Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Определение события гомологичная рекомбинация в мышиных эмбриональных стволовых клеток с использованием южный Blotting и цепной реакции полимеразы

8.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58467

⸱

20 ноября 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Lab of Animal Models and Functional Genomics (LAMFG), The Key Laboratory of Animal Vaccine & Protein Engineering, College of Veterinary Medicine, Hunan Agricultural University (HUNAU), 2Department of Pathology, Georgetown University Medical School, 3College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University (HUNAU), 4Lab of Molecular Cardiology (LMC), National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI)/National Institutes of Health (NIH), 5Transgenic Core, National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI)/National Institutes of Health (NIH)

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем подробный протокол для выявления гомологичная рекомбинация события, которые произошли в мышиных эмбриональных стволовых клеток с использованием Южный blotting или ПЦР. Этот метод является примером поколения nonmuscle миозин II генетических замена мыши модели с использованием традиционных эмбриональных стволовых клеток-технологию на основе гомологичных рекомбинации опосредованной таргетинга.

Аннотация

Относительно вопросов пробить эффектов и сложности вставке длинный фрагмент ДНК в применение конструктора nucleases для редактирования, эмбриональных стволовых генома технологии гена таргетинг на основе клеток (ES) не имеют таких недостатков и широко используется для изменения генома животных/мыши от большого удаления/вставки до единичных нуклеотидных замен. Особенно выявления сравнительно мало гомологичная рекомбинация (HR) события, необходимые для получения желаемого ES клонов является ключевым шагом, который требует точных и надежных методов. Южный blotting или обычных PCR часто используются для этой цели. Здесь мы описываем подробные процедуры использования этих двух методов для идентификации HR события, которые произошли в мыши ES клеток, в которых эндогенного ген Myh9 предназначен для быть нарушена и заменены cDNAs кодирования другие nonmuscle тяжелой цепи миозина IIs (IIs НЦПЗ). Вся процедура Южный blotting включает строительство ориентации vector(s), электропорация, выбор наркотиков, расширения и хранения клеток ES/клоны, подготовка, пищеварение и промокательной геномной ДНК (геномная ДНК), гибридизации и Мойка кислородных и заключительный шаг авторадиографии на рентгеновских пленок. ПЦР могут быть выполнены непосредственно с подготовленной и разбавленных геномная ДНК. Для получения идеальных результатов, следует тщательно планировать зонды и энзима ограничения (пере) вырубки для Южный blotting и грунты для ПЦР. Хотя выполнение Южный blotting является длительным и трудоемким и ПЦР результаты ложных срабатываний, правильной идентификации, Южный blotting и быстрого скрининга методом ПЦР позволяют единственным или комбинированного применения этих методов, описанных в настоящем документе, широко используется и консультации, большинство лабораторий в идентификации генотипов ES клеток и генетически изменены животных.

Введение

Технология гена, ориентирование по HR в мышиных клетки ES обеспечивает мощный инструмент для рассечения сотовой последствия конкретных генетических мутаций1,2. Важность и значение этой технологии отражаются в его признании 2007 Нобелевской премии по физиологии и медицине3,4; Тем временем он представляет собой наступление современной эры гена инженерных5. Джин, ориентация через HR могут быть использованы для инженер практически любые изменения от точечные мутации до больших хромосомных перестроек в геноме мыши ES клеток6,7. Хорошо известно, что, перед появлением так называемых генома инструменты редактирования, поколения мыши Нокаут гена требуется применение технологии гена ориентация в ES клеток8,9,10. В течение последних двух десятилетий более чем 5000 целевых генов мышей были произведены этот подход для моделирования заболеваний человека или изучении генной функции11. Геном общесистемной нокаут усилий была создана для распространения ген ориентации векторов, целенаправленных клоны клеток ES и живой мышей, чтобы научное сообщество2,12,13,14 , 15. несомненно, ES клеток HR-опосредованной ген ориентация технологии значительно расширенный нашего понимания функций генов играл в физиологических и патологических контексте.

