Method Article

Визуализация тангенциальная клеток миграции в развивающихся куриных оптические Tectum

DOI:

10.3791/58506

⸱

October 24th, 2018

 ,  , 
1Department of Neuroanatomy and Embryology, School of Medicine, Fukushima Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем методы для люминесцентные маркировки вскользь мигрирующих клеток путем электропорации и для покадровой изображений меткой ячейки движения в квартиру гора культуры для того, чтобы визуализировать миграции клеток поведение в развивающихся куриных оптические tectum .

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Промежуток времени изображений является мощный метод для анализа миграции поведение клеток. После люминесцентные клеток маркировки движение помеченных клеток в культуре может быть записан под видео микроскопии. Для анализа миграции клеток развивающегося мозга, ломтик культуры обычно используется для наблюдать миграции клеток параллельно срез секции, например радиальные клеток миграции. Однако ограниченную информацию можно получить из метода slice культуры для анализа миграции клеток, перпендикулярно срез секции, такие как тангенциальная клеток миграции. Здесь мы представляем протоколы для покадровой изображений визуализировать тангенциальная клеток миграции в развивающихся куриных оптические tectum. Сочетание клетки маркировки электропорации в ovo и последующие культуры плоским гора на вкладыше культуры клеток позволяет обнаружение перенос клеточного движения в горизонтальной плоскости. Кроме того наш метод облегчает обнаружение как поведение отдельной клетки, так и коллективных действий группы клеток в долгосрочной перспективе. Этот метод потенциально может применяться для обнаружения последовательные изменения люминесцентные меченых микро-структуры, включая аксональное удлинение в нейронной ткани или клетки перемещения в не нервной ткани.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изучение миграции клеток развивается с развивающейся техникой живых изображений. После люминесцентные клеток маркировки височной движение помеченных клеток в культуре блюдо или в естественных условиях может быть записан под видео микроскопии. В изучении нейронных развития морфологические изменения миграции клеток или удлинения аксоны были проанализированы с использованием промежуток времени визуализации. Для эффективной обработки изображений, важно, чтобы применить подходящий метод подготовки люминесцентные клеток тканей и маркировки, основанные на Цель эксперимента и анализ. Для анализа миграции клеток развивающегося мозга, ломтик культуры часто используются....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Электропорация в Ovo

  1. Подготовьте выражение плазмидной ДНК люминесцентные маркировки в высокой концентрации. Изолируйте ДНК от 200 мл бактериальной культуры щелочного литического методом с использованием Анионообменная столбцы по данным производителя протокол (Таблица материалов). Смесь pCAGGS-EGFP и pCAGGS-mCherryNuc в конечной концентрации 4 мкг/мкл каждого.
    Примечание: Бесплатно эндотоксина плазмида ДНК очистки может быть предпочтительным для электропорации.
  2. Инкубируйте плодородные куриные яйца горизонтально на 38 ° C в 70% относительной влажности.
  3. После 2,5 дня ликвидировать 5 мл белка (белок) со стороны....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рисунок 2 показывает Визуализация поверхностного тангенциальная миграции в культуре с плоским гора в прошедшее время (0, 9, 18, 27 h) после начала записи. Фильм 1 — промежуток времени фильм 10 мин-интервалов в течение 28 ч 50 мин. Рамка, выбранная для фокусировки на мигрирующих клеток от помечены левого нижнего угла кадра в неподписанном пространство (рис. 3A). Массовое движение мигрирующих клето.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанные выше протокол оптимизирован для обнаружения миграции клеток в поверхностных слоях6,8. Это применимо для обнаружения среднего уровня миграции потоков (фильм 5)6,7, просто перенос сроков электропорации (E5.5 E4.5) и начала культуры и изображений (E7.0 E6.0).

Представлена процедура состоит из клеток маркировки электропорации в ovo

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана JSP-страницы KAKENHI Грант номер 15K 06740 для Y.W.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Materials
NucleoBond Xtra Midi Plus EFMACHEREY-NAGEL740422.5набор для очистки плазмиды без эндотоксинов
20 мл шприцTERUMOSS-20ESZ
18 калибр иглаTERUMONN-1838R
Fast GreenWako061-00031
100x пенициллин и стрептомицинGibco15140-122
стеклянная капиллярная трубкаNarishigeG-1
клеточная культурная вставкаMilliporeMillicell CM-ORG
ЛамининSIGMAL2020покрытие культуральной вставки
поли-L-лизинапептид Institute3075покрытие культуральной вставки
стеклянная нижняя чашкаМацунамиD11130H
Opti-MEMGibco31985-070питательная среда
F12Gibco11765-054питательная среда
для плода бычьей сывороткиGibco12483питательная среда
цыплятGibco16110082питательная среда
10xHBSSGibco14065-056
микрохирургический ножСотрудничество хирургических специальностей72-1501
Название<strong>CompanyНомер в каталогеКомментарии
Оборудование
изогнутые ножницыAS ONENo11
процессор микропипетокSUTTER INSTRUMENTP97/IVF
электрод типа щипцовBEXLF646P3x3
генератор импульсовBEXCUY21EXэлектропоратор
флуоресцентный стереоскопический микроскопLeicaMZ16F
инвертированный флуоресцентный микроскопOlympusIX81
газовый контроллерРегулятор температуры TokkenMIGM/OL-2
Tokai HitMI-IBC
лазерный конфокальный блокOlympusFV300
для

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marín, O., Rubenstein, J. L. R. Cell migration in the forebrain. Annual Reviews of Neuroscience. 26, 441-483 (2003).
  2. Nadarajah, B., Alifragis, P., Wong, R. O. L., Parnavelas, J. G. Neuronal migration in the developing cerebral cortex: Observations based on real-time ima....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tangential Cell MigrationChick Optic TectumTime lapse ImagingIn Ovo ElectroporationFlat mount CultureConfocal MicroscopyCell Culture InsertFluorescent LabelingNeuronal Cell MigrationParticle Tracking

Related Articles