Здесь мы представляем протокол для разделения тилакоидов растворимых комплексов электрофорезом геля родной зеленый. Основные шаги для анализа данных предоставляются и впоследствии зеленый гель полосы характеризуются по время коррелирует одного фотонов подсчета (TCSPC).
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Разделение шпинат тилакоидов белковых комплексов родной электрофорез геля Грин и группа характеристик с помощью подсчета Time-Correlated один фотон
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Свет реакции фотосинтеза осуществляется серия пигментированной белковых комплексов в тилакоидной мембраны. Стехиометрии и организации этих комплексов высокодинамичные как длинные, так и шкал короткое время благодаря процессам, которые адаптируют фотосинтез к изменяющимся условиям окружающей среды (то есть, не фотохимического тушения, переходы между состояниями и Долгосрочный ответ). Исторически эти процессы были описаны спектроскопически с точки зрения изменений в хлорофилловое свечение, и спектроскопии остается жизненно важным методом для мониторинга фотосинтетической параметров. Существует ограниченное количество способов, в котором основной белок сложной динамики могут быть визуализированы. Здесь мы описываем быстрый и простой метод для разделения с высоким разрешением и визуализации тилакоидов комплексов, родной зеленый гель-электрофорез. Этот метод в сочетании с коррелированных по времени одиночных фотонов, считая подробных характеристик свойств флуоресценции хлорофилла полос, разделенных на зеленый гель.
Введение
Фотосинтетические организмы должны постоянно корректировать их физиологии изменения экологических условий, чтобы максимизировать их производительность и успешно конкурировать с соседями1. Это особенно верно в отношении механизма, ответственного за свет реакции фотосинтеза, как освещенности условия может колебаться на трех порядков между тенями и полного солнечного света. Кроме того экологические факторы, такие, как засухи, холода или тепла стресс может уменьшить наличие углекислого газа для фиксации углерода, который является естественным электрона раковина для продуктов реакций света. Растения должны, таким образом, урожай и максимально эффект....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. штока решения подготовка для наливания родной зеленый гели
- Подготовьте 4 x концентрированной буферный раствор для разрешения гели, состоящий из 40% глицерина, глицин 200 мм и 100 мм трис-буфер с рН 8.3.
- Подготовьте 4 x концентрированной буферный раствор для укладки гели, состоящий из 40% глицерина, глицин 200 мм и 100 мм трис, буферизуются до pH 6,3.
- Храните эти буферы на 4 ° C, чтобы предотвратить рост плесени.
Примечание: Буферы стабильны для месяцев при температуре 4 ° C, поэтому рекомендуется подготовка 100-200 мл каждого буфера для дальнейшего использования. - Подготовка 1 Л 10 x работает буфер, содержащий 250 мм Tris-H....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Представитель результаты для зеленой электрофорез представлены на рисунке 1. Переулок 1 приведен пример идеальных результатов для электрофореза геля зеленым шпинатом тилакоидов, в котором видны максимальное количество четкие, резкие зеленые полосы. Эти результаты несколько нетипичных, отчасти потому, что не все группы видели в полосе 1 обычно присутствуют в данной выборке. Дополнительные примеры очистки, в виде хлоропласта изоляции до тилакоидов солюбилизация.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Успешный тилакоидов солюбилизация и родной гель запустить приведет к резолюции несколько отдельных видны зеленые полос на гель без существенных искажений или мазать полос. Перегрузка гель, высокой концентрации моющего средства, неправильный пример рН, сжимающих материал, управлением гель слишком быстро или при слишком высокой температуре, и неправильно налил гель являются все факторы, которые могут способствовать плохо решен тилакоидов комплексов. Во время оптимизации условий геля самой (например., градиент конц.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют отсутствие конфликта интересов.
Благодарности
Финансирование и поддержка были предоставлены Департаментом химии в университете штата Мичиган.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Глицин | Sigma | G8898 | |
| Трис основание | Sigma | #648310 | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| Децил мальтозид | Sigma | D7658 | n-децил бета d мальтопиранозид, не додецил мальтозид или альфа децил мальтозид |
| Октилглюкозид | Sigma | O8001 | |
| Акриламид | BioRad | 161-0148 | 37,5/1 C 40% раствор |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | |
| Персульфат аммония | BioRad | 161-0700 | |
| Хлорид магния | Sigma | M2670 | |
| Хлорид калия | Sigma | P9333 |
Ссылки
- Yamori, W. Photosynthetic response to fluctuating environments and photoprotective strategies under abiotic stress. Journal of Plant Research. 129 (3), 379-395 (2016).
- Kim, J. H., Nemson, J. A., Melis, A.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