Потому что HR является сравнительно редким событием в млекопитающих клетки16,17, является важным и следующий шаг после гена ориентации в мышиных ES клеток заключается в анализе многочисленных колоний ES для выявления несколько клонов с результатом мутации HR с ориентации вектора18. Золотые методы для выявления HR события включают Южный blotting и ПЦР19,20. Преимущества подходов включают что Южный blotting может определить правильно целевых ES клоны и позволяет исследователям анализировать структуру гена целевой события, например проверку одной копии вставки конструкции, тогда как Стратегия на основе ПЦР позволяет более быстрого скрининга для HR события21,22. Хотя эти методы имеют свои недостатки, такие как что они много времени и может иметь ложных срабатываний, комбинационный использование их является широко приняты и применяются организациями большинство лабораторий в определении события HR, особенно в ES клеток, для генерации генетически измененными животных.

Три изоформ nonmuscle миозин II (Нм II) млекопитающих, каждая из которых состоит из двух идентичных NMHC IIs, которые кодируются с трех различных генов (именованные Myh9, Myh10 и Myh14) и две пары легких цепей, называются Нм II-A, II-B и II-C23. Предыдущие исследования показали, что по крайней мере изоформ Нм II-A и II-B важны для развития мыши, потому что в vivo абляции этих изоформ приводит к эмбриональной летальность24,25,26. Чтобы обойти эту проблему и получить новые идеи в изоформы специфичные функции Нм II-A и II-B на более поздних этапах развития мыши, генетических замена была принята стратегия, с использованием ES клеток HR-опосредованной ген ориентация технологии для генерировать серию мыши модели27. В ходе определения желаемого ES клоны, Южный blotting и ПЦР методы были использованы, и они оказались эффективной и надежной в27,28.

Этот документ намеревается представить подробное описание Южный blotting и ПЦР, включая разработку ориентированных на vector(s), кислородных и грунтовки и выполнения экспериментов, а также анализ полученных результатов свидетельствует выявление событий HR вхождение в клетки ES для создания генетических замена Нм II мыши модели и репрезентативных данных. Протоколы этих двух методов, представленные здесь также могут быть приняты для идентификации генотипов генетически модифицированные клетки или животных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. дизайн ориентации на Construct(s), зонды для Южная помарка и грунты для ПЦР

  1. Выберите первый кодирования экзона (экзона 2) Myh9 гена для нарушения или вставки в применении нокаут/запрессовка сообщили здесь.
  2. Получить 5-КБ вверх и 5-КБ течению последовательностей ДНК окружающих Myh9 экзона 2 на веб-сайте genome.ucsc.edu .
  3. Анализ моделей пищеварение ограничения ферментов (REs) с 1 – 2 сокращений в этом регионе 10-КБ с использованием программного обеспечения pDRAW для определения подходящего RE(s) переваривать геномной ДНК для Южный blotting.
    Примечание: Dra я встречает это требование и выбран для этой цели.
  4. Выберите фрагмент 4 КБ немедленно вверх по течению от Myh9 экзона 2 как рукой левой гомологии (LHA) и 1.7 kb немедленного вниз по течению последовательность фрагмент как руку правой гомологии (АРЗ); Выберите фрагмент 1 КБ 5' вверх по течению по LHA как левой зонд (LP) для Южный blotting и фрагмент 1.2 kb 3' вниз по течению от RHA как правый зонд (RP), на основе приведенного выше анализа.
  5. Используйте программу primer3 для разработки прямого и обратного Праймеры для усиления этих четырех фрагментов ДНК методом ПЦР. Дизайн пары праймеров с вперед грунт, проживали вблизи терминала 3' Выбор маркера neomyocin сопротивления гена (P1) и обратный грунт недалеко RHA (P2).
    Примечание: Эта пара грунтовка будет использоваться для выявления целевых ES клоны ПЦР29.
  6. Найти клонов BAC 129Sv, покрытие мыши Myh9 Локус гена, посетив веб-сайт bacpac.chori.org (Примечание: isogenic ДНК является предпочтительным). Изолируйте дна BAC, используя комплект для очистки больших кусков ДНК, следуя инструкциям производителя.
    Примечание: Очищенная ДНК BAC будет использоваться в качестве шаблона для амплификации PCR.
  7. Нарисуйте схематическое представление таргетинга конструкций, зонды и грунты для обобщения этой информации.

