Методическая статья

Автоматизированная количественная оценка нейтрофилов с использованием NET-UANT

DOI:

10.3791/58528

⸱

27 ноября 2019 г.

 , 
1Department of Clinical Sciences, Division of Infection Medicine, Lund University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол для генерации нейтрофилов внеклеточных ловушек (NET) и операционной NET QuANT, полностью автоматический вариант программного обеспечения для количественной оценки NETs в иммунофлуоресценции изображений.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нейтрофильные внеклеточные ловушки (NET) представляют веб-подобные противомикробные структуры, состоящие из ДНК и гранул, полученных противомикробными белками. Иммунофлуоресцентная микроскопия и методы количественной оценки на основе изображений остаются важными инструментами количественной оценки формирования нейтрофилов внеклеточного люка. Тем не менее, существуют ключевые ограничения для иммунофлуоресценции на основе методов, которые в настоящее время доступны для количественной оценки NETs. Ручные методы количественной оценки NET на основе изображений часто субъективны, склонны к ошибкам и утомительны для пользователей, особенно неопытных пользователей. Кроме того, в настоящее время доступные варианты программного обеспечения для количественной оценки являются либо полуавтоматическими, либо требуют обучения перед эксплуатацией. Здесь мы демонстрируем внедрение автоматизированного метода количественной оценки изображений на основе иммунофлуоресценции для оценки формирования NET, называемого NET'uANT. Программное обеспечение является простым в использовании и имеет удобный графический пользовательский интерфейс (GUI). Он рассматривает биологически значимые параметры, такие как увеличение площади поверхности и коэффициент белка маркера ДНК:NET и ядерная деформация для определения образования NET. Кроме того, этот инструмент построен как свободно доступное приложение, и позволяет одноклеточных резолюции количественной и анализа.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нейтрофилы являются ключевыми посредниками врожденных ответных мер защиты хозяина против широкого спектра микробных патогенов1. Они выполняют свои антимикробные функции, выпустив свои гранулы, содержащие широкий спектр противомикробных белков2, производство реактивных видов кислорода (ROS) и гипохлорит1, и через фагоцитоз3. Кроме того, Бринкманн и др. 4 описанные нейтрофильные внеклеточные ловушки (NET) как новый механизм, с помощью которого нейтрофилы ловушки и ликвидации вторжения патогенов. С момента своего открытия чуть более десяти лет назад4,NETs были вовлечены в широкий спектр инфекционных5,6 и неинфекционных7 заболеваний. NET формирование является активным процессом и приводит к экструзии хроматина ДНК покрыты гранулы полученных противомикробных белков8. Некоторые из ключевых изменений в клеточной и ядерной морфологии, связанные с образованием NET включают потерю ядерной морфологии, хроматин деденденсации, мобилизация гранул белков от цитоплазмы до ядра и увеличение ядерного и клеточного диаметра8,9.

Веб-подобные NET, которые могут появиться как диффузные структуры немного больше, чем клетка или как структуры в несколько раз больше, чем один нейтрофил рассматриваются в качестве индикаторов NETosis5,10. Используя флуоресценцию микроскопии, NETs могут быть обнаружены путем зондирования ДНК с флуоресцентным зондом, таких как 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) и иммунофлуоресцентных окрашивания против NET-связанных белков, таких как нейтрофил эластаза. Количественная оценка перекрывающихся областей окрашивания для ДНК и сетевых белков определяет общую площадь под NET на изображении11.

Ряд вариантов анализа изображений доступны для выполнения флуоресценции изображения на основе количественной оценки NETs11,12. Но эти варианты программного обеспечения представляют ограничения в не удобной и / или полностью автоматизированной. В этой статье мы демонстрируем работу NET'uANT13, свободно доступное приложение, которое может выполнять объективной полностью автоматизированной иммунофлуоресцентной микроскопии микроскопии net количественной оценки. Приложение имеет удобный графический интерфейс (GUI) и может выполнять одноклеточный анализ. Программное обеспечение количественно NETosis в изображении путем обнаружения морфологических изменений в области ДНК-NET-связанных маркер, хроматин обезвреживание связанных деформации ядра и увеличение в ДНК: NET-связанных белка соотношение. В совокупности многочисленные критерии определения NET позволяют беспрекорнарно проводить строгую количественную оценку NET в нескольких наборах данных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Комитет по этике Лундского университета одобрил сбор венозной крови здоровых добровольцев в соответствии с Хельсинкской декларацией (2013/728). Все добровольцы предоставили свое письменное информированное согласие.

