Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Анализ выражения гена эндотелиальных клеток, подвергается сдвига стресс с помощью нескольких камер параллель плита потока

8.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58478

⸱

21 октября 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Keenan Research Centre in the Li Ka Shing Knowledge Institute, St. Michael's Hospital, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 4Department of Medicine, University of Toronto

В этой статье

Краткое содержание

Здесь представлен рабочий процесс для анализа выражения культуры и гена эндотелиальных клеток под жидкости касательное напряжение. Входит физическое расположение одновременно жилья и мониторинга несколько камер потока в контролируемой среде и использования внешних ссылок РНК для количественного PCR.

Аннотация

Мы описываем процесс для анализа экспрессии генов из эндотелиальных клеток при условии устойчивого ламинарного потока, с помощью нескольких камер контроль потока параллельно плита. Эндотелиальные клетки формируют внутренней клеточной оболочки кровеносных сосудов и хронически подвергаются воздействию силы трения потока крови, называется касательное напряжение. В физиологических условиях, функции эндотелиальных клеток в присутствии различных условий касательное напряжение. Таким образом применение условий касательное напряжение в модели в пробирке может обеспечить большую проницательность в эндотелиальных ответы в естественных условиях. Ранее опубликованные Лейн et al. палата параллель плита потока 9 адаптированы для изучения эндотелиальной гена регулирование в наличие и отсутствие устойчивого ламинарного потока (не ударные). Основные приспособления в настройке для ламинарного потока как здесь представлены включают в себя большой, посвященный окружающей среде дом параллельных потока цепей, мониторинг скорости потока в режиме реального времени и включение ведения экзогенных РНК для нормализации количественные данные ПЦР в реальном времени. Для оценки нескольких лечения/условий с применением касательное напряжение, несколько схем потока и насосы используются одновременно в рамках же инкубатор с подогревом и увлажненной. Скорость потока каждого потока цепи измеряется постоянно в режиме реального времени для стандартизации условий касательное напряжение во всем экспериментов. Потому что эти эксперименты имеют несколько условий, мы также используем РНК внешних ссылок, с шипами в во время извлечения РНК для нормализации РНК добыча и эффективность синтеза cDNA перв стренги. Эти шаги минимизировать изменчивость между выборками. Эта стратегия работает в нашем трубопровода для анализа выражения гена с касательное напряжение эксперименты с использованием потока параллельной пластине камеры, но частей этой стратегии, такие как экзогенные ссылку Спайк в РНК, можно легко и экономически эффективно использоваться для другие приложения.

Введение

Сосудистые эндотелиальные клетки формируют сотовой мотопомпам кровеносных сосудов в закрытые сердечно-сосудистой системы высших видов. Они формируют интерфейс между кровью и тканями и характеризуются Люминал и abluminal поверхностей. Эндотелий-это разнообразные, активных и адаптивной системы, которая регулирует поток крови, питательных людьми, иммунитета и роста новых кровеносных сосудов1. В организме эндотелиальные клетки обычно существуют в среде, где они подвергаются воздействию силы трения обращения, касательное напряжение2. Касательное напряжение является важным регулятором эндотелиальных клеток ген выражение3, и эндотелиальных клеток пытаются поддерживать касательное напряжение в пределах заданного диапазона2,4. Эндотелиальные клетки демонстрируют ангиогенных кучность при отсутствии касательное напряжение5 , которая может улучшить перфузии тканей. Региональные модели нарушается потока и изменены касательное напряжение связано с выражением воспалительные гены6 и развитие атеросклероза7,8. Таким образом модели, которые включают касательное напряжение являются основным компонентом понимания эндотелиальной гена регулирования.

Мы описываем метод для изучения гена регулирование в сосудистой эндотелиальных клетках под напряжение сдвига. Эта система использует не пульсирующего потока и имитирует уровни жидкости касательное напряжение и концентрация кислорода что модель условия для артериальной эндотелиальных клеток. Этот протокол включает в себя детали методов нокдаун гена, с помощью РНК-интерференции (RNAi), настройки для приложения с помощью потока параллельной пластине аппарата и методы для всплеска в экзогенных ссылки на РНК до анализа, при сдвиге обратной транскриптазы количественных полимеразной цепной реакции (RT-ПЦР). Этот трубопровод используется для изучения гена регулирование в эндотелиальных клетках в присутствии и отсутствии ламинарные касательное напряжение и включает Адаптация потока параллельной пластине аппарата описал Лейн et al. 9. этой конкретной установки был разработан для облегчения одновременного оценки нескольких экспериментальных условий, который позволяет прямое сравнение условий касательное напряжение, а также нормализации РНК анализа. Большой подогреваемый блок с контролируемой влажностью используется, чтобы разрешить несколько отдельных потока камер и насосы для быть запущена одновременно с скорости потока, контролируется для каждого потока палата Ассамблеи в режиме реального времени. Применение этой настройки используется для нокдаун гена с помощью РНК-интерференции в параметре ламинарного потока/касательное напряжение, но аспекты настоящего Протокола может быть применен к любой оценке выражения РНК.

