Морфометрические протокол для объективной оценки бластоциста поведения во время стеклования и потепления шаги

Summary

Здесь мы представляем покадровой морфометрические протокол следовать интенсивность бластоциста усадки и ре расширение во время previtrification вмешательства и после потепления восстановления. Применение протокола возможен в в пробирке оплодотворение лаборатории, оснащенные покадровой Микроскопы и рекомендуется в разработке оптимальной бластоциста витрификации метода.

Abstract

Эта статья описывает метод неинвазивной бластоциста морфометрия, основанные на промежуток времени микрофотографирование для точного мониторинга бластоциста тома меняется на отдельных этапах до и после витрификации. Метод может быть полезным в поисках наиболее оптимальных сроках бластоциста воздействия различных концентрациями криопротекторов, наблюдая бластоциста усадки и ре расширение в различных до и после витрификации фазы. С этой методологией протокол витрификации бластоцисты могут быть оптимизированы. Для лучшей демонстрации полезности этого метода морфометрических сравниваются два разных бластоциста подготовка протоколов для витрификации; один с использованием искусственных blastocoel рушится и один без этого вмешательства до витрификации. Оба изменения объема бластоцисты следуют промежуток времени микрофотографирование и измеряется инструменты для редактирования фотографий программного обеспечения. Измерения проводятся каждые 20 секунд в previtrification фаз и каждые 5 минут в период после потепления. В линии диаграммы графически представлены изменения размеров бластоциста за единицу времени. Результаты показывают фазы previtrification длинный уравновешивания, в котором нетронутыми бластоциста сначала сжимается и затем медленно заправки blastocoel, введя стеклования с blastocoel, заполненные жидкостью. Искусственно рухнул бластоциста остается в стадии усохшие через весь уравновешивания фазу. Во время этапа витрификации он также не изменяет его объем. Так как бластоциста морфометрия показывает постоянный объем искусственно рухнул бластоцист на этапе previtrification, кажется, что этот этап может быть короче. Описывается протокол предоставляет множество дополнительных сравнительных параметров бластоциста поведения во время и после криоконсервирования на основе скорости и интенсивности изменений объема, количество частичной blastocoel схватки или всего бластоцисты рушится и время для всего blastocoel re расширению или время для штриховки.

Introduction

Криоконсервация эмбрионов человека Предимплантационная от в vitro программы оплодотворения (IVF) является в настоящее время обычной практикой в большинстве лабораторий Эко. Медленно эмбриона замораживания метод начал клинически использоваться в 1985 году, с введением конкретных криопротекторов и компьютерным управлением морозильных камер, которые позволили контролируемого охлаждения эмбрионов до-7 ° C, когда вызывали нуклеации льда (посев) окружающие криозащитных средних¹. Путем непрерывного охлаждения, будут расти кристаллы льда, вызывая hyperosmolality оставшиеся жидкой фракции и, следовательно, обезвоживания и усадки эмбриональных клеток. При-30 ° C или ° C-80 эмбрионы будет ввергнута в жидкого азота для более длительного хранения. Что происходит с яйцеклеток или эмбрионов во время охлаждения можно наблюдать только в специально адаптированных cryomicroscopes, который помог улучшить криоконсервирования протоколы². Замораживание бластоцисты, больший объем и более жидкости содержатся эмбриональной стадии, дал менее перспективным клинические результаты в эти дни³.

Прорыв в криоконсервирования бластоциста было введение витрификации метода, в котором обезвоживания клеток имела место до охлаждения с помощью высоких концентраций криопротектора⁴. Удаления жидкости из blastocoel до стеклования можно также добиться путем механического открытия между двумя трофоэктодерму клетки⁵. Хотя непосредственной бластоциста выживаемость после витрификации и потепление выше 90% и после клинических исходов передачи стеклообразное/утепленные бластоцисты в полость матки почти сопоставимо с результаты после передачи свежих эмбрионов, этот метод криоконсервирования еще не стандартизированных^6,7. Витрификация протоколы зависимости (типа и концентрации криопротектора, (b количество previtrification шагов, (c) продолжительность отдельных шагов, (d) использование искусственного blastocoel, рушится перед витрификации или нет, (e). рушится на котором эмбрионы должны быть методы, стадии бластоцисты расширения (f) и (g) температура уравновешивания/витрификации стеклообразное⁸. Так как криопротекторов могут быть токсичны для клеток, время экспозиции бластоциста этих решений имеет быть четко определены. Однако некоторые производители криоконсервирования СМИ позволяют очень гибкие протоколы.