1. Изоляция нейтрофилов периферической крови с использованием плотности градиентной центробежки

  1. Соберите венозную кровь человека в трубках, содержащих гепарин и позволяют трубам достичь комнатной температуры.
    Примечание: Минимум 16 мл крови от здорового донора требуется для получения достаточно большой клеточной гранулы.
  2. Смешайте кровь с одним объемом 2% декесцент в сольнике (0,9% NaCl) и дайте осадка при комнатной температуре в течение 30 минут в стерильной 50 мл конической центрифуги трубки.
  3. Примачивать супернатант в стерильную коническую центрифугу 50 мл и центрифугу при 200 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия.
  4. С этого шага и далее продолжайте изоляцию при 4 градусах Цельсия или на льду.
  5. Приостановите гранулы в 5 мл ледяного солева и слой на вершине 5 мл градиента изоляции лейкоцитов (9,1% диатризоата натрия с 5,7% декекрон, w/v) в стерильной 15 мл конической центрифуги трубки.
  6. Центрифуга в течение 30 мин при 400 х г при 4 градусах По Цельсию.
  7. Аспирируй супернатанта и отбрось те.
  8. Лысы красных кровяных телец, resuspending гранулы в 3 мл ледяной воды в течение 30 с. Немедленно добавить 1 мл 3,6% NaCl, а затем заполнить с 10 мл ледяного сольника.
  9. Центрифугия подвески ячейки в течение 10 мин на 350 х г.
  10. Удалить супернатант, собрать клетку гранулы и resuspend его в 1 мл сольного раствора. Отложите 10 кл в микроцентрифуговой трубке для оценки числа клеток и жизнеспособности с помощью трипан-голубого цвета в камере Бюркера.
  11. Добавьте 10 qL клеточной подвески к 90 зл0 0,4% trypan синий раствор. Возьмите 10 л суспензии клеток в камере Бюркера. Подсчитайте ячейки в 4 квадратах, связанных по 3 линии в каждом углу камеры. Клетки, которые кажутся темно-синими для поглощения красителя являются нежизнеспособными, исключить их из общего числа клеток.
  12. Выразите номер ячейки как ячейки/мл, как это определено в уравнении ниже.
    figure-protocol-1
    Примечание: Здесь камерный фактор составил 10 000, коэффициент разбавления – 10, а общее количество квадратов – 4.
  13. Разбавить оставшуюся подвеску ячейки до 10 мл для заключительного шага стирки.
  14. Центрифуга в течение 5 мин при 200 х г.
  15. Приостанавливайте работу нейтрофилов в RPMI-1640 с помощью 2 мг/мл теплоинактивированного сывороточного альбома (HSA) в концентрации 5 х 105 клеток/мл.

2. Подготовка заедок и стимуляция нейтрофилов

  1. Поместите один coverslip (10 мм, #1) в каждой скважине из 12-хорошо пластины и пальто coverslip, добавив 200 зл и 0,01% поли-L-лизин раствор и оставить его на 37 градусов по Цельсию на ночь.
  2. Вымойте крышки с 300 л фосфатного буфера солине (PBS) один раз и оставить высохнуть.
  3. Добавьте 400 л из 5 х 105 нейтрофилов/мл к каждой скважине и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 минут.
  4. Переместите пластину, содержащую нейтрофилы, в инкубатор при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 в течение 15 минут.
  5. Удалите супернатант. Добавьте 400 л предогревой среды RPMI-1640 с 2 мг/мл HSA для управления. Добавьте 300 юаней предварительно разогретого RPMI с 20 нм phorbol 12-миристат 13-ацетат (PMA) для стимуляции.
  6. Стимулировать нейтрофилов в течение 150 мин при 37 градусах Цельсия с 5% CO2.

