Методическая статья

Мкм шкала фенотипирование методы кукурузы сосудистых пучков, основанный на Microcomputed рентгеновская томография

DOI:

10.3791/58501

⸱

9 октября 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Key Lab of Digital Plant, Beijing Research Center for Information Technology in Agriculture, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы предлагаем новый метод для повышения контраста поглощения рентгеновских кукурузы ткани подходит для обычных microcomputed КТ сканирование. Основываясь на КТ изображений, мы представляем набор рабочих процессов обработки изображений для различных кукурузы материалы эффективно извлекать микроскопических фенотипы сосудистых пучков кукурузы.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это необходимо для точного количественного определения анатомических структур кукурузы материалов на основе методики анализа изображений высокой пропускной способности. Здесь мы предоставляем «протокол подготовки проб» для кукурузы материалов (то есть, стебель, листья и корень) подходит для обычных microcomputed томография микро-сканирование. Основываясь на изображения с высоким разрешением CT кукурузный стебель, листья и корень, опишем два протокола для фенотипического анализа сосудистых пучков: (1) на основании КТ изображение кукурузный стебель и листья, мы разработали конвейере анализа конкретного изображения автоматически извлекать 31 и 33 фенотипических признаков сосудистых пучков; (2) на основе серии изображений КТ кукурузы корня, мы настроить схему обработки изображений для трехмерной (3-D) сегментации metaxylem судов и получены двумерные (2-D) и 3-D фенотипических признаков, таких, как объем, площадь metaxylem судов, и т.д. По сравнению с традиционной ручной измерение сосудистых пучков кукурузы материалов, предлагаемых протоколов значительно повысить эффективность и точность микрон шкала фенотипические количественной оценки.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Кукурузы сосудистой системы проходит через весь завод, корень и стебель на листья, который формирует основные транспортные пути для доставки воды, минеральных веществ и органических веществ1. Еще одной важной функцией сосудистой системы является обеспечивают механическую поддержку для растений кукурузы. Например морфология, количество и распределение сосудистых пучков в корни и стебли тесно связаны с жилье сопротивление кукурузные растения2,3. В настоящее время исследования анатомического строения сосудистых пучков главным образом используют микроскопические и ультрамикроскопические методы для отображения анатомические структуры определенной части стебля, листьев, или корень и затем измерить и рассчитывать эти структуры интерес к ручной расследования. Несомненно ручное измерение различных микроскопических структур в крупномасштабных микроизображений это очень утомительно и неэффективная работа и серьезно ограничивает точность microphenotypic черты, благодаря своей субъективности и непоследовательность4, 5.

Кукурузы не среднего роста, и содержимое ячейки по существу состоит из воды в начальной Меристемы. Без каких-либо предварительной обработки свежие образцы кукурузы тканей могут быть непосредственно отсканированы с помощью микро КТ устройства; Однако результаты сканирования, вероятно, бедных и грубой. Основные причины резюмируются следующим образом: (1) низкое затухание плотности растительных тканей, что приводит к низкой контрастности Атомный номер и высокой шума в изображениях; (2) материалы свежего растения склонны к обезвоживанию и сокращаться в течение нормального сканирования окружающей среды, как сообщает Du6. Основные препятствия для развития и применения технологии microphenotyping для кукурузы, пшеницы, риса и других однодольные стали указанных проблем. Здесь, мы представляем протокол «Подготовка образца» для предварительной обработки образцов кукурузный стебель, листья и корень. Этот протокол позволяет избежать обезвоживания и деформации растительных материалов во время КТ; Таким образом это выгодно увеличить время сохранение образцов растений с nondeformation. Кроме того окраска шаг, основанные на твердых йод также повышает контрастность растительных материалов; Таким образом он делает значительные улучшения в качестве изображений микро CT. Кроме того мы разработали программное обеспечение для обработки изображений, названный VesselParser, чтобы обработать изображения КТ кукурузные стебли и листья. Это программное обеспечение интегрирует набор трубопроводов обработки изображений для выполнения анализа высокой пропускной способностью и автоматические фенотипирование для КТ изображения 2-D различных растительных тканей. Сосудистых пучков в весь спектр кукурузный стебель и лист обнаруживаются, извлекаются и определены с использованием метода автоматической обработки изображений. В результате мы получаем 31 микроскопических фенотипов, стеблей кукурузы и 33 микроскопических фенотипов листьев кукурузы. Для серии изображений КТ кукурузы корня мы разработали схему обработки изображений для приобретения 3-D фенотипических признаков metaxylem судов. Эта схема является превосходной эффективности приобретения изображений и восстановления по сравнению с традиционными методами.

