Методическая статья

Временной анализ ядерных и цитоплазматических транслокации герпеса вирус 1 белок, Immunofluorescent конфокальная микроскопия

DOI:

10.3791/58504

⸱

4 ноября 2018 г.

 , 
1Department of Biological Sciences, Wayne State University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ICP0 подвергается ядерной и цитоплазматических транслокации во время инфекции HSV-1. Молекулярный механизм этого события не известна. Здесь мы описываем использование Конфокальный микроскоп как инструмент для количественной оценки ICP0 движения в инфекции HSV-1, которая закладывает основу для количественного анализа ICP0 транслокации в механистической будущих исследований.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Инфицированная клетка белок 0 (ICP0) вируса простого герпеса (ВПГ-1) 1 является немедленное раннего белок, содержащий убиквитин лигаза КОЛЬЦЕВОГО типа E3. Это ответственность за ухудшение протеосомной пребывания ограничительных факторов и последующих вирусных генов активации. ICP0 содержит последовательность каноническое ядерной локализации (NLS). Он проникает в ядро сразу же после de novo синтеза и выполняет свои функции Анти принимающей обороны главным образом в ядре. Однако позже в инфекции, ICP0 находится исключительно в цитоплазме, предлагая возникновение ядерного в цитоплазматического транслокации во время инфекции HSV-1. Предположительно ICP0 транслокации позволяет ICP0 модулировать свои функции согласно его субцеллюлярные места на этапах различные инфекции. Для того, чтобы разграничить биологической функции и механизм регулирования ядерной и цитоплазматических ICP0 транслокации, мы изменили методом immunofluorescent микроскопии для мониторинга ICP0 людьми во время инфекции HSV-1. Этот протокол включает в себя immunofluorescent окрашивание, Конфокальный микроскоп изображений и ядерной против цитоплазмы анализ распределения. Цель настоящего Протокола заключается в адаптации устойчивого состояния конфокальный снимки, сделанные в времени курс в количественных документации ICP0 движения на протяжении всего литические инфекции. Мы предлагаем, что этот метод может быть обобщена количественно анализировать ядерной против цитоплазмы локализации других вирусных или клеточных белков без привлечения живой технологии визуализации.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вирус простого герпеса (ВПГ-1) 1 вызывает широкий спектр легкой до тяжелой герпетические заболевания, включая labialis герпеса, генитальный герпес, стромальный кератит и энцефалит. После заражения, вирус устанавливает пожизненными латентной инфекции в ганглиях нейронов. Иногда вирус может быть возобновлена по различным причинам, такие как лихорадка, стресс и подавление иммунной1, приводит к инфекции рецидивирующий герпес. Инфицированной клетки белки 0 (ICP0) является ключевым регулятором вирусный решающее значение для литические и латентной инфекции HSV-1. Она transactivates вниз по течению вирус гены через противодействие хост внутренней/врожденной противовирусное оборону2,3. ICP0 имеет действие убиквитин лигаза E3, которая ориентирована на несколько клеток факторов для протеасом зависимой деградации3. Он также взаимодействует с различных путей клеток регулировать их деятельность и впоследствии компенсировать хост противовирусное ограничения3. Известно, что ICP0 найти на различных внутриклеточных отсеков, как инфекция переходит в3,4,5. Белок имеет лизин/аргинин богатые ядерной локализации сигнал (NLS), расположенный на остатки 500 до 5066. После de novo синтеза в ранней инфекции HSV-1 ICP0 немедленно импортируется в ядро. Обнаруживается сначала на динамический ядерные структуры называют ядерной области 10 (ND10)7. E3 убиквитин лигаза активность ICP0 вызывает деградацию ND10 Организатор белки, белка promyelocytic лейкемия (PML) и крапинами белка 100 кДа (Sp100)8,9,10. После потери Организатор белков ND10 ядерных органы рассредоточены и ICP0 распространяется для заполнения всего ядро4,11.

