Сочетая гистохимические окрашивание и анализа изображений для количественного определения крахмала в яичнике Примордия черешни во время зимней спячки

Умеренный древесных многолетних растений адаптироваться к сезоны, модулируя их роста и развития. В то время как они развиваются весной и летом, они перестают расти в течение осени пойти спящие в зимний¹. Хотя состояние покоя позволяет им выжить в низких зимних температур, охлаждения является необходимым условием для надлежащего budburst в весной². Важные последствия покоя в умеренных фруктов производства и лесного хозяйства привели к разнообразные усилия для определения и прогнозирования периода покоя³. В фруктовых деревьев, эмпирических экспериментов, передачи побеги заставляя условий и статистические прогнозы, основанные на данных цветения являются нынешние подходы к определить дату нарушение покоя, которая позволяет исследователям оценить охлаждение требования для каждого сорта. Однако как определить состояние покоя, основанные на биологических процессов остается неясным³.

Цветение в умеренных фруктовые деревья, такие как черешня (Prunus avium L.), происходит один раз в год и длится около недели. Однако цветы начинают различать и развивать около 10 месяцев назад, во время предыдущих летних⁴. Цветок Примордия остановить рост в течение осени оставаться спящие внутри почки в зимний период. В этот период каждый сорт необходимо накапливать конкретное требование охлаждения для надлежащего цветения⁴. Несмотря на отсутствие фенологическими изменениями в почки зимой цветок Примордия физиологически активны во время покоя, и накопление охлаждения температуры был недавно связан с динамика накопления крахмала или уменьшить в рамках клеток зачаток яичника предлагая новый подход для определения покоя⁵. Однако малый размер и расположение яичников зачаток требуют специальной методологии.

Крахмал является основным хранения углеводов в видов древесных растений⁶. Таким образом изменения в крахмал были связаны с физиологической активности цветок ткани, которые нужно углеводов для поддержки их развития^7,8. Также различные ключевые события в ходе репродуктивного процесса связаны с вариациями в содержание крахмала в разных цветочной структур, таких как пыльников мейоз⁹, рост пыльцы трубы через стиль или яйцеклетку оплодотворение¹⁰. Гистохимические методы позволяют выявлять крахмала в каждой конкретной ткани цветок Примордия во время покоя. Однако трудность остается в количественном определении что крахмала, чтобы после его шаблон накопления/уменьшение времени или сравнения крахмала контента среди тканей, сортов или лет. Это объясняется небольшое количество ткани для аналитических методов¹¹. В качестве альтернативы анализ изображений, связанных с микроскопии¹² позволяет количественная оценка крахмала в очень малых образцов тканей растений¹³.

Подходы, сочетающие анализ микроскопии и изображения были использованы для количественного определения содержания различных компонентов в тканях растений, например, callose¹⁴,¹⁵пробирок, или крахмала¹⁶, измеряя размер области, окрашенные конкретными пятна. Для крахмала, это могут быть легко обнаружены, используя иодид калия йод (I₂KI) реакции¹⁷. Этот метод является весьма специфический; Я₂ки встраивается в рамках слоистые структуры крахмала зерна и образует темно синий или красновато коричневый цвет, в зависимости от амилоза содержание крахмала¹⁸. Разделы, окрашенных с я пятно ки₂Показать адекватные контраст между крахмала и фон ткани, позволяя недвусмысленное крахмала обнаружения и последующего количественной системы анализа изображений¹⁹. Хотя эта краска не является стехиометрическим, накопление йода пропорциональна длина молекулы крахмала, которые могут весьма различаться¹⁷. Таким образом размер окрашенные области, выраженный в виде количество пикселей не может точно отражать содержание крахмала, поскольку высокая различия в содержание крахмала можно найти между полями с окрашенных областей аналогичного размера. В качестве альтернативы содержание крахмала может оцениваться путем измерения оптической плотности окрашенных гранул на черно-белых изображений, полученных с микроскопом, как сообщалось в различных тканях абрикосовое^{8,13 , 19},²⁰авокадо^10,и оливковых²¹.

Здесь мы описываем методологии, которая сочетает в себе экспериментального определения состояния покоя с количественного определения содержания крахмала в зачаток ткани яичника с осени до весны в вишни, предлагая новый инструмент для понимания и прогнозирования покоя, основанный на изучении биологических механизмов связана с покоя.