2. поколение ориентации на Construct(s) и Щупы для Южная помарка и подготовка праймеры PCR

  1. Заказать праймеры PCR, описанных выше и распустить их в концентрации 20 мкм.
  2. Усилить гомологии оружия и зонды методом ПЦР в реакции решения, в том числе 1 мкл вперед и 1 мкл обратный грунтовки, 1 мкл BAC ДНК (50 нг) как шаблон, 5 мкл буфера для ОРП и 1 мкл ультра Pfu ДНК полимеразы как , и H2O до 50 мкл. выполнять ПЦР в машину ПЦР при следующих условиях: 95 ° C 3 мин; 95 ° C за 30 сек; 60 ° C за 30 сек; 72 ° C и 1 КБ/мин; 30 циклов; Наконец 72 ° C для 10 мин.
  3. Очищают с помощью ПЦР комплект очистки согласно протоколу, предоставляемых производителем продуктов ПЦР и элюировать ДНК фрагментов с 40 мкл H2O. дайджест очищенных продуктов ПЦР с готовых ВИЭ в реакции раствор, содержащий 5 мкл 10 x буфер для REs , 2,5 мкл RE1 и 2,5 мкл RE2, и eluted ДНК, при 37 ° C на 2 ч запустить ДНК гель 1% для отдельных целевых групп ДНК, акцизный гель, содержащий целевую ДНК под УФ светом, очищают целевых фрагментов ДНК от геля с помощью ДНК гель добыча комплект согласно к протоколу, предоставляемых производителем, а элюировать ДНК фрагментов с 40 мкл H2O.
  4. Клонировать гомологии оружия и замены выражения cassette(s) в mpNTKV-LoxP вектор согласно приказу усиливается и очищенный АРЗ, LHA и замена выражение cassette(s) освобожден от других векторов для получения окончательного ориентации Construct(s). Клонировать фрагментов ДНК усиливается и очищенный зондов в T-легко вектор.
  5. Подтвердите нуклеотидные последовательности всех клонированных фрагментов ДНК последовательности27,28.

3. подготовка ориентированных на Construct(s), Electroporation клетки ES и усиления ES клонов

  1. Подготовка каждого таргетинга конструкцию с использованием плазмида maxiprep комплекта согласно протоколу, предоставляемых производителем. Линеаризации каждой конструкции плазмида, переваривание с не я в 400 мкл реакции, включая 40 мкл 10 x буфер не я, не я 10 мкл, 100 мкг ДНК и H2O до 400 мкл, при 37 ° C ночь.
  2. Очищайте линеаризованного ориентации construct(s).
    1. Экстракт переваривается реакция решение 1 x с равным объемом фенола: хлороформ: изоамиловый спирт (25:24:1) и центрифуги в силу 2000 x g за 10 мин.
    2. Супернатант передать новый 1,5 мл, осадок ДНК, используя 2.5 x этанола и 0,1 x 3M ацетат натрия (рН 5.2) (объемная доля) и центрифуги на силы g 2000 x 10 мин.
    3. Удалите супернатант, мыть ДНК гранул 1 x 1 мл 75% этанола и центрифуги в силу 2000 x g за 5 мин.
    4. Удалить супернатант и просушите ДНК Пелле за 5 мин.
    5. Растворите линеаризованного Пелле ДНК в стерильных буфера Tris-ЭДТА (TE) в конечной концентрации 1 мкг/мкл.
  3. Смешайте 50 мкг каждой линеаризованного таргетинга конструкции с 0,5 x 107 ES клеток. Выполните электропорации в 320 V и 250 МКФ. тарелка electroporated ES клеток на блюда с нео устойчивостью MEF кормушки.
  4. После 24 часов переключитесь на средний клеток ES с 400 мкг/мл G418 и 200 мкм ганцикловир и продолжать культуры для 4-5 дней с ежедневной среднего изменения. Подберите лекарственно-ES клоны в 48-ну пластины.
    Примечание: Как правило, четыре 48-ну плиты используются в конструкции.
  5. Дублировать 48-ну пластины.
    Примечание: Один набор пластин замораживают, и другой набор используется для приготовления геномной ДНК.