Общие подходы к применению касательное напряжение для эндотелиальных клеток включают microfluidic систем10, конус и пластины вискозиметра11и параллельно плита потока камеры12. Microfluidic систем от различных производителей были полезны в изучении mechanobiology и mechanotransduction в несколько ячеек и типы тканей и различных биофизических раздражителей. Для эндотелиальных клеток они были использованы для изучения эндотелиальных клеток в изоляции, а также взаимодействие эндотелиальных клеток и торговлей иммунной или опухолевых клеток10. Однако эти системы являются менее пригодны для восстановления большого числа клеток9. Вискозиметр конуса и пластины и параллельно плита потока камеры позволяют восстановления большого числа клеток в вырожденная монослои12. Эти системы можно создавать широкий спектр сдвига силы и шаблоны12. Параллель плита потока палата Ассамблеи9 имеет то преимущество, что в реальном времени изображений может быть выполнена через стекло окна проверяемый клеточной морфологии в любой момент времени. Кроме того perfusate может быть собрана в стерильных условиях. Для системы, представленные здесь поток может также контролироваться в реальном времени и многокамерные ловушка, которая облегчает поддержание условий сдвига между камерами.

Для представителя экспериментов, эндотелиальные клетки человека пупочную вену (HUVEC), которые представляют тип эндотелиальных клеток macrovascular, используются, и напряжение сдвига условия мы используем (1 ПА) отражают артериальной условия (0,1 - 0,7 ПА). Однако этот протокол может использоваться с другими типами эндотелиальных клеток, и условия касательное напряжение можно отрегулировать согласно экспериментальной вопрос. Например, оценка эндотелиальных клеток человека в условиях, которые моделируют венозное кровообращение потребует более низких уровней напряжения сдвига (1-6 Па) и исследования, которые моделируют микрососудистой циркуляции использовали уровни касательное напряжение 0,4 - 1,2 Па13 , 14. Кроме того, касательное напряжение может меняться даже между эндотелиальных клеток в пределах же кровеносный сосуд6. В текущей настройке, используется единой системы мониторинга, можно одновременно отслеживать четыре отдельных потока петли. Для лабораторий, которые нужно больше потока петли есть места в специальной среде для дополнительной системы мониторинга.

RT-ПЦР используется для абсолютной количественный экспрессии генов в параметре касательное напряжение. Относительное выражение генов-мишеней часто используется для сравнения РНК выражение условия. Некоторые виды РНК может существовать на очень низком количестве или отсутствуют, что затрудняет относительных измерений. К примеру длиной некодирующих РНК в эндотелиальных клетках могут оказывать мощным эффекты на относительно низкой копирования цифры в ячейки5. Кроме того различия в эффективности грунт может привести к неточной интерпретации от использования порогового значения (Ct) метод дельта дельта цикла для анализа данных. Для решения этой проблемы, мы выполняем абсолютной количественный, создавая калибровочной кривой с помощью известное количество плазмидной ДНК. Кроме того дополнительные синтеза ДНК — (cDNA кДНК) является неэффективным процессом, и различия в эффективности cDNA можно объяснить различия в РНК выражение между условиями и образцы15. Приложение касательное напряжение и/или трансфекции реагентов может повлиять на пролиферацию клеток, апоптоз и жизнеспособности, или добавить компоненты, которые могут помешать в изоляции и/или cDNA синтез РНК. Чтобы учесть возможность смещения от изоляции РНК и синтез cDNA, мы используем шип в РНК управления синтезируется в лаборатории, добавил в то время извлечение RNA и измеряется с каждым cDNA синтеза через RT-ПЦР. Это позволяет не только технические различия в добыче и cDNA синтез РНК, но также позволяет расчет абсолютного количества в клетку, когда известно число ячеек.

Эта система использует дополнительные шаги для поддержания подобия или учитывать технические различия между условиями. Мы особенно подчеркиваем эти шаги ввиду сложного характера этих экспериментов, которые включают несколько физических установок и экспериментальных условиях, которые могут привести к экспериментальной изменчивости.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. подготовка внешних ссылок РНК

Примечание: Выберите ссылку экзогенных РНК, которая не существует в модели интереса или видов. Для млекопитающих систем Светлячок Люцифераза РНК могут быть использованы.

