интереса. С учетом всех сходство несколько пар ко-рецептор, разносторонним комплексы значительно повысить соотношение сигнал-шум, по сравнению с Fc фьюжн запросов белки показан как растворимые белки4.

Таким образом цель настоящего Протокола является описать подготовку microarray слайды, содержащий существующие библиотеки внеклеточный протеин для идентификации рецептор лиганд взаимодействий. Мы рассмотрим шаги, необходимые для печати, а затем протокол для скрининга протеина интереса против внеклеточных белков библиотеки слайдов. Кроме того мы описываем метод расширения обнаружения ePPIs на основании микрошарики для достижения увеличения алчность белка изучается. Описанная здесь технология microarray внеклеточный протеин представляет собой быстрый, надежный и эффективный подход для скрининга и выявления роман ePPI с низким коэффициентом ложно положительных и, используя только микрограмм количеств белка запроса под расследование. Эта технология подпитывается несколько исследований, которые предоставили соответствующие взглянуть на ранее неизвестных клеточных функций и сигнальных путей для различных рецепторов12,13, включая вирусный immunoregulators14, и может быть использован для снятия orphanize любой внеклеточный протеин интереса.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Генерация библиотеки внеклеточных белков человека

  1. Составить список поверхности рецепторы клеток или секретируемые белки, представляющие интерес для построения библиотеки microarray протеина. Конкретные белка семьи (например, Иммуноглобулин надсемейства) или белки выборочно выразил в частности ячейки, выбранные типы для изучения.
  2. Для поверхности рецепторы клеток определите границы внеклеточного домена (ECD) путем выявления сигнала пептида и трансмембранного регионов с использованием программных средств. Некоторые из соответствующие инструменты, свободно доступны онлайн, на которые имеются ссылки в Таблице материалов15,16,17,18.
  3. Синтезировать РДРВ для гены интереса и клонов в соответствующий вектор. Секретируемые белки или ECD STM рецепторов, склеенный ряда общих теги сродства могут быть очищены от кондиционером СМИ с соответствующим вектором transfected клеток, или от клеток бакуловирусы насекомое выражение систем.
    Примечание: Mammalian клеток на основе систем (например, ГЭС/293 или Чо клетки) рекомендуется увеличить вероятность надлежащего белка складчатости и добавления соответствующих Посттрансляционная модификации, такие как гликозилирования.
  4. Очищайте протеины стандартных сродства очищения методами. Предыдущие усилия описал автоматических или полуавтоматических процедур подходит для очистки сотни протеинов, которые можно масштабировать для создания набора белков интерес9,19,20, 21.
    Примечание: Рекомендуется SDS-PAGE, размер гель-проникающей хроматографии (S) или Multi-угол лазерного рассеяния света (центры) для оценки любой non ковалентные агрегирования и управления для общего качества белковых препаратов.
  5. Отрегулируйте белки до 200 или 400 мкг/мл, когда это возможно и разбавленных запасов с 80% глицерином для длительного хранения в криогенных флаконов при-20 ° C. Они представляют собой главные запасы и должны быть доступны только при необходимости.
  6. Передавать аликвоты каждого белка (100 мкл) 96-луночных пластины (фондовых пластины), печать с клей фольги и хранить при температуре от-20 ° C до подготовки слайд microarray. Складе пластины создаются к минимуму циклов замораживания оттаивания и обеспечить стабильность белков.

2. внеклеточный протеин Microarray печати

  1. Используйте стандартный microarrayer для печати слайдов. Инструмент используется для протокола, описанные здесь имеет мощность 57 слайды/запуск и использует печатающей головки, проведение 48 пятнистость выводов. Эти контакты генерировать пятна диаметром ~ 100 мкм, spot спот расстояние ~ 350 мкм и рисует 0,25 мкл за нагрузки. В этой конфигурации до 8000 пятен на слайд могут быть размещены.
  2. Создавать рабочие пластины (384 хорошо пластины, 10 мкл пример/хорошо) из запасов пластины. Выполните этот шаг вручную до печати слайдов с помощью microarrayer. Затем место белки с перо тип кровянистые выделения булавками на epoxysilane слайды на 60% влажности (для предотвращения обезвоживания пятна протеина).
    Примечание: Cy3-меченых бычьим сывороточным альбумином (БСА) может быть выставлен в дубликаты между каждый образец протеина (5 мкг/мл в PBS/40% глицерола) для визуализации в массив допольнительных маска (см. раздел 4). Хотя рекомендуется, этот шаг является необязательным.
  3. После печати, удалите слайды microarray протеина из среды увлажненные и блокировать их на ночь с 5% молока в PBST для инактивации поверхности.
    Примечание: Рекомендуется использовать ультразвуковые фоггер для генерации штраф туман блокирования решения, которое оседает на поверхности скольжения.
  4. Хранить слайды при температуре-20 ° C 50% глицерина для предотвращения замерзания.