Интересно, что после начала вирусной репликации ДНК, ICP0 исчезает из ядра. Он находится исключительно в цитоплазме, предлагая возникновение ядерного в цитоплазматического транслокации инфекции HSV-14,12в конце. Требование о репликации ДНК подразумевает потенциального участия конце вирусные белки в содействии цитоплазматических транслокации HSV-1 ICP04,12. Видимо ICP0 торговли людьми среди различных отсеках во время инфекции дает ICP0 чтобы модулировать его взаимодействия различных клеточных путей в пространственно временных моды, и поэтому координировать его несколько функций для тонкой настройки баланса между литических и латентных HSV-1 инфекции13. Чтобы лучше понять ICP0 многофункциональности и координации ICP0 функциональные домены на протяжении литические инфекции, мы тщательно расчлененный молекулярные основы динамических транслокации ICP012. Для проведения механистический исследований сообщалось ранее12, мы применили метод immunofluorescent окрашивание визуализировать субцеллюлярные локализации ICP0 на различные инфекции статуса согласно конфокального микроскопа. Мы также разработали количественный протокол для анализа ядерных против цитоплазмы распределения ICP0 с помощью конфокальной программного обеспечения. Популяция клеток инфицированных HSV-1 был рассчитанной на этапах инфекции и были проанализированы тенденции движения ICP0, в12различных биохимических методов лечения. Здесь мы описываем подробный протокол, что документы ICP0 транслокации инфекции HSV-1. Мы предлагаем, что этот метод может быть принят в качестве общего метода для изучения транслокации цитоплазмы ядерной против других вирусных или клеточных белков, которые могут служить альтернативой живых изображений когда живой Тепловизионная техника не применяется из-за такие проблемы, как маркировка метод, интенсивности сигнала или белков изобилия.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. клетки посева и вирусной инфекции

  1. В 20 – 24 ч до вирусной инфекции семян 5 х 104 клетки фибробластов человека эмбриональных легких (HEL) или другие клетки быть расмотренным на 11 мм 4-ну шахматном слайд в среднего роста (Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) с 10% плода говядину сыворотка (ФБС)). Инкубируйте клетки при 37 ° C с 5% двуокиси углерода (CO2).
    Примечание: Каждый хорошо должен иметь 70-80% клеток confluency во время инфекции.
  2. На следующий день удалите среднего роста и заразить клетки с вирусами в средне-199 в диапазоне 4 – 10 ОРП/ячейки. Инкубировать инфицированные вирусом клетки в течение 1 ч при 37 ° C. Держите покачивая слайд во время инкубационного периода.
  3. После инкубации 1 h удалите средне-199 и дополнить с среднего роста.
    Примечание: Наркотики, которые мешают различные инфекции фазы могут быть добавлены на этот шаг или до вирусной поглощения.
  4. Инкубируйте инфицированные вирусом клетки при 37 ° C с 5% CO2 для различных длин период инфекции.

2. Фиксация и Permeabilization

  1. Во время надлежащего инфекции быстро мыть инфицированных клеток с фосфат амортизированное saline (PBS) 3 раза и добавить 200 мкл параформальдегида 4%, свежеприготовленный в PBS. Инкубируйте клетки с параформальдегида для 8-10 мин при комнатной температуре, чтобы исправить ячейки в каждой скважине.
  2. Аспирационная параформальдегида и промыть скважин с 200 мкл PBS для 3 раза. Полностью аспирационная PBS после стирки 3rd .
  3. Добавьте 100 мкл 0,2% неионные ПАВ в каждой скважине для разрушения клеток для 5 – 10 мин.
  4. Аспирационная неионных ПАВ и промыть скважин с 200 мкл PBS для 3 раза.

3. immunofluorescent окрашивание

  1. Полностью аспирационная PBS и добавить 200 мкл блокировки буфера (1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) и 5% сыворотки крови лошади в PBS) в каждой скважине и инкубации при комнатной температуре в течение 1 ч или при температуре 4 ° C на ночь.
  2. Добавьте экспериментальным путем концентрации основного антитела (кролика polyclonal антитела анти ICP012) в блокирующем буфере и инкубировать основное антитело при комнатной температуре на 2 ч или при температуре 4 ° C на ночь.
  3. Промойте блокирующий буфер 3 раза с 10 минут инкубации. Добавить Alexa 594-конъюгированных коза анти кролик вторичное антитело (разводят в блокирующем буфере 1: 400) и инкубировать слайды при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем промойте слайды 3 раза с блокирующий буфер интервалом 10 мин.
  4. Наконец, мыть слайд один раз с PBS для удаления остаточного BSA и лошадь сыворотки.
  5. Добавьте одну каплю antifade монтажа среды с 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) смонтировать слайд и запечатать его с coverslip, с помощью прозрачный лак.