  1. Линеаризация внешних ссылок РНК плазмиды
    1. Подготовьте экзогенных ссылка РНК по крайней мере 48 часов до предполагаемого извлечение RNA. Получить или изготовление клона cDNA выбранной экзогенных ссылки на РНК, например клона cDNA Люцифераза светлячков в вектор плазмиды, подходящие для в vitro транскрипция (см. Таблицу материалы).
    2. Выполнять Пищеварение энзима ограничения (RE) 1 мкг полнометражных плазмида (Светлячок Люцифераза плазмида является pSP-люк +, которая имеет 4100 bp) с использованием одного резак RE (XhoI) в 1,5 мл отцентрифугировать трубы. Выберите ре, это один резак (режет плазмида только 1 x) в конце 3' экзогенных ссылка последовательности РНК, которая оставляет 5' навеса или тупой конец. Для типичных приготовления выполните семь плазмида Линеаризация реакций (шаги 1.1.4 - 1.1.7) параллельно для создания достаточной концентрации РНК и количество завершить один набор экспериментов или одного проекта.
      1. Измерьте концентрацию плазмида с помощью спектрофотометрии или spectrofluorometry.
      2. Подготовка смеси RE в каждой тюбике: 4 мкл XhoI (20 000 единиц/мл), 8 мкл буфера, x µL плазмиды (1 мкг), и достаточно H2O для достижения общего решения 80 мкл.
      3. Инкубировать RE смесь для 2 ч при 37 ° C. Используйте RE согласно протоколу производителя, как любые изменения могут привести к повышенной активности звезды или неспецифических расщепление ДНАО цели. Тепла инактивирует реакционную смесь для 20 мин на 65 ° C.
      4. Прекратить RE дайджест с этанолом осадков в каждой тюбике. RE-микс непосредственно мкл 4 0.5 М ЭДТА рН 8,0, 8 мкл 3 M натрия ацетата рН 5.2 и 184 µL 100% этанола. Хорошо перемешайте и заморозить смесь при-20 ° C за 30 мин.
      5. Спин вниз смеси на 4 ° C на 20 мин в относительная центробежная (РРС) 16,100 x g.
      6. Удалите супернатант с тонкой кончиком, не касаясь гранулы. Просушите Пелле за 5 мин и Ресуспензируйте в 6 мкл H2O (разогрет до 37 ° C), закупорить вверх и вниз 5 x - 10 x.
      7. Подтвердите Линеаризация Люцифераза плазмида, запустив переваривается продукта на 2% агарозном геле, содержащие бромид ethidium (бромистый этидий) наряду с 1 КБ + лестница, supercoiled лестница и вырезать и неподрезанные плазмиды. Осмотрите гель и перейти к в vitro транскрипция если полосу для резки плазмида показывает одной полосы в ~ 4 КБ (режиссерский плазмиды будет иметь три полосы; Рисунок 1).
        Предупреждение: Бромистый этидий канцерогенами. Работа в химической зонта.
  2. В in vitro транскрипция внешних ссылок РНК плазмиды
    1. Для каждой трубы переваривается плазмида продуктов, выполняют в vitro транскрипция с использованием метода в vitro транскрипция (см. Таблицу материалы). Следуйте инструкциям производителя и использовать соответствующие Фаговые РНК-полимеразы. Если метод синтеза cDNA требует poly(A) хвост, или другие приложения требуют poly(A) хвост, выбрать метод в vitro транскрипция, который включает в себя добавление хвост poly(A) (см. Таблицу материалы).
    2. Объединить все в vitro расшифрованный продуктов в один 1,5 мл полипропиленовые трубы до очистки.
  3. Purif мышсы РНК в vitro транскрипция реакции
    1. Очищение в vitro расшифрованный продуктов с в vitro транскрипция очистки комплект (см. Таблицу материалы). Пожалуйста, следуйте производителя протокол.
    2. Оценка концентрации РНК путем измерения оптической плотности на 260 Нм, с помощью спектрофотометрии.
      Примечание: Концентрация РНК рассчитывается с использованием Закон Бугера-Ламберта — Бера. Это утверждает, что поглощение нуклеиновых кислот (которые поглощают свет сильно на 260 Нм) пропорциональна к концентрации. Абсорбция 1.0 равен 40 мкг/мл одноцепочечной РНК.
  4. Aliquoting запас РНК в ПЦР пробирок для экспериментального использования
    1. Убедитесь, что концентрация РНК-1 мкг/мкл.
      1. Если концентрация РНК > 1 мкг/мкл, разбавленных запас 1 мкг / мкл. аликвота 1 мкл в ПЦР пробирок и хранить их в-80 ° C.
      2. Если концентрация РНК < 1 мкг/мкл, дополнительных осадков с использованием ацетата аммония 5 M (поставляется в комплекте) может выполняться в соответствии с протоколом производителя. Если концентрация РНК до сих пор < 1 мкг/мкл, продолжите aliquoting 1 мкл в пробирки ПЦР.

2. Сдвиньте покрытие

Примечание: Шаги 2.1-2.10 должна быть осуществляется 24-48 ч до посева предполагаемых клеток.