1. покоя решимость и растительных материалов коллекции

1. Образец бутоны на местах. Покоя исследования долгосрочных экспериментов и требуют взрослых деревьев достаточно большой для сбора бутоны и стреляет всю зиму без ущерба для развития деревьев во время следующей весной. Специальные Орчард управления может потребоваться в зависимости от системы подготовки; Таким образом Обрезка может быть менее серьезными, чем для целей производства фруктов.
   1. Каждую неделю, с начала осени до начала распускания, собирать и весят 10 бутонов.
   2. Исправьте бутоны, помещая их в 10-мл стеклянной трубки с крышкой и Замочите образцы в фиксирующие растворе этанола/уксусной кислоты (3:1) для по крайней мере 24 часа при 4 ° C. Затем отбросить фиксатором и добавьте 75% этанола, щедро, обеспечение того, что она охватывает образцы. Образцы могут быть сохранены в этом растворе на 4 ° C до использования.
      Примечание: Инфильтрации вакуум может использоваться для удаления пузырьков воздуха внутри бутона и предотвратить их от плавающих. Это облегчает проникновение фиксатором в тканях, но могут повредить структуру тканей. Старайтесь избегать его, если нет необходимости.
2. Побеги в поле образец.
   1. Каждую неделю, с начала осени до начала распускания, принять три побеги 15-30 см в длину и 5 мм в диаметре, содержащие по крайней мере 10 цветочные бутоны. Разместите их на водянистыми флористов пены в камере роста на 22 ± 1 ° C с 12 h света фотопериода.
   2. После 10 дней в камере роста выбрать и весят 10 бутонов из побегов.
3. Оценки роста Бад и определить состояние покоя. Периода отбора проб должен корректироваться с условиями расположения. В условиях фруктовый сад (Сарагоса, Испания, 41 ° 44'30 "N, 0 ° 47'00" W и 220 м над уровнем моря), с 30 ноября до конца февраля или начале марта была проведена выборки побегов.
   1. Еженедельно оцените ответ бутоны подходит роста условий палаты, с начала осени до budburst весной, сравнивая вес 10 бутонов, взял из поля.
   2. Если есть никаких различий или эти различия являются менее 30%, считают, что почки не выполнили их охлаждения требования и endodormant²². Если различия более чем на 30%, считают, что почки выполнили их охлаждения требования и ecodormant²².