4. конфокальная томография

  1. С конфокального микроскопа установите волны 590 – 650 Нм для Alexa 594 и 410 – 520 Нм для DAPI. Выберите формат изображения 1024 x 1024 и линии в среднем 8 для получения изображений с высоким разрешением.
  2. Анализ каждой скважины на слайде 4-ну под конфокального микроскопа. Получение изображений представитель клеток под 100 X цели, как показано на рисунке 1 и на рисунке 2.
  3. Для подсчета большое количество клеток, принимать изображения подряд полей под 40 X цели.
    Примечание: Это требует 5 – 10 изображений, чтобы накопить более 200 инфицированных клеток от каждой точки время каждой инфекции.
  4. В каждом эксперименте сфотографироваться с постоянным конфокальный параметрами для всех образцов необходимо сравнить.

5. анализ ядерных против цитоплазмы распределения

  1. Открыть проект с конфокальный прикладного программного обеспечения. Выберите изображение, из которого нужно Табулированы ядерной против цитоплазмы распределения ICP0 клетки.
  2. Перейдите на вкладку «Количество» в верхнем меню и выберите «Сортировать ROIs» из меню Сервис.
  3. Нарисуйте продольной линии через ячейку, чтобы быть проанализированы, выбрав «Черту» из верхнего меню.
    Примечание: Гистограммы появится показаны интенсивности флуоресценции вдоль линии для ICP0 и DAPI. В гистограмме синяя линия представляет DAPI пикселей и обозначает границу ядра, в то время как красная линия представляет ICP0 пикселей.
  4. Основываясь на фоне окрашивание, создан постоянный порог для ICP0 интенсивности для анализа ICP0 субцеллюлярные распределения в каждом эксперименте.
    1. Примером в Рисунок 2, если красный сигнал в среднем ниже порога в регионе ядерных, но выше порога за пределами границы синий, классифицировать красный сигнал как преимущественно находятся в цитоплазме.
    2. Если красный сигнал выше порогового уровня ядра и за границу синего сигнала, Группа красный сигнал как ядро плюс цитоплазматических локализации.
    3. Если красный сигнал выше порога в ядре, но в среднем ниже вне границы синий сигнал, Группа красный сигнал как ядерной локализации.
  5. Табулирование более чем 200 инфицированных клеток от каждого образца в различные инфекции время и сюжет в столбчатую диаграмму для иллюстрации ICP0 движение по времени (рис. 3).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы понять молекулярные основы и биологические функции ICP0 торговли людьми во время инфекции HSV-1, мы используем метод immunofluorescent микроскопии для анализа ICP0 субцеллюлярные распределения на этапах различные инфекции. Рисунок 1 показывает представитель клетки с отличительные ICP0 локализации как инфекция прогрессирует. Для количественного определения ядерного в цитоплазматического транслокации ICP0, мы анализируем ICP0 распределение по отношению к ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол был использован для изучения ядерной и цитоплазматических транслокации HSV-1 ICP0. ICP0 проходит, субцеллюлярные людьми во время инфекции HSV-1 (рис. 1). Вероятно ICP0 взаимодействует с различных клеток пути для выполнения различных функций в разных местах. Это позволяет ICP0 для тонкой настройки его несколько функций в перетягивание каната с человека-хозяина13. Однако как ICP0 координирует множество функций на пространственно временной основе не хорошо ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим финансовой поддержке гранта NIH (RO1AI118992) присуждена Хайдун ГУ. Мы благодарим микроскопии, изображений и Core цитометрии ресурсов (MICR) объекта в Уэйнском Государственном университете для технической поддержки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильные>клетки и вирусы
фибробласты эмбриональных легких человека (клетки HEL)Д-р Томас Э. Шенк (Принстонский университет)Клетки HEL были выращены в DMEM с добавлением 10%
FBS вируса HSV-1 Stock (штамм F)Д-р Бернард Ройзман Lab
Medium
Дульбекко s модифицированный Eagle' Среда (DMEM)Invitrogen  11965-092
Фетальная бычья сыворотка (FBS)SigmaF0926-500ml
Medium-199 (10x)Gibco11825-015
Reagents
4- лунка 11 мм ступенчатая горкаCel-Line/Thermofisher Scientific  30-149H-BLACK
16% раствор параформальдегида (w/v) без метанолаThermo Scientific28908
Triton X-100Fisher реагентыBP151-1C0
Бычья сыворотка Абумин (BSA)CalbiochemCAS 9048-46-8
Сыворотка для лошадейSigmaH1270
Фосфатно-солевой буфер (PBS) (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4, pH7.4)Д-р Хайдун Гу lab
NaCl           Биореагент ФишераBP358-212
KH2PO4                       Биореагент ФишераBP362-500
KCl                         Fisher Scientific BP366-500
Na2HPO4                         Биореагент ФишераBP332-500
Блокирующий буфер (PBS с 1% BSA и 5% лошадиной сывороткой)Доктор Хайдун Гу лаб
Рабиит Антитела к ICP0Доктор Хайдун Гу lab
PML (PG-M3)-мышь моноклональный IgGсанта-Круз БиотехнологияSC-966
Alexa Fluor 594-козий анти-кроликIgG invitrogenA11012
Alexa Fluor 488-goat антимышиныйIgG invitrogenA11001
Vectashield Моутинговая среда с DAPIVector laboratoriesH-1200
Пастеровская пипеткаFisher Brand13-678-20D
Лак для ногтейСалли Хансен
<стронг>Оборудование
конфокальный микроскопLeica SP8
Конфокальное программное обеспечениеLeica LAS X Пакет приложений
Программное обеспечение Excel MicrosoftExcel
HERAcell 150i CO2 инкубаторThermo ScientificКод заказа 51026282