3. Визуализация NETs

  1. Удалите супернатант и промойте образцы 2x с 200 Зл Л PBS.
  2. Исправьте образцы, добавив 200 кЛ 4% параформальдегида (PFA) в PBS в течение 20 мин при 37 градусах Цельсия.
    Примечание: PFA является токсичным и должны быть обработаны с осторожностью.
  3. Промойте образцы 3x с 200 Зл Л PBS.
  4. Пермяки избавите образцы, добавив 50 зл 0,5% Тритон X-100 на 30 с.
  5. Вымойте образцы 3x с 200 Л Л PBS.
  6. Блок образцы с 5% козьей сыворотки в PBS для 1 ч при 37 градусов по Цельсию.
  7. Добавьте 300 л первичного кроличьего античеловеческого нейтрофила эластаза в блокирующий раствор при разбавлении 1:500 на 90 мин при 37 градусах Цельсия.
  8. Вымойте образцы 3x с 300 Л Л PBS.
  9. Добавьте 300 л вторичных козла против кролика флуоресцентные антитела при разбавлении 1:1000 в течение 90 минут при 37 градусах Цельсия.
  10. Вымойте крышки 3x с 300 Л Л PBS.
  11. Удалите крышки из колодцев и смонтировать крышку с 10 зликатовой средой, содержащей DAPI. Хранить на ночь при комнатной температуре в темноте, чтобы высушить образцы.
    Примечание: Окрашивание ДНК с Помощью DAPI, безусловно, является важным шагом в методе. Пользователи также могут устранить неполадки, добавив экзогенный раствор DAPI в конечном диапазоне концентрации 0,1 х u20120.5 мкг/мл в течение 2х20123 мин, а затем 3 стиральные ступени с 300 МЛ PBS.
  12. Приобретайте изображения с широкоугольным флуоресцентным микроскопом с помощью цели 20X.

4. Анализ и количественная оценка НЕТ с использованием НЕТЗУАНТ

Примечание: НЕТЗУАНТ можно загрузить, нажав на файл установки, найденный в архиве Зено до Гитхаба или на веб-сайте Лаборатории Норденфельт(https://nordlab.med.lu.se/?page_id=34).