4. Подготовка геномной ДНК и пищеварение с Restriction Enzyme(s)

  1. Подготовка gDNAs от ES клеток с использованием коммерческих комплект (геномной ДНК очистки) с незначительными изменениями.
    1. Извлеките из культуры клеток ES и 500 мкл раствора лизис ядер, включая RNaseA, непосредственно к скважинам для Лизируйте клетки.
      Примечание: Lysate клетки могут храниться при температуре-80 ° C или лечить немедленно.
    2. Накапайте вверх и вниз несколько раз, чтобы лизировать клетки полностью и передавать их на чистой 1,5 мл.
    3. Добавить одну треть объема решение осадков белок 1,5 мл, вихревой энергично для 20 s, chill образцы на льду на 5 минут и затем, центрифуги в силу 2000 x g 5 мин супернатант передать другой чистый 1,5 мл трубки Контаи Нин равным объемом изопропиловый спирт; Аккуратно перемешайте раствор. (Обратите внимание, что в этот момент можно увидеть белые пряди нитевидные.) Центрифуга в силу 2000 x g 1 мин; затем удалить супернатант.
    4. Помыть лепешка геномная ДНК с 1 мл 70% этанола при комнатной температуре, центрифуги в силу 2000 x g за 1 мин, тщательно удалить супернатант, а затем просушите геномная ДНК Пелле за 3 мин.
    5. Распустить gDNAs с 100 мкл раствора регидратации ДНК и, затем, инкубировать на 65 ° C за 1 ч или 4 ° C на ночь.
    6. Магазин gDNAs в 2-8 ° C.
  2. Дайджест gDNAs с подготовлены RE Dra I. Установите вверх 30-мкл пищеварение реакции, смешивая 3 мкл 10 x буфер для Dra I, 3 мкл Dra я, 10 мкг gDNAs/образца, и H2O до 30 мкл и инкубировать при 37 ° C на ночь.
  3. Проверьте полноту пищеварение ДНК гель, анализируя 5 мкл переваривается реакции и затем добавьте 3 мкл 10 x буфер ДНК загрузки для последующего шага.