2. завод подготовка для квантификации крахмала

1. Выберите около шести фиксированных почки от каждой выборки Дата (см. шаг 1.1). В зависимости от сорта каждый цветок бутон черешни содержит до пяти Примордия цветок.
   1. Удалить внешние бутон весы и поместите бутон на часовщик стекло с 75% этанола, чтобы предотвратить его от высыхания.
   2. Вскрыть бутон и извлекать по крайней мере один цветок зачаток за Бад с помощью щипцов точности и офтальмологических скальпеля под стереоскопическим микроскопом. Первобытная цветок может быть сохранено в 10-мл стеклянной трубки с 75% этанола на 4 ° C, или немедленно приступить к следующему шагу.
2. Обезвоживает образцы в серии третичный бутиловый спирт.
   1. Замените 75% этанола раствор 10 мл 75%, третичный бутиловый спирт (TBA) щедро образцы и проинкубируйте 1,5 ч. Пипетка Пастера может быть полезным для отмены решения.
   2. Повторите шаг 2.2.1, добавив TBA с ростом концентрации (85%, 95% и 100% v/v; и 3 x с чистой TBA) в сушильной печи при 30 ° C с вытяжной вентиляции, так как чисто TBA crystalizes при комнатной температуре (< 20 ° C) и весьма нестабильной и токсичных. Если та crystalizes с образцом, он бы повредить ткани.
3. Внедрите образцы в парафин¹⁸.
   1. Расплава парафина, вводя парафин жемчуг в сушильной печи при 60 ° C с вытяжной за предыдущий день. Парафин жемчуг может быть также растаял на плитой, но убедитесь, что парафин жидкий при 60 ° C и не при более высокой температуре, чтобы избежать повреждения тканей.
   2. Замените TBA смесь ТБА и парафинового масла (1:1) и проинкубируйте 24 h внутри сушильной печи при температуре 60 ° C. Затем заменить сочетанием TBA и парафина нефти парафином Чистый расплав и инкубировать в течение 6 часов внутри сушильной печи при температуре 60 ° C. Повторить это 2 x и инкубировать последнего изменения для по крайней мере 4-6 d.
   3. Место каждого образца на небольшой металлический базы плесень на поверхности тепла, встроенные в парафин и темпы внедрения кассеты. Поместите его над холодной поверхностью и удалить блоке после затвердевшим воск.
4. Раздел и увлажняет подготовки.
   1. Подготовить Хаупт клей: растворить 1 g равнина Нокс желатина в 100 мл дистиллированной воды при температуре 30 ° C; Затем добавьте 2 g свободные кристаллов фенола (C₆H₅OH) и 15 мл глицерина. Распространиться на стеклянную вставку с помощью кисти Хаупт клей и добавить каплю 1% раствора формальдегида.
   2. Раздел каждый парафин блок на 10 мкм в вращательное микротома и место разделы на слайд стекла покрытые Хаупт на клей.
   3. Место стекла слайды с разделами на поверхности тепла на 35-40 ° C до полного высыхания; затем переместите слайды стекла в слайд стойку.
   4. Подготовка решения dewax и регидратации. Место 200 мл Histoclear II в три стекла окрашивание блюда, еще один с Histoclear II:ethanol (1:1, v/v) этанола серии (100%, 70%, 40% v/v) и окончательный промыть дистиллированной воды.
   5. DEWAX секции с тремя моет, каждый 5 мин, в Histoclear II и Histoclear II:ethanol (1:1, v/v). Установите решетку слайд внутри стекла окрашивание блюда, обеспечивая, что решение полностью покрывает слайды и затем переместить слайд стойку из одного решения к следующему.
   6. Увлажняет разделах следующей серии 2-мин моет: серия этанола (100%, 70%, 40%, v/v) и окончательный промыть дистиллированной воды. Наконец сухие слайды стекла при комнатной температуре.
5. Пятно разделы¹⁸.
   1. Готовить я пятно ки₂: Растворите 2 г йодида калия (KI) и 0,2 г йода (я₂) в 100 мл дистиллированной воды. Применить капли свежего я₂ки над раздел 5 мин и затем сбросить избыток пятно, поглощая с промокательной бумаги. Быстро переходите к следующему шагу.
   2. Нанесите небольшое падение синтетических монтажа СМИ, место небольшой покровным стеклом на вершине и нажимать. После монтажа СМИ высыхает, наблюдать под микроскопом ярко поле для предварительной оценки завязи крахмала.
      Примечание: Этот шаг не является обязательным, хотя получается лучше контраст между крахмала и фон. Если секция должна использоваться с другими пятна после количественной крахмала, поместите Стекло покровное падение пятно и отбросить избыточные, поглощая с промокательную бумагу (см. 2.5.1). Затем, после крахмала количественной оценки, вымыть, я₂ки пятно с дистиллированной водой и место препараты на огне поверхности на 35-40 ° C до полного высыхания.