  1. Разогреть духовку до 250 ° C.
  2. С помощью стерильных перчаток, обернуть каждый стекла слайд 2 x с алюминиевой фольгой. Не прикасайтесь к поверхности слайда непосредственно.
  3. Выпекать слайды в духовке в течение 1 ч при 250 ° C и позволяют слайды остыть до комнатной температуры.
    Примечание: Этот шаг имеет важное значение для уничтожения любых загрязняющих эндотоксин.
  4. В то время как охлаждение слайды, сделать фибронектин Стоковый раствор 1 мг/мл дистиллированной водой и Инкубируйте 30 минут при 37 ° C распустить. Сделайте 100 мкл аликвоты. Отложите аликвоты для немедленного использования и заморозить остальные аликвоты для использования в будущем.
  5. Берем внешнее покрытие алюминиевой фольги перед вводом стеклянное скольжение в биобезопасности кабинета. Выполните шаги 2,6-2,7 и 2,9 в кабинет биобезопасности.
  6. Поместите слайд стекла в стерильных Прямоугольные ячейки 4-ну культуры блюдо.
  7. Разбавьте фибронектин Стоковый раствор 1: 100 с дистиллированной водой. Покройте каждый слайд с 1 мл разбавленной фибронектин, по капле, с помощью пипетки. Убедитесь, что охватывает весь слайд.
  8. Инкубируйте слайды в инкубатор культуры ткани при 37 ° C за 24-48 ч.
  9. После инкубации аспирационная фибронектин, наклоняя 4-ну клетки культуры блюдо. Не прикасайтесь слайд непосредственно с аспиратором.

3. клетки, посев на стекло слайды

  1. Граф человека эндотелиальных клеток в начале прохода (проход 2-5) и семян ~1.0 х 106 клеток на каждый слайд фибронектин покрытием стекла с 1 мл раствора СМИ (1.0 х 106 клеток/мл СМИ). Семя клетки 24 ч до предполагаемого применения ламинарного потока, если не лечение должны быть выполнены.
    Примечание: Эти цифры используются в качестве руководства для экспериментов с 24 h потока.
    1. Регулировка посева плотности для достижения вырожденная монослоя клеток во время уборки клеток и извлечение RNA.
  2. Пусть клетки придерживаться слайд 15 мин при температуре 37 ° C.
  3. Добавить 3 мл средства массовой информации в каждой скважине клетки культуры блюдо для покрытия слайд и инкубации клеток при 37 ° C в течение 24 ч с 5% CO2.

4. Малые вмешательство РНК (siRNA) Transfection

  1. Подготовка клетки на стеклянных вставках siRNA transfection и потока экспериментов
    1. Следуйте протокол в шагах 2 (скользящим покрытием) и 3 (ячейка посева на стеклянных вставках) для подготовки слайд стекла и покрытие для потока экспериментов.
    2. Семя клетки 24 ч до начала лечения малых интерферирующих РНК (48 ч до применения ламинарного потока).
    3. Семя человека эндотелиальных клеток в антибиотик свободных СМИ в 750 000 до 1 x 106 клеток на слайд, чтобы достичь слияния 85% - 95% на следующий день.
      Примечание: HUVEC используются в настоящем Протоколе.
  2. Подготовка на основе малых интерферирующих РНК липидов трансфекции реагент комплексов (на слайде)
    1. Проектирование пользовательских малые интерферирующие РНК или заказать готовые малые интерферирующие РНК для нужного гена интереса.
      Примечание: Выполните следующие действия в области биобезопасности кабинета.
    2. 6 мкл интерферирующей РНК (20 мкм акций) в 414 мкл сокращение сыворотке среды (см. Таблицу материалы) и осторожно перемешать, закупорить.
    3. Разбавить 49,5 мкл Реагента нежно смешанных липидных transfection (см. Таблицу материалы) в 130,5 мкл сокращение сыворотке среды.
    4. Осторожно перемешать и инкубации при комнатной температуре в течение 5 мин.
    5. Объединить разреженных малые интерферирующие РНК и липидных трансфекции реагента, осторожно перемешать и Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре. Смесь осторожно, чтобы избежать нарушения комплексов на основе липидов трансфекции реагента.
      Примечание: Решение может появиться облачно виде комплексов.
    6. В то время как формируются комплексы, удалите среднего роста и вымыть клетки 1 x с сокращение сыворотке среднего.
    7. Добавление 2,4 мл среды сокращение сыворотке каждый слайд.
    8. 600 мкл нежно смешанные на основе малых интерферирующих РНК липидов трансфекции реагент комплексов для каждой пластины и рок плита взад и вперед, чтобы смешать. Конечная концентрация siRNA обеспечивает 40 Нм. Убедитесь, что слайд полностью покрыта.
    9. Инкубируйте клетки при 37 ° C в течение 4 ч.
    10. Добавьте 1 mL антибиотиков бесплатно эндотелиальных клеток роста сред, содержащих 3 x нормальной концентрации плода бычьим сывороточным (ФБС) без удаления трансфекции смеси.
    11. Инкубируйте клетки при 37 ° C до готовой к использованию.