Интерес ученых обычно сосредоточена на изучении бластоциста ре расширение способности с целью найти нового биомаркерами с лучше прогноз имплантации^6,9,10. Как человека бластоцисты обезвоживают на различные этапы добавления криопротекторов перед витрификация и что происходит с бластоцисты после витрификации и потепления, когда криопротекторов должны быть удалены из клетки, и как бластоцисты увлажняет и повторно разверните после потепления, не очень хорошо описал не понял. Таким образом, обоснование является разработка методологии для цели и количественных мониторинг бластоциста поведения во время различных криоконсервирования шаги.

С покадровой Микроскопы различных производителей это теперь возможно контролировать поведение бластоцисты в до и после витрификации фазы. Включив дополнительные компьютерные инструменты, могут также выполняться измерения их размера (морфометрия). Измерении уменьшение или увеличение размера эмбриона на данный момент, это позволяет объективизировать оценки morphodynamics эмбрионов во время обезвоживания и регидратации.

Protocol

Все методы, описанные здесь были одобрены Национальный комитет медицинской этики на 19 апреля 2016 (№ 0120-204/2016 – 2).

1. Установка системы записи микроскопа

1. Выключите нагревательная пластинка микроскопа.
2. Перед началом любого лечения сделать снимок бластоциста под камеры оборудованных инвертированным микроскопом. Не забудьте отметить увеличение, на которой был записан бластоциста.

2. отбор и предподготовки бластоцисты для витрификации

1. Выберите только полностью расширенной день-5 или 6 день бластоцисты криоконсервирования с по крайней мере несколько внутренних ячейки массы (ICM) клетки и сплоченной трофоэктодерму.
2. Для лазер лечение бластоцист с рухнул blastocoel тема бластоциста для короткого лазерного импульса (0,4 - 0,7 мс) с отверстием диаметром от 4,3 до 9,4 мкм, вскользь направлена на zona pellucida и на стыке двух прилегающих trophectodermal клеток. Разрешить бластоцисты полностью или частично свернуть на 5 мин.
3. Для без лечения бластоцист с нетронутыми blastocoel выполняют не конкретного лечения перед витрификации.
   Примечание: Эти бластоцисты, считаются неповрежденными.

3. Подготовка криопротектора и Петри блюдо для этапа уравновешивания

1. Использование pithe дозатор для ооцитов денудации (диаметр 135 мкм) фасовать уравновешивания СМИ (M-199 HEPES-амортизированное средний с 7,5% ДМСО, 7,5% этиленгликоля, 20% DSS) в отверстия микрокапель области 9-Ну Петри, специально разработанные для покадровой микроскопии и записи.
   Примечание: Ооцитов денудации представляет собой процесс удаления кучевые клеток, окружающих ооцитов. Использование пипетки для ооцитов денудации поможет избежать создания воздушных пузырьков.
2. Наложение области микрокапель с 30 мкл уравновешивания средств массовой информации.

4. Передача бластоцисты в растворе уравновешивания

1. Погружаться лазерное лечение или нетронутыми бластоцисты в средство уравновешивания в нижней части области микрокапель микрокапель блюдо для 10 мин при комнатной температуре (уравновешивания фаза).
2. Начните отсчет 10-мин, как только бластоциста передается средство уравновешивания.

5. запись бластоциста на этапе уравновешивания

1. Передать микрокапель блюдо с бластоциста оборудованные камеры микроскопа. Используйте же увеличение как ранее снимок же бластоциста. Положение микрокапель блюдо, так что бластоциста расположен примерно в центре записи.
2. Начните запись с микроскопом, записи программного обеспечения. Примечание время обратного отсчета, с которой начинается запись.
   Примечание: Представитель результаты записей нетронутыми (рис. 1, 1 видео) и рухнул бластоцисты (рис. 2, 2 видео) во время 10-мин экспозиции для уравновешивания решения.

6. витрификация бластоциста

1. Асептически обойтись 50 мкл капля раствора стеклования (M-199 HEPES-амортизированное средний с 15% ДМСО, этиленгликоля и 15%, 20% DSS, 0,5 М сахарозы) в чашку Петри 2 мин до окончания обратного отсчета.
2. Остановить запись когда отсчет 10-мин заканчивается и быстро передавать бластоциста витрификации решение для 30 s при комнатной температуре.
3. Аккуратно Пипетка бластоциста по крайней мере 1 x в рамках решения витрификации.
4. Используйте витрификации соломы для загрузки бластоциста. Загрузки, уплотнение и ввергнуть витрификации соломы в жидкий азот (LN) в пределах 80 s, не более 110 s после первоначального воздействия витрификации решение.