3. Количественная оценка содержание крахмала

1. Калибровки оптических условий.
   Примечание: Уровни обнаружения используется анализатором изображения для обнаружения окрашенных крахмала напрямую зависит от условий освещения и увеличение микроскопа; Таким образом исправьте эти условия для подготовки оценки. Адаптировать перестройки, предлагаемый здесь доступен микроскоп и условий освещения.
   1. Настройка диафрагмы диафрагмы на 20 X увеличение и регулировки яркости или силы света.
   2. Убедитесь, что нет фильтров на держатель фильтра и выберите условие ярко поля в микроскопе. Выберите подходящий масштаб (например, 40 X для черешня завязи зачаток).
2. Контроль условий приобретения изображений. Настроить параметры камеры с окрашенных подготовки без ткань через изображения | Приобретение | Предварительный просмотр.
   1. Исправить яркости на 50%, прирост в 1.0 x и гистограммы Индикаторы, гамма значение 1.00 и контраст на 0 - 100, накладки с пределы гистограммы распределения яркости.
   2. Активируйте функцию передержки/недоэкспозицией и отрегулировать время экспозиции на пределе передержки.
   3. Примените функция баланса белого для полного изображения для отображения всех компонентов нейтрального цвета изображения без каких-либо цветовой тон и коррекции затенения на полное изображение для создания образа исправлениями и однородной.
3. Калибровка системы анализа изображений для получения значений элемента управления уровня серого (0, черный; 255, белый) различных оптических плотностей (OD), которые получаются путем значения коэффициента пропускания (T).
   1. Получить изображение окрашенных подготовки без ткани, считается управления белый, и измерить серый уровень черно-белое изображение через мера | Серый мера | Калибровки Грей | Ссылка значение = 0 | Мера | Калибровки | ОК. Это соответствует 100% пропускания; Таким образом, оптическая плотность 0, согласно од = 2 - журнал т.
   2. Получить изображение же подготовки с фильтром 4Н, который уменьшает количество света, 4 x и мера серый уровень черно-белое изображение через меру | Серый мера | Калибровки Грей | Ссылка значение = 0,6 | Мера | Калибровки | ОК. Это соответствует с 25% пропускания; Таким образом, оптическая плотность 0,6, согласно од = 2 - журнал т.
   3. Получить изображение же подготовки без света, считается черный, и измерить серый уровень черно-белое изображение через меру | Серый мера | Калибровки Грей | Ссылка значение = 1 | Мера | Калибровки | ОК. Это соответствует 0% пропускания; Таким образом, оптическая плотность 1, согласно од = 2 - журнал т.
4. Обнаруживает крахмала.
   1. Получить цветное изображение поля для измерения в формате TIFF с разрешением по крайней мере 300 точек на дюйм (dpi).
   2. Создайте двоичный образ, соответствующий области витражи. Установить пороги три цвета (значения в диапазоне 0 - 255 для каждого) до тех пор, пока двоичное изображение точно отражает гранулы окрашенных крахмала, наблюдается, через изображения | Обнаруживать | Выберите пороговые значения красного, синего и зеленого | ОК. Сделать неоднократно визуального сравнения в различных препаратов и тканях настраивать уровни окончательный обнаружения. Хранить и использовать эти уровни для всех препаратов.
   3. Количественно крахмала. Преобразуйте оригинальные цветного изображения в черно-белое изображение с системой анализа изображения. Используйте двоичное изображение как накладывается маска на черно-белое изображение через изображения | Двоичного редактирования. Измерить сумму оптической плотности каждого пикселя под маску через меру | Серый уровень | OK и рассмотреть это значение как содержание крахмала в области измерений.
   4. Повторите шаги 3.4.1 - 3.4.3 в четырех местах Примордия яичников для получения представительной значения содержания крахмала в завязи цветка Примордия.
   5. Повторите шаги 3.4.1 - 3.4.3 и шаг 3.4.5 в разных цветов каждого сбора даты.

Покоя исследования требуют определения момента, когда охлаждение требования выполнены. Несмотря на отсутствие фенологическими изменениями в зимний период в полевых условиях (рис. 1а) вишневые деревья не восстановить потенциал роста в подходящих условиях, до тех пор, пока они пройти определенный период при низких температурах. Регулярные передачи побегов в контролируемых условиях камеру (рис. 1B) в зимнее время позволило оценки состояния покоя бутоны. Оценки роста бутон цветка было сделано путем измерения увеличение веса БАД. В то время как во время покоя, никаких изменений может наблюдаться после 10 дней подходящих условий (рис. 1 c), после того, как преодолеть состояние покоя, бутоны пополнили и ворвались в камере роста (рис. 1 d). Результаты этого анализа позволили состояние покоя почек должен быть создан. Из-за различных температур, происходящих во время зимы покоя был преодолен на разные даты, в зависимости от года. В то время как в течение первого года изучения, нарушение покоя произошло в январе, второй год представил более мягкие зимы; Таким образом выполнение охлаждение произошло примерно через три недели после, в феврале.

Сладкая вишня несет бутоны шпоры, где верхушечный бутон вегетативные почки и боковые почки бутонов (Рисунок 1 c и 1 D). Недифференцированная почки начинают дифференцироваться в цветок или вегетативные почки в конце лета, и когда они войти покоя в зимнее время, несколько цветок Примордия остаются внутри бутона, защищены многочисленными зелеными весы и охватываемых коричневый внешний весы ( Рисунок 1 c и рисунок 2A). Рассечение бутон цветка показал маленький цветок Примордия внутри (рис. 2A). Каждый цветок бутон содержащихся одного до пяти отдельных цветок Примордия (рис. 2B). Несмотря на небольшой размер каждого цветка зачаток, все части цветка различаются и могут быть выделены: пестика, пыльники, лепестков и чашелистики (рис. 2 c). Использование гистохимические методы (алкоголь: уксусной фиксации [3:1], встраивание парафина, микротом секционирование и окрашивания на основе йода крахмал) допускается распространение крахмала в цветок зачаток тканях наблюдается (2D фигура ).