3. Подготовка многовалентных приманки комплексов

Примечание: Взаимодействие между внеклеточные белки часто характеризуются низкой работоспособностью. Чтобы включить обнаружение этих взаимодействий, увеличивая привязки алчность, разносторонним подход, основанный на захват запроса белка, выраженный в виде Fc тегами РДРВ, белок А-покрытием микрошарики был разработаны4.

  1. Ярлык перевозчик IgG, используется для обнаружения с Cy5 monoreactive красителя и отдельные бесплатно краска с использованием опреснительной столбцов. Определите красителя соотношения белков путем измерения поглощения ультрафиолетового 280 и 650 Нм.
    Примечание: Обычно используются соотношения белков краситель 2.0 и 4.0. Рекомендуется для спина Cy5 конъюгатов на 100,000 x g 15 мин для удаления потенциальных растворимых агрегатов из-за процесса маркировки.
  2. Определите оптимальное соотношение microbead белка, титрование белка против постоянное количество белка запроса. Минимальный объем насыщения бусы, где нет свободного Fc тегами белка остается, как измеряется с помощью конкурентных пробирного определяется biolayer интерферометрии, используется для проверки.
  3. Форма microbead белковых комплексов по инкубации Cy5-IgG с белком А микрошарики и смеси на трубку ротатора в PBS на 30 минут при комнатной температуре в защищенном от света и Fc тегами запроса.
  4. Для формирования этих комплексов, используйте запрос белка в конечной концентрации 20 мкг/мл. Чтобы вычислить молярное соотношение белка запроса и Cy5-IgG, разделите молекулярная масса белка запроса, молекулярная масса IgG (150000 Da) и умножить на 40 мкг/мл для определения концентрации Cy5-IgG необходимы.
  5. Дополняют образцы с растворимого белка (1 мг/мл) немедленно до инкубации с microarray слайды (см. ниже раздел 4.2) для предотвращения привязки любой свободный белок А бисера ФК синтез белков, которые могут присутствовать в массиве.
    Примечание: Объем окончательной реакции может варьироваться в зависимости от гибридизации станции или инкубации камеры используются. Приборостроение, описанные в Таблица материалов позволяет инкубации образца с помощью относительно небольших объемах (~ 200 мкл каждого слайда).

4. внеклеточный протеин Microarray проверки и обработки.

Примечание: Существует ряд производителей, которые обеспечивают автоматическую обработку. Если гибридизации станция не доступна, следующие действия могут выполняться вручную, обеспечение достаточного объема буфера держать слайды погруженной во все времена.

  1. Теплый слайды при комнатной температуре и сполосните анимации PBS/0.1% 20 (PBST) для удаления остаточных глицерин перед загрузкой на станции гибридизации.
  2. Используйте следующий протокол проверки:
    1. Вымойте с PBST за 1 мин.
    2. Загрузка 200 мкл 1 мг/мл белок в молоке PBS/5% и Инкубируйте 30 мин для предотвращения uncomplexed белка микрошарики от привязки к Fc тегами белков, которые могут присутствовать в microarray.
    3. Пять раз промыть PBST за 1 мин.
    4. Загрузка 200 мкл комплекс присутствии 1 мг/мл протеин A запроса: микрошарики и Инкубируйте 30 мин.
    5. Вымойте с PBST за 1 мин.
  3. После гибридизации промойте слайды с водой, место в отдельных 50 мл конические трубы и сухой, спиннинг на 900 x g за 5 мин.
  4. Наконец сканируйте слайды с microarray сканера необходимо обнаружить Cy3 (если BSA-Cy3 был напечатан) и Cy5 флуоресценции, захватывающие 532 и 635 нм, соответственно.
  5. Выполните анализ данных с помощью сопутствующих microarray анализ данных. Список соответствующих массивов (в виде файла .gal) загружается в программное обеспечение извлечения данных. На этой стадии используют Cy3-BSA пятна найти блоков и использовать варианты автоматическ штуцера в программном обеспечении, следуют руководство выравнивание возможностей при необходимости. Сохраните файлы как файлы .gpr для дальнейшего анализа.