5. Расчет скорости потока, основанные на желаемый касательное напряжение9

  1. Рассчитайте скорость потока, основанные на желаемый касательные напряжения по следующему уравнению:
    figure-protocol-1
    Здесь,
    Q является скорость потока мл/мин;
    Τ является желаемой касательное напряжение в Дин/см2 (1 ПА = 10 Дин/см2);
    w – ширина потока параллельной пластине камеры в см;
    h – высота параллель плита потока камеры в см;
    мкг является вязкость СМИ в cP (g/cm·s).
    Примечание: Типичные слоистые касательное напряжение (не ударные) в этом рабочем процессе являются эксперименты на τ = 1 Па (10 Дин/см2). µ может быть измерена с помощью вискозиметра как вискозиметр конус и пластины и может варьироваться в зависимости от содержания средств массовой информации, включая сыворотки и дополнительные декстрана9.
  2. Для достижения конкретных τ (касательное напряжение), отрегулируйте скорость потока и/или вязкость. На более высокой скорости потока адэрентных клеток может отмежеваться от слайда. Образец потока с типичного потока камеры приводятся в таблице 1.

6. Создание специальных условий для системы мониторинга и несколько камер параллель плита потока (рис. 2)

  1. Используйте большой подогреваемый единица/инкубатор с несколькими полками, доступ внутренних электричество и стеклянные двери — называется пляж (встроенный среды с регулируемый CO2 ) и тепла — в доме несколько камер потока одновременно для экспериментов, требуют касательное напряжение и прямое сравнение между двумя или более лечения или результатов (например, ДНК, РНК и белков).
    Примечание: Пляж позволяет частый мониторинг потока цепи, включая скорость потока, без частые нарушения окружающей среды.
  2. Обеспечение адекватного CO2 доступен для эксперимента и что CO2 монитора является функциональным. Убедитесь, что лоток для воды надлежащим образом заполнены, таким образом, что там будет увлажненный воздух.

7. Настройка потока параллельной пластине аппарата

Примечание: Для изготовления параллельных пластин, пожалуйста, смотрите Лейн и др. 9.

