Method Article

Внеклеточный протеин технология Microarray для высокой пропускной способности обнаружения низкого сродства рецептор лиганд взаимодействий

DOI:

10.3791/58451

⸱

January 7th, 2019

 ,  ,  , 
1Receptor Discovery group, Microchemistry, Proteomics and Lipidomics Department, Genentech, 2Portfolio Management and Operations, Genentech

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол для экрана внеклеточный протеин microarrays для идентификации Роман рецептор лиганд взаимодействий в высокой пропускной способности. Мы также описывают метод для улучшения обнаружения переходных белок белковых взаимодействий с помощью белка microbead комплексов.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Выделяется факторы, мембрана привязанный рецепторов и их взаимодействия партнеров являются основными регуляторами сотовой связи и начало сигнальные каскады во время гомеостаза и болезней и как таковые представляют собой премьер терапевтических целей. Несмотря на их актуальности эти сети взаимодействия по-прежнему значительно недопредставлены в текущих базах данных; Таким образом наиболее внеклеточных белков у партнера не документированы привязки. Это расхождение обусловлено прежде всего проблемы, связанные с изучением внеклеточных белков, включая выражение функциональных белков и слабый, низкий сродство, взаимодействий протеина, часто создаваемых между поверхности рецепторы клеток. Этот метод предназначен для описания печать библиотеки внеклеточных белков в формате microarray для скрининга белок белковых взаимодействий. Чтобы включить обнаружение слабых взаимодействий, описан метод, основанный на multimerization белка запроса под исследование. Связан этот подход на основе microbead multimerization для увеличения поливалентность, microarray протеина позволяет надежного обнаружения переходных белок белковых взаимодействий в высокой пропускной способности. Этот метод предлагает пример быстрого и низкого потребления подход для идентификации новых взаимодействий, применимым к любой внеклеточных белков. Описаны протеина microarray печати и скрининга протокол. Эта технология будет полезным для следователей, ищущих надежный метод для обнаружения белковых взаимодействий в внеклеточного пространства.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метод, рассмотрели здесь описывает печать коллекции внеклеточных белков в формате microarray дна, а затем с помощью метода для проверки целевого интерес против этой библиотеки. Мы выявили белок multimerization как решающий шаг для обнаружения взаимодействий, характеризуются низкой привязки сродства. Для улучшения обнаружения этих взаимодействий, мы описываем протокол, основанный на multimerization запроса протеина интереса, используя микрошарики.

Выделяется и клеток выражена поверхности белки (собирательно именуются внеклеточные белки) наряду с их взаимодействия партнеров являются ключевые регуляторы сотовой связи, сигнализации и взаимодейс....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Генерация библиотеки внеклеточных белков человека

  1. Составить список поверхности рецепторы клеток или секретируемые белки, представляющие интерес для построения библиотеки microarray протеина. Конкретные белка семьи (например, Иммуноглобулин надсемейства) или белки выборочно выразил в частности ячейки, выбранные типы для изучения.
  2. Для поверхности рецепторы клеток определите границы внеклеточного домена (ECD) путем выявления сигнала пептида и трансмембранного регионов с использованием программных средств. Некоторые из соответствующие инструменты, свободно доступны онлайн, на которые имеются ссылки в Таблице материалов