Эти результаты показывают, что изображения обработки трубопроводов рассматривающ изображений характеристики обычных рентгеновских микро КТ обеспечивают эффективный метод для микроскопических фенотипирование сосудистых пучков; Это чрезвычайно расширяет применение методов КТ в науке растений и улучшает автоматическое фенотипирование растительных материалов на клеточном резолюции6,7.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. пример подготовка протокола

  1. Для отбора проб, собирать стебель, лист, корень из свежих растений кукурузы и разделить их на три вида выборки групп (каждая группа с четырьмя репликаций). Затем, порежьте их на небольшие сегменты с помощью хирургического лезвия следующим образом: (1) вырезать сегмент средних стволовых между узлами 1-1,5 см в длину; (2) вырежьте сегмент максимальная ширина листа 0,5 - 3 см в длину по вертикали с основных вен; (3) вырежьте сегмент корня Корона 0,5 см в длину.
  2. Для фиксации АВС Замочите сегментов выборки в растворе АВС (90:5:5 v/v/v, 70% этанол: 100% формальдегида: 100% уксусной кислоты) для по крайней мере 3 d.
  3. Выполните процедуру обезвоживания в шести последовательных этанола градиентов (то есть, 30%, 50%, 70%, 85%, 95% и 100%) и установите время обработки каждой этанола градиента как 30 мин.
  4. Располагайте материалы завода в соответствующий образец корзины, изготовленных с использованием 3-D принтер; затем быстро перенесите образец корзины ячейки выборки CO2 критической точки сушки системы. Установите сушки параметры следующим образом:
    (1) CO2 в: быстрая скорость. Держатель наполнители: 100%.
    (2) заряда: CO2 заряда задержки 120 s в цикл. Скорость обмена: 5. цикла число: 12.
    (3) газ из: тепло, быстро. Скорость: медленный, 50%.
    1. Зависимости от морфологических различий кукурузы корень, стебель и листьев, дизайна и печати образца корзины с помощью трехмерного принтера (например, рис. 1).
  5. Место сухих растительных материалов (кукуруза корень, стебель или лист) в 50-мл пластиковых пробирок с 2 g твердого йода красителей растительного сырья с паров летучих йода и, затем, место трубы в светонепроницаемые номер для 4-5 ч.

2. микро КТ сканирования протокол

  1. Сканировать в необработанных данных КТ, установите КТ параметров, следующим образом: 40 кв/250 мкА (для стебля и листьев) или 34 кв/210 МКА (для корня). Установите соответствующий сканирование диапазоны для различных размеров и объемов используемых материалов завода и отрегулировать размер изображений пикселя следующим: 2,0 мкм (для кукурузы корня), 6.77 мкм (для кукурузы стволовых клеток) и 10,0 мкм (для кукурузы листьев).
  2. Чтобы воспроизвести фрагмент изображения, преобразуйте необработанные данные КТ в CT фрагмент изображения с разрешением 2K (2000 x 2000 пикселей) с помощью программного обеспечения реконструкции изображения. Более подробная информация приводится в руководстве пользователя NRecon (http://bruker-microct.com/next/NReconUserGuide.pdf).

3. Протокол анализа изображения для одного CT изображения кукурузный стебель или лист

Примечание: Использование автоматической обработки изображений программное обеспечение для сосудистых пучков провести анализ фенотипа сосудистых пучков в пределах фрагмента изображения КТ кукурузный стебель и лист (рис. 2). Ниже описаны шаги использования программного обеспечения.

  1. Назначить орган типа для инициализации другой алгоритм трубопроводов. Нажмите кнопку Параметры метода и в первом раскрывающемся списке выберите кукурузный стебель или кукурузный лист.
  2. Чтобы импортировать изображения, нажмите на кнопку управления данными , установить рабочий каталог и импорта автоматически всех фрагментов изображений в этом каталоге. Выберите один или несколько фрагментов изображения в изображения трубопроводов.
  3. Определите размер фактической пиксель изображения. Нажмите кнопку Параметры метода и введите размер фактической пиксель изображения в элементе изменить размер пикселя.
  4. Для вычисления фенотипа нажмите кнопку фенотипирование вычисления автоматически извлекать фенотипических признаков сосудистых пучков для всех отдельных фрагментов изображения.
  5. Нажмите кнопку Анализ статистики для вывода результатов в формате TXT или CSV файла.