  1. Автоклав потока камеры плиты, водохранилище, увлажнитель, труб и Люрс для каждой настройки камеры параллельно плита потока как указано в таблице 2.
  2. Настройка потока Петля Ассамблеи (рис. 3).
    1. Место стерильным полотенца в биологической безопасности кабинета. Соберите поток цикла системы, сначала без камеры потока параллельной пластине, в кабинете биологической безопасности.
    2. Подключение трубки Ассамблеи для водохранилища:
      1. Вставьте трубу жесткий #14 в одно отверстие и два #14 мягкие трубы в другие два отверстия в крышке резервуара потока. Убедитесь, что один из мягких труб касается нижней части водохранилища как отток труб.
      2. Место 1/16" мужской Luer в конце #14 жесткие трубки и прикрепить стерильные фильтр как вентиляционного воздуха.
      3. Место 1/16" женский Luer в конце #14 мягкие приток трубки, приходя от водохранилища и прикрепите 4-ходовой кран.
        Примечание: Анализ выражения гена или других исследований, где перфузатов не обязательно должны быть собраны, 2-полосная запорные краны может использоваться вместо 4-ходовые краны запорные в настоящем Протоколе.
      4. Место 1/16" мужской Luer в конце трубки #14 мягкие отток, приходя из водохранилища.
    3. Подключиться насос труб НКТ отток водохранилище: место 1/16" женский Luer на каждом конце жесткие трубки #13 (насос труб). Подключение трубки #14 мягкие отток из водохранилища к жесткие трубки #13 путем соединения 1/16" мужского и женского Люрс вместе.
    4. Подключение шланга насоса с «увлажнитель мост» трубы: место 1/8" мужской Луер и 1/8" женский Luer на каждом конце #16 мягкой трубки. Подключение 1/16" женский Luer #13 жесткие трубки (в конце отток насоса трубки) с 1/8" мужской Luer #16 мягкой трубки.
    5. Монтаж труб для потока увлажнитель: место 3/16" мужской Luer на одном конце #25 мягких труб и повторите для другой стороны потока увлажнитель. Прикрепите свободные концы #25 мягкие трубы к каждой стороны потока увлажнитель.
    6. Подключение трубки «увлажнитель мост» с трубки для потока увлажнитель: подключение #25 мягкие трубки из потока увлажнитель с мягкой трубки #16 «увлажнитель моста», используя 1/8" женский Luer со стороны #16 «увлажнитель мост» и уже размещены 3/16" мужской Luer со стороны метро #25 мягкие увлажнитель.
    7. Сборка «палата мост» труб:
      1. Место 1/8" женский Луер и 1/8" мужской Luer на каждом конце #16 мягкой трубки («палата мост» трубы).
      2. Подключение 1/8" женский Luer «мост камеры» с 3/16" мужской Luer на мягкой трубки #25 от свободного конца потока увлажнитель.
      3. В 1/8" мужской Luer (свободный конец) «Палата мост» труб, место 4-ходовой кран.
    8. Подключите 4-ходовой кран от «палата мост» свободный конец к 4-ходовой кран от водохранилища приток мягких труб (из 7.2.2.3 шага). Закройте запорные краны.
    9. Добавьте средства массовой информации в водохранилище и увлажнитель. Для сдвига стресс воздействия 48-h добавьте 35 мл средства массовой информации в водохранилище и 25 мл в увлажнитель. Отрегулируйте громкость средств массовой информации, основанные на продолжительность эксперимента потока и количество клеток семенами.
    10. Привести систему цикла собраны потока к насосу на пляже. Поместите жесткие трубки #13 (насос шланги) в головку насоса и закрепите его. Откройте запорные краны.
    11. Включите насос и постепенно увеличить скорость насоса. Пусть средства массовой информации распространять через систему цикла. Проверьте любой утечки или блокировки (например, давления). Убедитесь, что средства массовой информации поступает обратно в резервуар.
  3. Настройка потока палата Ассамблеи
    1. Место 1/8" женский Luer на одном конце #16 мягкой трубки и прикрепите 4-ходовой кран. Прикрепите свободный конец трубки на правой стороне верхней пластины (приток сторона).
    2. Место 1/8" мужской Luer на одном конце #16 мягкой трубки и прикрепите 4-ходовой кран. Прикрепите свободный конец трубки в левой части верхней пластины (отток сторона) .
    3. Место 1/8" мужской" Луер "и 1/8" женский Luer на каждом конце мягкой трубки #16 (Пузырь ловушки труб). Прикрепить трубку к Пузырь ловушки через 1/8" мужской" Луер ". Прикрепить кран 4-путь к другой конец трубки через 1/8" женский Luer.
    4. С помощью стерильных пинцетов, передать клетки семенами стекло слайд из 4-ну клетки культуры блюдо выемку на нижней пластине. Убедитесь, что ячейки с семенами сторону стеклянное скольжение вверх.
    5. С помощью 10-мл шприца, добавьте 10 мл теплой СМИ к нижней пластине в пределах красных прокладки линии вокруг пластины. Разрешить СМИ через слайд и охватывают клетки. Избегайте добавления средств массовой информации непосредственно на слайд.
    6. Осторожно поместите верхней пластины на нижней пластине, совместив от одной стороны к другой. Избегайте введения воздушных пузырьков. Винт пластины вместе плотно.
    7. Удалите пузырьки воздуха из Пузырь ловушки, открыв кран на правой стороне (приток) пластины и осторожно промывки 20 мл теплого средств массовой информации, с помощью шприца 30 мл. Убедитесь, что кран на левой стороне (отток) пластины закрыт и что СМИ течет через запорный ловушка пузырь (открыть). Выбросите покраснел средств массовой информации.
    8. Закройте кран на пузырь ловушки и откройте кран на левой стороне (отток) камеры. Поднять с левой стороны (отток) камеры под углом в 45° и осторожно промойте 20 мл теплого носителей с помощью 30 мл шприц с правой стороны (приток) камеры для удаления пузырьков воздуха из камеры. Пузыри могут быть визуализированы через окно. Выбросите покраснел средств массовой информации.
    9. Закройте запорные краны по обе стороны камеры и Кап. Проверьте ячейки по микроскопии.
    10. Транспортные камеры на пляж с ранее собранный цикла системы.
    11. Медленно уменьшить скорость насоса и приостановить насоса. Закройте запорные краны на системе петлю потока для предотвращения утечки.
    12. Подключите камеру и петли системы вместе через запорные краны. Откройте все запорные краны.
    13. Постепенно увеличить скорость насоса и изучить настройки для любой утечки или закупорки. Обеспечить средства массовой информации распространяет в одном направлении и возвращает в водохранилище.
    14. Поместите датчик расхода на трубопроводах «палата мост», расположенный на приток стороне камеры. Убедитесь, что датчик правильно ориентирован в направлении потока.
    15. Отрегулируйте скорость насоса для получения скорости потока, которая была рассчитана ранее, основанный на нужное напряжение сдвига.
      Примечание: Скорость потока может варьироваться в зависимости от высоты и ширины каждой палаты, а также вязкость средств массовой информации.
    16. Включите CO2 танк для достижения 5% CO2 и поместите поддон для воды пляжа.

8. заготовка клеток и экстракции РНК из потока камеры

  1. После завершения периода желаемого времени потока, медленно поверните вниз Перистальтический насос скорость 0 и выключите питание. Быстро закрыть все открытые Краны запорные и удалить камеру и прилагаемой трубки с краном на каждом конце.
  2. Взять камеру чистой benchtop и аккуратно Открутите все винты, чтобы удалить верхнюю крышку. С помощью иглы нос пинцета удалите стекло слайд из нижней плиты и поместить его в блюдо культуры ткани диаметром 100 мм.
  3. Вымойте слайд с 10 мл холодного фосфат амортизированное saline (PBS)- / - и проверьте клетки под микроскопом, чтобы подтвердить сотовый присоединению и выравнивание в направлении потока.
  4. Аспирационная PBS с плиты и передача слайд на чистой 100 мм диаметр блюдо. 350 мкл буфера lysis от РНК добыча комплект (см. Таблицу материалы), содержащие 1/100 бета меркаптоэтанол, к слайду.
    Предупреждение: Добавьте бета меркаптоэтанол в химической зонта.
  5. Скрип клетки со слайда с помощью скребка полиэтилен лопастной клеток. Наклоните тканевой культуры блюдо, позволяя жидкости бассейн внизу и удалить слайд стекло пинцетом. Пипетка ячейки lysate в 1,5 мл пробирку и держать его на льду.
  6. Разбавить запасов экзогенных ссылка РНК (Люцифераза РНК) 0,0025 нг/мкл путем последовательного растворения до его добавления в образце. Например, если акции концентрация составляет 1 мкг/мкл, разбавления 1/400 000 необходим для достижения 0.0025 нг / мкл. Добавить 10 мкл разбавленный Люцифераза РНК для каждого образца клеток lysate течению РНК изоляции и анализа.
  7. Продолжить с РНК добыча протокола в соответствии с инструкциями производителя, или заморозить lysate-80 ° c, пока не в состоянии приступить к добыче.