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Whitley, R., Kimberlin, D. W., Prober, C. G., et al. Pathogenesis and disease. Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. Arvin, A., et al. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2007).
  2. Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., et al. Herpes simplex viruses. Fields' Virology. Knipe, D. M. , 6th Edition, Lippincott-Williams & Wilkins. USA. 1823-1897 (2013).
  3. Gu, H. Infected cell protein 0 functional domains and their coordination in herpes simplex virus replication. World Journal of Virology. 5 (1), 1-13 (2016).
  4. Lopez, P., Van Sant, C., Roizman, B. Requirements for the nuclear-cytoplasmic translocation of infected-cell protein 0 of herpes simplex virus 1. Journal of Virology. 75 (8), 3832-3840 (2001).
  5. Kawaguchi, Y., Van Sant, C., Roizman, B. Herpes simplex virus 1 alpha regulatory protein ICP0 interacts with and stabilizes the cell cycle regulator cyclin D3. Journal of Virology. 71 (10), 7328-7336 (1997).
  6. Mullen, M. A., Ciufo, D. M., Hayward, G. S. Mapping of intracellular localization domains and evidence for colocalization interactions between the IE110 and IE175 nuclear transactivator proteins of herpes simplex virus. Journal of Virology. 68 (5), 3250-3266 (1994).
  7. Maul, G. G., Everett, R. D. The nuclear location of PML, a cellular member of the C3HC4 zinc-binding domain protein family, is rearranged during herpes simplex virus infection by the C3HC4 viral protein ICP0. Journal of General Virology. 75 (6), 1223-1233 (1994).
  8. Chelbi-Alix, M. K., de The, H. Herpes virus induced proteasome-dependent degradation of the nuclear bodies-associated PML and Sp100 proteins. Oncogene. 18 (4), 935-941 (1999).
  9. Zheng, Y., Samrat, S. K., Gu, H. A Tale of Two PMLs: Elements Regulating a Differential Substrate Recognition by the ICP0 E3 Ubiquitin Ligase of Herpes Simplex Virus 1. Journal of Virology. 90 (23), 10875-10885 (2016).
  10. Lanfranca, M. P., Mostafa, H. H., Davido, D. J. HSV-1 ICP0: An E3 Ubiquitin Ligase That Counteracts Host Intrinsic and Innate Immunity. Cells. 3 (2), 438-454 (2014).
  11. Zheng, Y., Gu, H. Identification of three redundant segments responsible for herpes simplex virus 1 ICP0 to fuse with ND10 nuclear bodies. Journal of Virology. 89 (8), 4214-4226 (2015).
  12. Samrat, S. K., Ha, B. L., Zheng, Y., Gu, H. Characterization of Elements Regulating the Nuclear-to-Cytoplasmic Translocation of ICP0 in Late Herpes Simplex Virus 1 Infection. Journal of Virology. 92 (2), e01673-e01617 (2018).
  13. Gu, H. What role does cytoplasmic ICP0 play in HSV-1 infection? Future Virology. 13 (6), (2018).
  14. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  15. Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy - tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
  16. Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging. Trends in Biotechnology. 23 (12), 605-613 (2005).
  17. Teng, K. W., et al. Labeling proteins inside living cells using external fluorophores for microscopy. Elife. 5, e20378(2016).
  18. Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

ICP0 HSV 1DAPI

Похожие статьи