5. южный Blotting и ПЦР идентификации

  1. Южный blotting скрининг
    1. Отдельные усваивается gDNAs электрофореза и передачи мембраны.
      1. Подготовить электрофореза геля агарозы 1% бромидом ethidium (EB), загрузить образцы из шаг 4.3 и лестница 1 КБ и Побегите гель с низким напряжением (30-40 V) на ночь.
      2. Взять из геля и сфотографироваться на память с системой гель изображения ДНК после электрофореза. Проверьте ли перевариваются и раздельный gDNAs мазка как изображение.
      3. Замочите геля в поднос с 0,2 N HCl решение и встряхните его мягко в течение 20 минут при комнатной температуре.
      4. Передача гель для ДНК денатурации раствора и встряхните его мягко в течение 20 минут при комнатной температуре.
      5. Переключить гель в ДНК нейтрализации раствора и встряхните его мягко в течение 20 минут при комнатной температуре.
        Примечание: Гель подвержены поломки после этого шага, поэтому она должна обрабатываться тщательно.
      6. Используйте систему быстрой нисходящей передачи передать мембраны DNAs от геля. Соберите TurboBlotter и blotting стека в соответствии с инструкциями производителя.
        Примечание: 10 x или 20 x раствор солевой раствор натрия цитрата (SSC) используется в качестве буфера передачи. В общем 3 h передачи является достаточно передать 95% gDNAs от геля мембраны; Однако больше времени передачи безобидным.
      7. Вынуть мембраны и мыть его с 2 x SSC за 1 мин, впитывают жидкость с тканей и затем перекрестные ссылки ДНК с мембраной с помощью УФ сшивателя.
        Примечание: Мембрана может храниться при температуре 4 ° C на одну неделю.
    2. Ярлык ДНК-зондов с радиоактивностью.
      1. Очищения плазмиды зонд, с помощью комплекта алкалический согласно протоколу, предоставляемых производителем.
      2. Релиз ДНК фрагментов зондов от вектор плазмиды путем EcoR пищеварение в растворе реакции, включая 5 мкл буфера для EcoR I, 2 мкл EcoR я фермента, 20 мкг плазмидной ДНК и H2O до 50 мкл , 2 ч.
      3. Запустить % 1, ДНК гель для разделения фрагментов ДНК зонд из вектора и очистить фрагментов ДНК зондов с комплектом экстракции ДНК гель согласно протоколу, предоставляемых производителем.
      4. С помощью 1 мкл раствора ДНК, измерения концентрации ДНК фрагментов ДНК зонд с спектрофотометре при длине волны 260/280 Нм.
      5. Подготовить 40-нг зонд ННО в 1,5 мл трубку с 45 мкл буфера TE, кипятить 3 мин, спина кратко и затем поместите трубки на льду на 2 мин.
      6. Добавить тепла денатурированный зонд ННО в пробирку, содержащую ДНК маркировки бисер готов к идти (-дЦТФ), накапайте вверх и вниз для микширования, 5 мкл дЦТФ [α32P] и затем Инкубируйте на 37 ° C в течение 15 мин.
      7. Очистить помеченные зонды с помощью G-50 microcolumns соответствии с инструкциями, предоставленными производителем и, затем, измерения радиоактивности, сцинтилляционный счетчик (необязательно).
    3. Гибридизируйте membrane(s) с метками зондами.
      1. Prehybridize мембраны.
        1. Prewarm гибридизации решение при 42 ° C за 30 мин микс 20 мл раствора подогретую гибридизации с 200 мкг кипяченой лосось спермы ДНК в 50-мл.
        2. Место мембраны в гибридизации трубку. Добавьте смешанные prehybridization решение в гибридизации трубки. Поместите его в печь гибридизации (набор прокатки и температуры при 42 ° C) и пусть prehybridization перейти на 30 мин.
      2. С меткой кислородных гибридизируйте мембраны.
        1. Вынуть трубку гибридизации и залейте раствор prehybridization в 50 мл трубки; Добавьте денатурированного зонд (нагревают при 100 ° C в течение 3 мин) с шагом 5.1.2.7 этой трубки и перемешать осторожно.
          Примечание: Уменьшите любые заставить пузыри.
        2. Вернуться гибридизации трубки смешанного решения и выполнять гибридизации при 42 ° C на ночь.
    4. Мыть membrane(s) для удаления nonhybridized зонды.
      1. Поместите membrane(s) в лоток с 1 x SSC + 0.1% SDS и поколебать мягко на 55-60 ° С за 10 мин.
      2. Передача membrane(s) к лотку с 0.5 x SSC + 0.1% SDS и нежно погрозит 55 – 60 ° С за 10 мин.
      3. Проверьте радиоактивности на membrane(s) с помощью портативный Счетчик Geiger решить, требуется ли третьей стирки.
    5. Разоблачить радиоактивности на мембраны для рентгеновских пленок.