4. образ протокол анализа для КТ изображения серии кукурузы корня

Примечание: Изображения серии CT кукурузы корни используются для извлечения 3-D структуры metaxylem сосудов с помощью программного обеспечения обработки изображений. Ниже приводятся основные шаги.

  1. Импортировать восстановленные изображения кукурузы корней (в формате BMP-файла) и определить точные интервалы параметры (размер voxel [т.е., x, y, z]). Используйте средство Гаусса рекурсивных сгладить эти изображения для повышения качества изображения.
  2. Проведение 3-D сегментации metaxylem судов, регулируя параметры порога; Это создает единый цвет метки для каждого подключенного metaxylem судна.
  3. Улучшить и определить metaxylem сосуды, интерактивно, используя побитовый, морфология и операции заливки.
  4. Проводить объем визуализации и поверхности реконструкции судов. Используйте средство Статистика маска для подсчета и измерить фенотипических признаков судна в уровнях 2-D и 3-D.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Подходит для обычных микро КТ сканирование протокол Подготовка образца не только предотвращает деформацию растительных тканей, но и повышает контраст поглощения рентгеновских. Предварительно обработанные завод материалы проверяются с помощью системы микро CT в срез высокого качества изображения, и высокое разрешение может достигать 2 мкм/пиксель. Рисунок 4 показывает отсканированных микро CT стебель, листья и корень, и контрастность изображения имеет значител...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С успешным применением CT технологии в области биомедицины и материаловедения эта технология постепенно введен в области ботаники и сельского хозяйства, поощрение исследований в науках о жизни растений как перспективных технического инструмента . В конце 1990-х CT технология впервые была использована для изучения морфологических структур и развития корневой системы растений. В последнее десятилетие синхротрона HRCT стал мощный, неразрушающий инструмент для растений биологов и успешно используется для определения структур...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано национального характера науки фонд Китая (No.31671577), Наука и технологии инноваций специальных строительство финансируемые программы из Пекинской Академии сельского хозяйства и лесного хозяйства Sciences(KJCX20180423), исследования Программа развития Китая (2016YFD0300605-01), Пекин фонда естественных наук (5174033), Пекин докторской исследовательский фонд (2016 ZZ-66) и Пекинской Академии сельского и лесного хозяйства наук Грант (KJCX20170404),) JNKYT201604).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Рентгеновская компьютерная томографическая система Skyscan 1172Bruker Corporation, БельгияNA Для компьютерной томографии
2 система сушки критических точек (Leica CPD300)Leica Corporation, ГерманияNAДля сушки образцов
ЭтаноллюбойNAДля фиксации FAA
ФормальдегидлюбойNAДля фиксации FAA
Уксусная кислотаAnyNAДля фиксации FAA
Хирургическое лезвиеAnyNAДля резки образцов
3D-принтерMakerbot replicator 2, MakerBot Industries, СШАNAДля печати корзин с образцами корня, стебля и листьев кукурузы
Центрифужная трубкаCorning, СШАNAПоместите материалы из корня, стебля или листьев
Твердый йодЛюбойNAДля окрашивания образцов
программы SkyScan NreconSkyScan NRecon, Версия: 1.6.9.4, Bruker Corporation, БельгияNAДля реконструкции изображений
VesselParser программаVesselParser, Версия: 3.0, Национальный инженерно-исследовательский центр информационных технологий в сельском хозяйстве (NERCITA), Пекин, КитайNA Протокол анализа изображений для одного КТ-изображения стебля или листа кукурузы
ScanIPScanIP, Версия: 7.0; Simpleware, Эксетер, ВеликобританияПрограммноеобеспечение для обработки 3D-изображений
Латексные перчаткиЛюбойпинцет NA Любой NA
ЛюбойNA
CO