9. Расчет эффективности добычи РНК и синтез cDNA

Примечание: Рассчитайте эффективность Люцифераза после RT-ПЦР, сравнивая теоретическую доходность и экспериментальная урожайность.

  1. Определите теоретическую доходность для Люцифераза РНК.
    1. Определите общее количество копий Люцифераза, добавил на сэмпл. (Добавление 0,025 нг/образец = 2,73 x 107 копий Люцифераза РНК на сэмпл до извлечение RNA.)
    2. Вычислить молекулярную массу Люцифераза РНК с помощью средняя молекулярная масса за нуклеотидов 330 г/моль и умножив продолжительность Светлячок Люцифераза РНК, 1652 нуклеотидов.
    3. Разделите количество Люцифераза РНК добавил (0,025 нг) для каждого образца до РНК добыча по молекулярной массе приносить молярный объем. Затем умножьте это число Авогадро приносить свои копии, добавил на сэмпл.
    4. Рассчитайте теоретическую доходность для Люцифераза копий для каждой реакции RT-ПЦР, используя уравнение:
      figure-protocol-2
  2. Вычислить экспериментальная урожайность Люцифераза копий для каждой реакции RT-ПЦР с помощью Люцифераза плазмиду для создания стандартной кривой для RT-ПЦР.
  3. Рассчитайте Люцифераза КПД (%), используя уравнение:
    figure-protocol-3

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Успешное Линеаризация Люцифераза плазмида с помощью энзимов ограничения было подтверждено работает переваривается продуктов на геле агарозы (рис. 1). Размер линеаризованного продукта был подтвержден с помощью ДНК лестницы и по сравнению с необрезанный плазмиды.

Мы адаптировали настройки камеры параллельно плита потока от Лейн et al. 9 для экспериментов, которые требу...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Касательное напряжение является физиологическое состояние, который модулирует функции эндотелия, в частности, воздействуя на стационарном ген выражение2,5. Модели регулирования генов в различных условиях касательное напряжение будет способствовать более глубокому пониманию функции эндотелия. Этот прагматичный процесс включает цепь потока, используя камеру потока параллельной пластине, адаптированный Лейн et al. 9 и представляет по...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана КНИИЗ СС 142307 абстрагироваться H.S.J.M. является получателем канадский институтов из исследований учебные программы в области здравоохранения в регенеративной медицине стипендий. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. и M.K.D. являются получателями королевы Елизаветы II Магистратура стипендии в области науки и техники.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,05% Trypsin-EDTAgibco25300-062
10 мл ШприцBD302995
10 мм2 Чашка для культурыSarstedt83.3902
30 мл ШприцBD302832
4-ходовые запорные краныDiscofixD500
Алюминиевая фольга
BEACHDarwin Chambers CompanyMN: HO85, SN: скребки
ячеек
CO2 MeterBioSphenix, Ltd.MN: P120, SN: 0342
CO2 SensorBioSphenix, Ltd.MN: C700, SN: 52852
Дистиллированная водаgibco15230-170
Фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS) -/-gibco14190-144
Среда для роста эндотелиальных клеток 2Promo CellC-22011
Среда для роста эндотелиальных клеток 2 Смесь добавокPromo CellC-39216
Фибронектин (чистый)Sigma-Aldrich11051407001
фильтр (0,20 мкм)Sarstedt83.1826.001
Демпфер потока и колпачокU of T стеклодувной цех
Расходомер: Консоль серии 400 TransonicScisense Inc.Расходомер T402
: трубки серии 400Transonic Scisense Inc.TS410
Резервуар расхода и крышкаU of T стеклодувного цеха
Датчик расходаTransonic Scisense Inc.ME4PXL
Isotemp 737F ДуховкаFisher ScientificFI-737F
Jткань
Предметное стекло для микроскопа (25 x 75 x 1 мм)Fisherfinest12-544-4
Бумажный мешочек для стерилизацииCardinal Health92713
Насос (Masterflex L/S Экономичный привод)Cole-Parmer7554-90
Головка насоса (Masterflex L/S Easy Load)Cole-Parmer7518-00
прямоугольная 4-луночная чашкаThermo Scientific267061
пинцет<
strong>НазваниеCompanyНомер в каталогеКомментарии
>Трубки
Masterflex C-Flex L/S 25 Мягкая трубкаCole-Parmer06424-25
Masterflex C-Flex L/S 14 Мягкая трубкаCole-Parmer06424-14
Masterflex C-Flex L/S 16 Мягкая трубкаCole-Parmer06424-16
Masterflex PharMed BPT L/S 13 Жесткая трубкаCole-Parmer06508-13
Masterflex PharMed BPT L/S 14 Жесткая трубкаCole-Parmer06508-14
Название<strong>Company>Номер в каталогеКомментарии
Luer
3/16" Наружная резьба LuerCole-Parmer45518-08Для трубки #25
1/8" Наружная резьба LuerCole-Parmer30800-24Для трубки #16
/8" Внутренняя резьба LuerCole-Parmer30800-08Для трубки #16
Наружная резьба 1/16" Наружная резьба LuerCole-Parmer45518-00Для трубки #14
/16" Женская LuerCole-Parmer45508-00Для трубки #14
НазваниеCompanyНомер в каталоге<strong>Комментарии
Knockdown reagents
Oligofectamine ReagentInvitrogen12252-011
Opti-MEM I Уменьшенная сыворотка Mediumgibco31985-070
Название< strong>CompanyНомер в каталоге>Комментарии
In vitro транскрипция
Generuler 1kb+ DNA ladderThermo ScientificSM1331
MEGAclear KitAmbionAM1908
mMESSSEGE mMACHINE SP6 Набор для транскрипцииAmbionAM1340
pSP-luc+PromegaE4471
Supercoiled DNA LadderNew England BioLabs Inc.N0472S
UltraPure AgaroseInvitrogen16500-500
UltraPure Фермент Бромид ЭтидияInvitrogen15585011
XhoI Фермент РестрикцииNew England BioLabs Inc.R0146S
НазваниеCompany>Номер в каталоге>Комментарии
РНК экстракция
Бета-меркаптоэтанолSigmaM3148-100mL
RNeasy Mini KitQiagen74104
4947549 1 1