5. анализ данных

  1. Сохраните данные в виде файлов ППГ и процесс в R, с помощью пакета Лимма, обычно используются для анализа данных microarray дна4,5.
    1. Для предварительной обработки, фон коррекции и нормализации в слайд. Поскольку каждый белок печатается в дублированных пятна, объединить оба измерений для создания единого Оценка для этого белка в библиотеке.
    2. Вычисления оценки для каждого слайда и анализировать результаты для пересечения высокого забил кандидатов между слайдами.
    3. Используйте повторяющиеся microarrays управления от отдельных тираж для слайд изменчивости и пересечения участков, представляющих данных из обоих экранах для вызова окончательный хитов.
    4. Наконец выполните дополнительный уровень фильтрации исключить прослушивающем белков в массиве. Такие неспецифические Биндеры определяются как белки, превышает особый статистический порог хит частоты, как определено пользователем через независимые экраны.
      Примечание: Этот протокол описана подробно в том et al. 20135. В нашем случае неспецифической связыватель вызова на основании определения совокупного добычу хит ставки, и данными ликвидации порог 5% используется.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Схема рабочего процесса для технологии microarray внеклеточный протеин показан на рисунке 1. После того, как слайды microarray дна, содержащий библиотеку внеклеточных белков доступны, скрининг протеина интереса и анализ данных может быть завершена в течение одного дня. Многие физиологически соответствующего взаимодействия между рецепторы мембраны встроенный характеризуются очень слабое связывание сильные (D K в пределах всех). Чтобы улучшить обнару...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Значительное число сирот рецепторов остается в геноме человека, и Роман взаимодействующих партнеры продолжают появляться внеклеточных белков с ранее характеризуется лигандами. Определение рецептор лиганд взаимодействия человека и модельных организмов необходимо понять механизмы, которые диктуют сотовой связи во время гомеостаза, а также регуляции приводит к болезни и поэтому сообщить новых или усовершенствованных терапевтические возможности. Тем не менее обнаружение внеклеточного белковых взаимодействий, широко используе...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Б.х., S.R-R и N.M-M. Genentech работников и собственных акций в группе Genentech Inc./Рош.

Благодарности

Мы благодарим Philamer Calses и Юн Кобе за критически читать рукопись. Мы благодарны Рэнди иен за отличные технические консультации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ультрачистый глицерин марки MBUSB Corporation56-81-5Хранение белка
Блокирующий буфер SeptoMark ZeptosensBB1, 90-40Блокирующий буфер микрочип слайды
Бычий сывороточный альбуминRoche03-117-957-001Ползунок для подгонки маски (опционально)
Полипропиленовые мультилуночные пластиныGreiner Bio One82050-678Хранение белка
Полипропиленовые многолуночные пластиныArrayitMMP384Слайд-печать
NanoPrint LM60, или аналогичный контакт микромассиверArrayitNanoPrint LM60, или аналогичный контактный микромассивСлайд-печать
Микро-пятнистые булавкиArrayitМикро-пятнистые штифтыСлайд-печать
ZeptoFOG Блокирующая станцияZeptosens ZeptoFOG1210Блок-слайды после печати
Сухое обезжиренное молокоThermo FisherLP0031Решение для
блокировкиСтеклянная горка с эпоксисилановым покрытиемNextrion Slide E1064016предметные стекла
Microarray Подставка для стекла и набор стеллажейдля стекла Wheaton900303Хранение слайдов
Cy5 монореактивный красительGE HealthcarePA23031Маркировка альбумином
Cy5 монореактивный красительGE HealthcarePA25001человека Маркировка IgG
Pro-spin колонна для обессоливания Pro-spinPrinceton СепарацииCS-800Удалить свободный краситель
Клей алюминиевая фольга уплотнительAlumaSealF-384-100Пломбировочные пластины
Полипропиленовые криогенные флаконыCorning430658Мастер-флаконы для хранения белковой библиотеки
Микрогранулы белка АMiltenyi120-000-396Запрос мультимеризация белка
IgG человека JacksonImmunoresearch& НБСП; 009-000-003Нерелевантный IgG для мечения
белка АSigma  P7837
Станция гибридизации, a-Hyb или аналогичнаяMiltenyi, a-Hyb или аналогичнаяАвтоматизированная обработка микрочипов (опционально)
Сканер GenePix 4000B или аналогичныемолекулярные устройстваСканер GenePix 4000B или аналогичныеСканирование слайдов
GenePix Pro или аналогичное программное обеспечение для извлечения данныхМолекулярные устройстваGenePix Pro или эквивалентное программное обеспечение для извлечения данныхОбработка
данных Сигнал P4.1DTU Биоинформатика, Технический университет Даниионлайнпрограммное обеспечение Инструмент прогнозирования для определения наличия и местоположения сигнальных пептидных сайтов расщепления
TMHMM 2.0 серверDTU Биоинформатика, Технический университет Даниионлайн программное обеспечениеПрогнозирование трансмембранных спиралей в белках
PhobiusСтокгольмский центр биоинформатикионлайн программное обеспечениеКомбинированная трансмембранная топология и предиктор сигнальных пептидов
TOPCONSСтокгольмский университетонлайн программное обеспечениеПрогнозирование мембранной топологии и сигнальных пептидов
, станция гибридизации