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lucas, W. J., et al. The plant vascular system: evolution, development and functions. Journal of Integrative Plant Biology. 55, 294-388 (2013).
  2. Gou, L., et al. Effect of population density on stalk lodging resistant mechanism and agronomic characteristics of maize. Acta Agronomica Sinia. 33, 1688-1695 (2007).
  3. Hu, H., et al. QTL mapping of stalk bending strength in a recombinant inbred line maize population. Theoretical and Applied Genetics. 126, 2257-2266 (2013).
  4. Wilson, J. R., Mertens, D. R., Hatfield, R. D. Isolates of cell types from sorghum stems: Digestion, cell wall and anatomical characteristics. Journal of the Science of Food and Agriculture. 63, 407-417 (1993).
  5. Hatfield, R., Wilson, J., Mertens, D. Composition of cell walls isolated from cell types of grain sorghum stems. Journal of the Science of Food and Agriculture. 79, 891-899 (1999).
  6. Du, J., et al. Micron-scale phenotyping quantification and three-dimensional microstructure reconstruction of vascular bundles within maize stems based on micro-CT scanning. Functional Plant Biology. 44 (1), 10-22 (2016).
  7. Pan, X., et al. Reconstruction of Maize Roots and Quantitative Analysis of Metaxylem Vessels based on X-ray Micro-Computed Tomography. Canadian Journal of Plant Science. 98 (2), 457-466 (2018).
  8. McElrone, A. J., Choat, B., Parkinson, D. Y., MacDowell, A. A., Brodersen, C. R. Using high resolution computed tomography to visualize the three dimensional structure and function of plant vasculature. Journal of Visualized Experiments. (74), e50162(2013).
  9. Cloetens, P., Mache, R., Schlenker, M., Lerbs-Mache, S. Quantitative phase tomography of Arabidopsis seeds reveals intercellular void network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103, 14626-14630 (2006).
  10. Dorca-Fornell, C., et al. Increased leaf mesophyll porosity following transient retinoblastoma-related protein silencing is revealed by microcomputed tomography imaging and leads to a system-level physiological response to the altered cell division pattern. Plant Journal. 76 (6), 914-929 (2013).
  11. Verboven, P., et al. Void space inside the developing seed of Brassica napus and the modelling of its function. New Phytologist. 199, 936-947 (2013).
  12. Brodersen, C. R., Roark, L. C., Pittermann, J. The physiological implications of primary xylem organization in two ferns. Plant, Cell & Environment. 35, 1898-1911 (2012).
  13. Choat, B., Brodersen, C. R., McElrone, A. J. Synchrotron X-ray microtomography of xylem embolism in Sequoia sempervirens saplings during cycles of drought and recovery. New Phytologist. 205, 1095-1105 (2015).
  14. Torres-Ruiz, J. M., et al. Direct x-ray microtomography observation confirms the induction of embolism upon xylem cutting under tension. Plant Physiology. 167, 40-43 (2015).
  15. Staedler, Y. M., Masson, D., Schönenberger, J. Plant tissues in 3D via. x-ray tomography: simple contrasting methods allow high resolution imaging. PLoS One. 8, 75295(2013).
  16. Zhang, Y., Legay, S., Barrière, Y., Méchin, V., Legland, D. Color quantification of stained maize stem section describes lignin spatial distribution within the whole stem. Journal of the Science of Food and Agriculture. 61, 3186-3192 (2013).
  17. Legland, D., Devaux, M. F., Guillon, F. Statistical mapping of maize bundle intensity at the stem scale using spatial normalisation of replicated images. PLoS One. 9 (3), 90673(2014).
  18. Heckwolf, S., Heckwolf, M., Kaeppler, S. M., de Leon, N., Spalding, E. P. Image analysis of anatomical traits in stem transections of maize and other grasses. Plant Methods. 11, 26(2015).
  19. Wu, H., Jaeger, M., Wang, M., Li, B., Zhang, B. G. Three-dimensional distribution of vessels, passage cells and lateral roots along the root axis of winter wheat (Triticum aestivum). Annals of Botany. 107, 843-853 (2011).
  20. Chopin, J., Laga, H., Huang, C. Y., Heuer, S., Miklavcic, S. J. RootAnalyzer: A Cross-Section Image Analysis Tool for Automated Characterization of Root Cells and Tissues. PLoS One. 10, 0137655(2015).
  21. Passot, S., et al. Characterization of pearl millet root architecture and anatomy reveals three types of lateral roots. Frontiers in Plant Science. 7, 829(2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

3D

Похожие статьи