      1. Удалите жидкость из промытого membrane(s).
      2. Обнять membrane(s) с полиэтиленовой пленкой и исправить его в экспозиции кассету.
      3. Разоблачить мембраны для двух листов рентгеновской пленки в темной комнате.
      4. Место кассеты воздействия при температуре-80 ° C на ночь или дольше.
    6. Разрабатывают фильмах для визуализации результатов. Оцените, может ли соответствующий клон ES нужную с рекомбинацией целевых или нет, в соответствии с размерами полос ДНК, обнаруженная зондов.
    7. Rehybridize же мембрана другой зонд после зачистки от используемого ПЭП согласно следующей процедуре: вывезти используется мембрана, мыть 1 x с чистой H2O, а затем, инкубировать в растворе чередование (55% формамида, 2% ГНПП, 1% SDS, H 2 O) при 65 ° C с нежным встряхивания в течение 1 – 2 ч.
  2. Идентификация PCR
    1. Выполнять ПЦР идентификации нужного ES клонов в 50 мкл реакции решения, в том числе 5 мкл 10 x PCR буфера, 2 мкл 50 мм MgSO4, 1 мкл dNTP 10 мм, 1 мкл вперед грунтовка 20 мкм, 1 мкл 20 мкм обратный грунтовка , 1 мкл высокой верности Платиновый Taq, gDNAs (~ 100 нг) и H2O до 50 мкл.
    2. Используйте следующие условия реакции PCR: первоначальный денатурации на 94° C на 3 мин, 30 циклов денатурации на 94° C за 30 сек, отжиг при 60° C за 30 s и расширение на 68° C для 132 s и последний шаг 68° C в течение 10 мин.
    3. Анализ продуктов ПЦР электрофорезом в 1,0% агарозы.
    4. Клонировать ПЦР фрагментов с их ожидаемого размера в T-легко вектор и последовательности, чтобы подтвердить наличие частичной последовательности целевого объекта vector.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этом документе описан подробный протокол Южный blotting и ПЦР, которая используется для идентификации HR события, которые произошли в ES клеток мыши для поколения Нм II генетических замена мыши модели, используя ES клеток-технологии на основе HR-опосредованной таргетинга. Хотя Южный blotting и ПЦР, а также традиционной ориентации гена технологии, широко использовались на протяжении нескольких десятилетий, успешное применение их необходимо тщательно планировать. По крайней мере эти аспек...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В настоящее время дизайнер nucleases для изменения генома до сих пор не может заменить ES клеток ген ориентация технологии из-за своих проблем-целевого воздействия, и трудности в вставке длинный ДНК фрагмента30,31. Как Золотой методы для выявления HR события, которые произошли в клетки мыши ES этот доклад содержит подробный протокол Южный blotting и ПЦР для поля. Мы проверить надежность этих методов путем анализа индивидуальных клонов из клеток ES мыши с ряда кон...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа получила поддержку Генеральной программы национального фонда естественных наук Китая (гранты № 31571432), человека провинциальных фонд Китая по естественным наукам (Грант № 2015JC3097) и исследовательский фонд образования бюро Хунань Провинция, Китай (Грант № 15 K 054).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
BAC CLONEBACPAC Resources Center (BPRC)bMQ-330E21
QIAGEN Large Construct KitQIAGEN12462
QIAquick Gel Extraction KitQIAGEN28704
QIAquick PCR Purification KitQIAGEN28104
QIAprep Spin Miniprep KitQIAGEN27104
QIAGEN Plasmid Plus Maxi KitQIAGEN12963
PfuUltra высокоточная ДНК-полимеразаAgilent600382
T-easy векторPromegaA1360
Раствор для лизиса ядерPromegaA7941
Раствор для осаждения белкаPromegaA7951
Раствор для денатурации ДНКVWR351-013-131
Нейтрализующий растворДНК VWR351-014-131
Готовые к использованию бусины для мечения ДНК (-dCTP)VWR27-9240-01
UltraPure SSC, 20xThermo Fisher15557036
UltraPur Фенол:Хлороформ:Изоамиловый спирт (25:24:1, v/v)Thermo Fisher15593031
G418Thermo Fisher10131035
Раствор ДНК спермы лососяThermo Fisher15632011
Platinu Taq DNA Polymerase High FidelityThermo Fisher11304029
Not I ThermoScientificER0592
Dra iThermo ScientificER0221
EcoR iThermo ScientificER0271
ГанцикловирСигмаG2536
Ватман  Система переноса TurboBlotter, большие комплектыFisher Scientific09-301-188
[α 32P]dCTPPerkinElmerNEG013H100UC
ProbeQuan G-50 MicroColumns GE Healthcare28-9034-08
Hybrisol I Гибридизационный растворMilliporeS4040
Kodak X-Ray FilmZ& Z Медицинский844 5702