Крахмала в яичнике зачаток был количественно в каждом разделе. Четыре меры 1337 мкм2, при 40 кратном, представлял Генеральный план крахмала в зачаток завязи черешня (рис. 3A). Гранул крахмала были четко отграничены от фона после того как я2KI, окрашивание (рис. 3B). Системы анализа изображений, крахмал был опознан цветокоррекции, что пороговые значения красного, зеленого и синего до тех пор, пока все гранулы крахмала наблюдается были покрыты двоичный образ, созданный системой, основанной на параметрах определенного цвета (рис. 3 c). Содержание крахмала получены значения были результатом измерения оптической плотности каждого пикселя под маской на черно-белое изображение (рис. 3D).

Количественная оценка крахмала выявлены закономерности крахмала динамических в зимний период (рис. 4). Последовательно количество крахмала в начале зимы представлен значением оптической плотности меньше, чем 400003, а максимальное значение между 120.000 и 140 000 в обоих лет. В то время как в январе во время первого года (рис. 4A) было достигнуто максимальное значение, это произошло в феврале на второй год (рис. 4В). Контрастные эти результаты с лица покоя, максимальное количество крахмала произошли сопутствующе обстоятельств с ужасающей выполнение в обоих годах.

Этот подход требует определения статуса покоя (Рисунок 5A) одновременно с квантификацией крахмала на ткани яичника (Рисунок 5B) для того, чтобы сформулировать изменения в содержание крахмала по отношению к покоя.

Рисунок 1: экспериментальная установка для определения состояния покоя цветочные почки черешни. (A) ветви, в зимний период, показывают спящие почки закрыты и покрыты темно коричневый весы. (B) Эта группа показывает передано в камеру роста побегов. В середине января некоторых сортов, оставались в состоянии спячки с почки по-прежнему закрыт (белая стрелка), в то время как другие были способны расти, показаны пополнили почки (черная стрелка). (C) Эта группа показывает детали стрелять с спящие бутоны, расположенный сбоку и одного вегетативного бутон, расположенного в апикальной позиции в отрог. (D) Эта группа показывает детали стрелять после покоя было преодолеть после 10 дней в рост палата, показаны опухоль почки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: завод подготовка для квантификации крахмала. (A) Эта панель показывает поперечном разрезе бутон цветка, показаны два цветка Примордия (fp) защищены многочисленными весы (sc). (B), три цветка Примордия (fp) собираются в бутон цветка. (C) Эта группа показывает поперечном разрезе зачаток цветок, с завитками продифференцировано: чашелистиков (se), лепестки (pe), пыльники () и пестик (pi). Завязь зачаток отличается на базе пестик (стрелка). (D) A средней секции цветок зачаток была собрана и исправлено в январе, встроенные в парафин, секционного и витражи с я2KI (темно-коричневый) для крахмала. Эта панель показывает зачаток яичников (стрелка). Масштаб бары являются 500 мкм в панели A и B и 200 мкм в панелей C и D. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: крахмал количественной оценки в черешня завязи зачаток. (A) Эта группа показывает средней секции завязи зачаток витражи с я2KI, показаны четыре кадра в котором крахмала содержимого была измерена. (B) Эта группа показывает детали зачаток завязи. Гранул крахмала окрашенные в темно-коричневый. (C) Эта панель показывает псевдоцветном изображении в которой крахмал соответствует разные оттенки синего. (D) Эта группа показывает двоичное изображение-маску, охватывающих я2KI-окрашенных крахмала (синий) на черно-белой исходное изображение. Оптическая плотность измеряется только в пикселов исходного изображения, охватываемых маски. Масштаб бары находятся 100 мкм в группе A и 20 мкм в панели B - D. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: представитель результаты количественной оценки крахмала в черешня завязи Примордия собранные ежемесячно с осени до весны в течение двух лет различные зимние температурных условий. (A) Эта группа показывает результаты от 2010-2011 годы, которые холодной зимы. Выполнение охлаждения (снежинка) произошло в январе, наряду с максимальным количеством крахмала. (B) Эта группа показывает результаты от лет 2011-2012, который был мягкой зимой. Выполнение охлаждения (снежинка) произошло в феврале, наряду с максимальным количеством крахмала. Значения являются среднее ± Среднеквадратичная ошибка среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5: схема экспериментального дизайна, чтобы оценить состояние покоя бутоны и количественной оценки крахмала в яичнике Примордия в вишни. (A) Эта группа показывает процессы определения статуса покоя: подготовка материала растений, процесс и полученные результаты. (B) Эта группа показывает процессы количественной оценки крахмала: гистохимические подготовка бутоны микроскопические наблюдения крахмал, обнаружения анализа изображения крахмала и количественной оценки крахмала. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Авторы не имеют ничего сообщать.