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Схема рабочего процесса для технологии microarray внеклеточный протеин показан на рисунке 1. После того, как слайды microarray дна, содержащий библиотеку внеклеточных белков доступны, скрининг протеина интереса и анализ данных может быть завершена в течение одного дня. Многие физиологически соответствующего взаимодействия между рецепторы мембраны встроенный характеризуются очень слабое связывание сильные (D K в пределах всех). Чтобы улучшить обнару.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Значительное число сирот рецепторов остается в геноме человека, и Роман взаимодействующих партнеры продолжают появляться внеклеточных белков с ранее характеризуется лигандами. Определение рецептор лиганд взаимодействия человека и модельных организмов необходимо понять механизмы, которые диктуют сотовой связи во время гомеостаза, а также регуляции приводит к болезни и поэтому сообщить новых или усовершенствованных терапевтические возможности. Тем не менее обнаружение внеклеточного белковых взаимодействий, широко используе.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Б.х., S.R-R и N.M-M. Genentech работников и собственных акций в группе Genentech Inc./Рош.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Philamer Calses и Юн Кобе за критически читать рукопись. Мы благодарны Рэнди иен за отличные технические консультации.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ультрачистый глицерин марки MBUSB Corporation56-81-5Хранение белка
Блокирующий буфер SeptoMark ZeptosensBB1, 90-40Блокирующий буфер микрочип слайды
Бычий сывороточный альбуминRoche03-117-957-001Ползунок для подгонки маски (опционально)
Полипропиленовые мультилуночные пластиныGreiner Bio One82050-678Хранение белка
Полипропиленовые многолуночные пластиныArrayitMMP384Слайд-печать
NanoPrint LM60, или аналогичный контакт микромассиверArrayitNanoPrint LM60, или аналогичный контактный микромассивСлайд-печать
Микро-пятнистые булавкиArrayitМикро-пятнистые штифтыСлайд-печать
ZeptoFOG Блокирующая станцияZeptosens ZeptoFOG1210Блок-слайды после печати
Сухое обезжиренное молокоThermo FisherLP0031Решение для
блокировкиСтеклянная горка с эпоксисилановым покрытиемNextrion Slide E1064016предметные стекла
Microarray Подставка для стекла и набор стеллажейдля стекла Wheaton900303Хранение слайдов
Cy5 монореактивный красительGE HealthcarePA23031Маркировка альбумином
Cy5 монореактивный красительGE HealthcarePA25001человека Маркировка IgG
Pro-spin колонна для обессоливания Pro-spinPrinceton СепарацииCS-800Удалить свободный краситель
Клей алюминиевая фольга уплотнительAlumaSealF-384-100Пломбировочные пластины
Полипропиленовые криогенные флаконыCorning430658Мастер-флаконы для хранения белковой библиотеки
Микрогранулы белка АMiltenyi120-000-396Запрос мультимеризация белка
IgG человека JacksonImmunoresearch& НБСП; 009-000-003Нерелевантный IgG для мечения
белка АSigma  P7837
Станция гибридизации, a-Hyb или аналогичнаяMiltenyi, a-Hyb или аналогичнаяАвтоматизированная обработка микрочипов (опционально)
Сканер GenePix 4000B или аналогичныемолекулярные устройстваСканер GenePix 4000B или аналогичныеСканирование слайдов
GenePix Pro или аналогичное программное обеспечение для извлечения данныхМолекулярные устройстваGenePix Pro или эквивалентное программное обеспечение для извлечения данныхОбработка
данных Сигнал P4.1DTU Биоинформатика, Технический университет Даниионлайнпрограммное обеспечение Инструмент прогнозирования для определения наличия и местоположения сигнальных пептидных сайтов расщепления
TMHMM 2.0 серверDTU Биоинформатика, Технический университет Даниионлайн программное обеспечениеПрогнозирование трансмембранных спиралей в белках
PhobiusСтокгольмский центр биоинформатикионлайн программное обеспечениеКомбинированная трансмембранная топология и предиктор сигнальных пептидов
TOPCONSСтокгольмский университетонлайн программное обеспечениеПрогнозирование мембранной топологии и сигнальных пептидов
, станция гибридизации

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there? Nature Reviews Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).
  2. Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M., Sollner, C. High-throughput identification of transient extracellular protein interact....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein MicroarrayExtracellular ProteinLow Affinity InteractionsMultimerization ApproachMicrobead Based DetectionHigh Throughput ScreeningProtein A Coated BeadsFC Tagged ProteinsCy3 Cy5 FluorescenceArray Scanner

Related Articles