Ссылки

  1. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), (2012).
  2. Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).
  3. Garcia-Cardena, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (8), 4478-4485 (2001).
  4. Cybulsky, M. I., Marsden, P. A. Effect of disturbed blood flow on endothelial cell gene expression: a role for changes in RNA processing. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (9), 1806-1808 (2014).
  5. Man, H. S. J., et al. Angiogenic patterning by STEEL, an endothelial-enriched long noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2401-2406 (2018).
  6. Won, D., et al. Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow. The American Journal of Pathology. 171 (5), 1691-1704 (2007).
  7. Baeyens, N., et al. Vascular remodeling is governed by a VEGFR3-dependent fluid shear stress set point. eLIFE. 4, 04645(2015).
  8. Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. The atherosusceptible endothelium: endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo. Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).
  9. Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), 3349(2012).
  10. Gray, K. M., Stroka, K. M. Vascular endothelial cell mechanosensing: New insights gained from biomimetic microfluidic models. Seminars in Cell and Developmental Biology. 71, 106-117 (2017).
  11. Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress. Review of Scientific Instruments. 53 (12), 1851-1854 (1982).
  12. Resnick, N., Gimbrone, M. A. Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression. The FASEB Journal. 9 (10), 874-882 (1995).
  13. Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. The Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).
  14. DeStefano, J. G., Xu, Z. S., Williams, A. J., Yimam, N., Searson, P. C. Effect of shear stress on iPSC-derived human brain microvascular endothelial cells (dhBMECs). Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 20(2017).
  15. Thormar, H. G., et al. Importance of the efficiency of double-stranded DNA formation in cDNA synthesis for the imprecision of microarray expression analysis. Clinical Chemistry. 59 (4), 667-674 (2013).
  16. Johnston, S., Gallaher, Z., Czaja, K. Exogenous reference gene normalization for real-time reverse transcription-polymerase chain reaction analysis under dynamic endogenous transcription. Neural Regenation Research. 7 (14), 1064-1072 (2012).
  17. Vaughan-Shaw, P. G., et al. A simple method to overcome the inhibitory effect of heparin on DNA amplification. Cellular Oncology (Dordrecht). 38 (6), 493-495 (2015).
  18. Collins, C., et al. Haemodynamic and extracellular matrix cues regulate the mechanical phenotype and stiffness of aortic endothelial cells. Nature Communications. 5, 3984(2014).
  19. Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circulation Research. 107 (5), 677-684 (2010).
  20. Smith, R. D., Brown, B., Ikonomi, P., Schechter, A. N. Exogenous reference RNA for normalization of real-time quantitative PCR. Biotechniques. 34 (1), 88-91 (2003).
  21. Kohn, J. C., et al. Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior. Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Анализ выражения гена эндотелиальных клеток, подвергается сдвига стресс с помощью нескольких камер параллель плита потока
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.