Ссылки

  1. Gao, G., McMahon, C., Chen, J., Rong, Y. A powerful method combining homologous recombination and site-specific recombination for targeted mutagenesis in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 13999-14004 (2008).
  2. Skarnes, W., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474 (7351), 337-342 (2011).
  3. Vogel, G. Nobel Prizes. A knockout award in medicine. Science. 318 (5848), 178-179 (2007).
  4. Salsman, J., Dellaire, G. Precision genome editing in the CRISPR era. Biochemistry. Cell Biology. 95 (2), 187-201 (2017).
  5. Capecchi, M. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nature Reviews Genetics. 6 (6), 507-512 (2005).
  6. Van, dW. L., Adams, D. J., Bradley, A. Tools for targeted manipulation of the mouse genome. Physiological Genomics. 11 (3), 133-164 (2002).
  7. Glaser, S., Anastassiadis, K., Stewart, A. F. Current issues in mouse genome engineering. Nature Genetics. 37 (11), 1187(2005).
  8. Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature. 309 (5965), 255-256 (1984).
  9. Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector. Nature. 323 (6087), 445-448 (1986).
  10. Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51 (3), 503-512 (1987).
  11. Skarnes, W. C., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474 (7351), 337(2011).
  12. Collins, F. S., Rossant, J., Wurst, W. A mouse for all reasons. Cell. 128 (1), 9-13 (2007).
  13. Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nature Biotechnology. 25 (1), 91-99 (2007).
  14. Pettitt, S. J., et al. Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic resources. Nature Methods. 6 (7), 493-495 (2009).
  15. Gertsenstein, M., et al. Efficient Generation of Germ Line Transmitting Chimeras from C57BL/6N ES Cells by Aggregation with Outbred Host Embryos. PLoS One. 5 (6), 11260(2012).
  16. Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal |[beta]|-globin locus by homologous recombination. Nature. 317 (6034), 230-234 (1985).
  17. Deng, C., Capecchi, M. R. Reexamination of gene targeting frequency as a function of the extent of homology between the targeting vector and the target locus. Molecular & Cellular Biology. 12 (8), 3365(1992).
  18. Lay, J. M., Friishansen, L., Gillespie, P. J., Samuelson, L. C. Rapid confirmation of gene targeting in embryonic stem cells using two long-range PCR techniques. Transgenic Research. 7 (2), 135-140 (1998).
  19. Langerak, P., Nygren, A. O. H., Schouten, J. P., Jacobs, H. Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA. Nucleic Acids Research. 33 (22), 188(2005).
  20. Gómezrodríguez, J., et al. Advantages of q-PCR as a method of screening for gene targeting in mammalian cells using conventional and whole BAC-based constructs. Nucleic Acids Research. 36 (18), 117(2008).
  21. Kim, H. S., Smithies, O. Recombinant fragment assay for gene targeting based on the polymerase chain reaction. Nucleic Acids Research. 16 (18), 8887-8903 (1988).
  22. Joyner, A. L., Skarnes, W. C., Rossant, J. Production of a mutation in mouse En-2 gene by homologous recombination in embryonic stem cells. Nature. 338 (6211), 153-156 (1989).
  23. Ma, X., Adelstein, R. S. The role of vertebrate nonmuscle Myosin II in development and human disease. Bioarchitecture. 4 (3), 88-102 (2014).
  24. Malonek, D. Relationships between the dynamics of cortical blood flow, oxygenation, and volume changes following sensory stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, (1997).
  25. Takeda, K., Kishi, H., Ma, X., Yu, Z. X., Adelstein, R. S. Ablation and mutation of nonmuscle myosin heavy chain II-B results in a defect in cardiac myocyte cytokinesis. Circulation Research. 93 (4), 330-337 (2003).
  26. Conti, M. A., Evenram, S., Liu, C., Yamada, K. M., Adelstein, R. S. Defects in cell adhesion and the visceral endoderm following ablation of nonmuscle myosin heavy chain II-A in mice. Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41263-41266 (2004).
  27. Wang, A., et al. Nonmuscle myosin II isoform and domain specificity during early mouse development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (33), 14645-14650 (2010).
  28. Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238(2012).
  29. Liu, T., et al. Identification and characterization of MYH9 locus for high efficient gene knock-in and stable expression in mouse embryonic stem cells. PLoS One. 13 (2), 0192641(2018).
  30. Saito, S., Adachi, N. Advances in the Development of Gene-Targeting Vectors to Increase the Efficiency of Genetic Modification. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 39 (1), 25-32 (2016).
  31. Langerak, P., Nygren, A., Schouten, J., Jacobs, H. Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA. Nucleic Acids Research. 33 (22), 188(2005).
  32. Martin, S. L., et al. A single amino acid substitution in ORF1 dramatically decreases L1 retrotransposition and provides insight into nucleic acid chaperone activity. Nucleic Acids Research. 36 (18), 5845-5854 (2008).
  33. Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens. Nucleic Acids Research. 33 (19), 173(2005).
  34. Luo, Y., Bolund, L., Sørensen, C. B. Pig gene knockout by rAAV-mediated homologous recombination: comparison of BRCA1 gene knockout efficiency in Yucatan and Göttingen fibroblasts with slightly different target sequences. Transgenic Research. 21 (3), 671-676 (2012).
  35. Croning, M. D., Fricker, D. G., Komiyama, N. H., Grant, S. G. Automated design of genomic Southern blot probes. BMC Genomics. 11 (1), 74(2010).
  36. Zimmer, A., Gruss, P. Production of chimaeric mice containing embryonic stem (ES) cells carrying a homoeobox Hox 1.1 allele mutated by homologous recombination. Nature. 338 (6211), 150-153 (1989).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Определение события гомологичная рекомбинация в мышиных эмбриональных стволовых клеток с использованием южный Blotting и цепной реакции полимеразы
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.