  1. Импорт наборов данных для анализа, именования каналов и преобразования изображений
    1. Откройте вкладку Настройка в НЕТЗУАНТ.
    2. Выберите исходную папку для анализа, нажав опцию «Получить путь» в исходном меню, и выберите папку, содержащую последовательности изображений для анализа.
    3. Нажмите на опцию Get Path в целевом меню и выберите папку для сохранения данных после анализа изображений.
    4. Назовите каналы так, чтобы "канал ДНК" соответствовал окрашиванию ДНК(например,ДНК или DAPI) и "NET-канал" изображает NET-связанных белкового окрашивания(например,NET, нейтрофил эластаза) в изображениях. Для бесперебойного функционирования программного обеспечения (рекомендуемое) назовите папку, содержащую файлы изображения управления, как "контроль".
      Примечание: Канал NET относится только к маркеру гранулированного белка, связанного с NET.
    5. Накормите метаданные изображения в программное обеспечение, нажав кнопку информации об изображении Load в подменю информации об изображении.
    6. Выберите правильный порядок канала, содержащийся в изображениях в подменю заказа канала. Этот вариант был включен в качестве сбоев для предотвращения случайных несоответствий.
    7. Приобретите первичные свойства изображения из необработанных данных и преобразуйте изображения, нажав кнопку Подготовительные данные. Преобразованные изображения отображаются в подменю типа «Образец». Нажмите на меню типа «Образец» для отображения и выбора всех наборов данных, приобретенных для анализа.
    8. Выберите изображение из подменю типа Sample и нажмите на кнопку данных изображения Display для отображения изображений, разделенных на ДНК и канал NET соответственно.
  2. Сегментация клеток в канале ДНК и канале NET
    1. Выберите метод сегментации, нажав на подменю метода как в канале ДНК, так и в канале NET.
      Примечание: Метод сегментации по умолчанию настроен на адаптивный и является рекомендуемой настройкой. Другие варианты также доступны, включая глобальные, края и Chan-Vese. Вариант водораздела также включен, чтобы помочь различать тесно расположенные клетки или NETs.
    2. Введите вкладку Сегментации, чтобы сначала сегментировать контрольные ячейки в обоих каналах, нажав на опцию управления сегментом.
    3. Выберите PMA из подменю типа образца и нажмите на опцию Пакета (рекомендуется), чтобы начать сегментацию всех изображений, включенных в набор данных. Выберите изображения в меню типа образца и нажмите на кнопку данных изображения Display, чтобы визуализировать и проверить двоичные маски изображения (маска ДНК и маска NET), генерируемые после сегментации.
  3. Одноклеточный анализ идентифицируемых свойств
    1. Введите вкладку анализа и проанализируйте контрольные образцы, нажав на кнопку «Определить порог».
    2. Измените тип образца на PMA и нажмите на кнопку Свойства ячейки Get, чтобы завершить анализ стимулируемых образцов.
    3. Выберите изображение из подменю типа Sample и нажмите на кнопку данных изображения Display для отображения наложения и количества ячеек и клеток NET на изображении.
  4. Сравнение свойств клеток для выявления NET-образующих ячеек
    1. Выберите образец из подменю типа образца и нажмите на кнопку «Анализ NET», чтобы завершить анализ. Отдельные изображения могут быть выбраны из подменю типа образца для анализа или весь пакет изображений могут быть проанализированы путем выбора варианта партии (рекомендуется).
    2. Отрегулируйте критерии NET вручную, чтобы дать оптимальные результаты для данной выборки. Сравните идентифицированные NET с оригинальными изображениями для оценки качества идентификации.
      Примечание: Критерии NET могут быть использованы во всех изображениях в наборе данных. Любые изменения в NET-критериях применяются одновременно во всех контрольных образцах. Это ограничивает возможность любых потенциальных различий, которые могут возникнуть из-за чрезмерной установки параметров NET. Настройки в критериях NET могут быть скорректированы в соответствии с требованиями пользователя. Взаимосвязь между ложными показателями обнаружения и NET'UANT была исследована ранее13. Типичные диапазоны для увеличения площади 2 кв20124, круговость составит 0,7 кв20120,9 и соотношение ДНК / NET, чтобы быть 0,6-2,0.
    3. Проинспектировать резюме данных в подменю данных ячейки, где отображается количество изображений, количество клеток на изображение и процент NET на изображение.
      Примечание: Общий процент NET во всем наборе данных отображается "NET-gauge". Общее количество изображений, количество клеток, процент NET в выборке (NETs%) и NETs% в контрольной выборке отображаются в таблице сводной статистики ниже NET-калибра. Мы рекомендуем сообщать данные контроля наряду с данными, полученными из стимулируемых образцов.
  5. Результаты
    1. Введите вкладку «Выход» для выбора и просмотра результатов.
    2. Изучите и сравните различные результаты данных, полученные в результате анализа управления и PMA, выбрав форму вывода и нажав на кнопку результатов вывода.
      Примечание: Все данные, генерируемые после анализа как элементов управления, так и стимуляции, сохраняются в папке анализа, выбранной в целевом подменю. Данные сохраняются в форматах .csv или .pdf.
    3. Запуск файла Метод для получения версии программного обеспечения и NET-критериев, используемых для анализа (для включения в раздел методы для целей публикации).
    4. Нажмите на таблицу данных Результатов, чтобы визуализировать отдельные точки данных в данном образце.
    5. Визуализируйте распределение площади NET и соотношение ДНК:NET в образцах. Красная линия указывает пороговое значение на графиках.
    6. Определите область NET по сравнению с формой ДНК, нажав на файл распределения Bivariate.
  6. Загрузка предыдущего анализа и пакет все шаги
    1. Загрузите ранее успешные настройки анализа в NET'UANT с помощью кнопки предыдущего анализа Load.
    2. Используйте кнопку Пакета все шаги, включенные в меню настройки, чтобы выполнить шаги 5'u201212(Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5)непосредственно для получения конечного вывода.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