Ссылки

  1. Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there? Nature Reviews Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).
  2. Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M., Sollner, C. High-throughput identification of transient extracellular protein interactions. Biochemical Society Transactions. 38 (4), 919-922 (2010).
  3. Wright, G. J. Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions. Molecular BioSystems. 5 (12), 1405-1412 (2009).
  4. Ramani, S. R., et al. A secreted protein microarray platform for extracellular protein interaction discovery. Analytical Biochemistry. 420 (2), 127-138 (2012).
  5. Tom, I., Lewin-Koh, N., Ramani, S. R., Gonzalez, L. C. Protein microarrays for identification of novel extracellular protein-protein interactions. Current Protocols in Protein Science. 27, 1-27 (2013).
  6. Kaushansky, A., et al. Quantifying protein-protein interactions in high throughput using protein domain microarrays. Nature Protocols. 5 (4), 773-790 (2010).
  7. Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4730-4735 (2007).
  8. Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).
  9. Bushell, K. M., Sollner, C., Schuster-Boeckler, B., Bateman, A., Wright, G. J. Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions. Genome Research. 18 (4), 622-630 (2008).
  10. Voulgaraki, D., et al. Multivalent recombinant proteins for probing functions of leucocyte surface proteins such as the CD200 receptor. Immunology. 115 (3), 337-346 (2005).
  11. Jiang, L., Barclay, A. N. Identification of leucocyte surface protein interactions by high-throughput screening with multivalent reagents. Immunology. 129 (1), 55-61 (2010).
  12. Yeh, F. L., Wang, Y., Tom, I., Gonzalez, L. C., Sheng, M. TREM2 Binds to Apolipoproteins, Including APOE and CLU/APOJ, and Thereby Facilitates Uptake of Amyloid-Beta by Microglia. Neuron. 91 (2), 328-340 (2016).
  13. Jaworski, A., et al. Operational redundancy in axon guidance through the multifunctional receptor Robo3 and its ligand NELL2. Science. 350 (6263), 961-965 (2015).
  14. Martinez-Martin, N., et al. The extracellular interactome of the human adenovirus family reveals diverse strategies for immunomodulation. Nature Communications. 7, 11473(2016).
  15. Nielsen, H. Predicting Secretory Proteins with SignalP. Methods in Molecular Biology. 1611, 59-73 (2017).
  16. Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: application to complete genomes. Journal of Molecular Biology. 305 (3), 567-580 (2001).
  17. Kall, L., Krogh, A., Sonnhammer, E. L. Advantages of combined transmembrane topology and signal peptide prediction--the Phobius web server. Nucleic Acids Research. 35 (Web Server issue), W429-W432 (2007).
  18. Bernsel, A., Viklund, H., Hennerdal, A., Elofsson, A. TOPCONS: consensus prediction of membrane protein topology. Nucleic Acids Research. 27 (Web Server issue), W465-W468 (2009).
  19. Gonzalez, R., et al. Screening the mammalian extracellular proteome for regulators of embryonic human stem cell pluripotency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3552-3557 (2010).
  20. Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic Acids Research. 30 (2), E9(2002).
  21. Battle, T., Antonsson, B., Feger, G., Besson, D. A high-throughput mammalian protein expression, purification, aliquoting and storage pipeline to assemble a library of the human secretome. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 9 (9), 639-649 (2006).
  22. Clark, H. F., et al. The secreted protein discovery initiative (SPDI), a large-scale effort to identify novel human secreted and transmembrane proteins: a bioinformatics assessment. Genome Research. 13 (10), 2265-2270 (2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

FcCy3 Cy5
Внеклеточный протеин технология Microarray для высокой пропускной способности обнаружения низкого сродства рецептор лиганд взаимодействий
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.