5 х 105 нейтрофилов/мл были посеяны на крышки, помещенные в 12-колодую пластину и стимулируемые либо 20 нМ PMA или оставленные нестимулированными в течение 150 мин. Образцы были затем окрашены с использованием первичных кролика анти-человеческих антитела нейтрофилов, вторичный коза анти-кроличьи флюорофора конъюгированных антител и DAPI - флуоресцентно помечены красителя, который пятна ДНК (см. таблицу материалов для деталей). Минимум 5 изображений были получен...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NET формирования является относительно недавним дополнением к разнообразным нейтрофил вооружения4 и наблюдается заметный всплеск интереса к изучению последствий NETs в широком спектре областей исследований5,7,14,15. Приобретение изображений с использованием иммунофлуоресцентной микроскопии и последующая количественная оценка изображений является широко используемым метод...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ТМ и PN имеют патент, связанный с алгоритмами, используемыми в NET'UANT.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Работа финансировалась Фондом Crafoord (TM и PN), Шведским правительственным исследовательским грантом (PN, TM), Шведским исследовательским советом (PN) и Фондом Грощинского (TM, PN).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
BD Vacutainer Гепаринизированные пластиковые пробиркиBD Biosciences367885
LymphoprepAxis-Shield114547
RPMI-1640 с L-глутаминомGibco11835-030
50 мл конические колбыSarstedt62.547.004
15 мл конические колбыSarstedt62.554.002
12-луночные тканевые Пластины для культивированияFalcon10626491
#1 Покровные стекла 10ммMenzel GlaserCS10100
Стеклянные стеклаMenzel Glaser631-0098
Первичная античеловеческая эластазаDAKODAKO кролик 1373, контрактная иммунизация
Вторичный флуорофор конъюгированный козий антикроликLife technologiesA-11072, A-11070
PROLONG-Gold Антифейдный реагент сDAPI Life technologiesP36930Монтажная среда
Сыворотка от козSigma-AldrichG9023
Phorbol 12-миристат 13-ацетат (PMA)Sigma-Aldrich79346
ПараформальдегидSigma-Aldrich158127
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Nikon Ti-E Эпифлуоресцентный микроскопNikon
CCD камераAndor Zyla
Plan Apochromat 20x, объективы 40xNikon
Windows 10Microsoft Операционная система
macOS Sierra 10.12Операционная системаApple
MATLABMathworks

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
  2. Borregaard, N., Cowland, J. B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).
  3. Nordenfelt, P., Tapper, H. Phagosome dynamics during phagocytosis by neutrophils. Journal of Leukocyte Biology. 90 (2), 271-284 (2011).
  4. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  5. Sorensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps - the dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
  6. Yipp, B. G., Kubes, P. NETosis: how vital is it? Blood. 122 (16), 2784-2794 (2013).
  7. Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23 (3), 279-287 (2017).
  8. Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).
  9. Mohanty, T., et al. A novel mechanism for NETosis provides antimicrobial defense at the oral mucosa. Blood. 126 (18), 2128-2137 (2015).
  10. Hakkim, A., et al. Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation. Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).
  11. Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413(2012).
  12. Coelho, L. P., et al. Automatic determination of NET (neutrophil extracellular traps) coverage in fluorescent microscopy images. Bioinformatics. 31 (14), 2364-2370 (2015).
  13. Mohanty, T., Sorensen, O. E., Nordenfelt, P. NETQUANT: Automated Quantification of Neutrophil Extracellular Traps. Frontiers in Immunology. 8, 1999(2017).
  14. Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity. Journal of Immunology. 189 (6), 2689-2695 (2012).
  15. Cedervall, J., Olsson, A. K. Immunity Gone Astray - NETs in Cancer. Trends in Cancer. 2 (11), 633-634 (2016).
  16. Ginley, B. G., et al. Computational detection and quantification of human and mouse neutrophil extracellular traps in flow cytometry and confocal microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 17755(2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

NETNETNETQUANTPMA

Похожие статьи