7. видео Редактирование записанных бластоцисты на этапе уравновешивания

1. Импортируйте файл записанного видео в видео редактирования программного обеспечения.
2. Переместите ползунок шкалы времени 20 s. Примечание номер кадра на данный момент.
   Примечание: Этот номер будет использоваться для уничтожать ненужные кадры. Только кадры каждые 20 s будет использоваться.
3. Нажмите вкладку « видео », затем Частота кадров.... В разделе преобразования частоты кадровпроверьте поле Decimate по и введите номер кадра отмечалось ранее. Подтвердите, нажав кнопку ОК. Выберите файл → → Экспорт последовательности изображений.
4. Выберите JPEG в качестве выходного формата, задать каталог для хранения сохраненной последовательности изображений и нажмите кнопку ОК.
   Примечание: Это создаст каталог с до 30 изображений записанные бластоцисты в последовательности на этапе уравновешивания витрификации.

8. измерения бластоциста сечение от изображения, созданные на этапе уравновешивания

1. Открываете видео анализ программного обеспечения. Перейдите на вкладку окна и выберите временная шкала.
2. В панели Timeline, нажмите на знак газа фильм и выбрать Добавить СМИ... , чтобы добавить изображение бластоциста до этапа уравновешивания витрификации — и до лазерного вмешательства, если есть любые.
   Примечание: Это изображение будет показывать бластоцисты на ее наиболее развернутом состоянии и его площадь поперечного сечения будет служить в качестве ссылки.
3. Добавьте последовательность изображений соответствующего бластоцисты, созданные ранее с видео редактирования программного обеспечения (фазы уравновешивания стеклования).
4. Перейти на изображение → анализ → Выделить точки данных → Custom для открытия окна Выбор точек данных .
5. Отмените выбор всех точек данных, а затем выберите только области и подтвердите, нажав кнопку ОК.
6. Переместите ползунок шкалы времени в окне Timeline первое изображение.
7. Перейдите на вкладку окна и выберите Tools.
   Примечание: Это будет активировать панель инструментов на левой стороне.
8. Выберите инструмент быстрого выделения.
9. Поместите инструмент маркер внутри бластоциста прикоснуться к краю бластоциста. Наброски бластоциста, поместив маркер инструмент на внешний край бластоцисты, нажав и удерживая левую кнопку мыши и перетаскивания маркера инструмент вдоль внешнего края бластоциста до бластоцисты всей площади поперечного сечения выбирается.
   Примечание: Zona pellucida не является частью измерения, поэтому он должен быть исключен (рис. 5).
10. В окне временной шкалы выберите Журнал замеров и нажмите кнопку « Записать измерения ».
    Примечание: Это будет записывать выбранной области.
11. Вернуться к временной шкале, щелкните правой кнопкой мыши на изображении и выберите «Отменить выделение».
12. Переместите ползунок шкалы времени к следующему изображению и нажмите на соответствующие плитки под ним.
13. Наброски бластоцисты в новое изображение с быстрый инструмент «Выделение». Повторите измерение.
14. Повторите эту процедуру (шаги 8,9-8,13) изображения на изображение до тех пор, пока все изображения поперечного области измеряется и регистрируется.
15. В конце концов перейдите в журнале измерений, выберите все измерения в области переменной и экспортировать их в файл .txt.
    Примечание: Единицы площади поперечного сечения, квадратные пикселы.

9. Редактирование файла данных с записанные бластоциста поперечного области от изображения, созданные на этапе уравновешивания

1. Передачи данных записанных бластоциста поперечного сечения областей из txt-файла в табличном редакторе.
2. Используйте первое поперечное сечение значение как значение ссылки 1 и Экспресс (преобразование) все другие значения быть часть этого ссылаться на значение.
3. Создайте новую переменную Area_r и вставить значения области транскодирования (за исключением значение ссылки) под ним.
4. Рядом с переменной Area_r создайте переменную времени и добавить первое значение времени.
   Примечание: Первое значение времени представляет собой время, которое прошло с момента, когда была разоблачена бластоциста уравновешивания решение для начала записи под микроскопом оборудованы камерой.
5. Рассчитать каждый следующий раз подряд значение путем добавления 20 s к предыдущему значению времени.
   Примечание: Это интервал времени, используемый в истребляя ненужных кадров видео, созданные во время записи.

10. потепление бластоциста

1. Подготовьте СМИ для утепления.
   1. За день до потепления бластоциста, асептически обойтись три капли 150 мкл восстановления среды в 4-ну блюдо. Кроме того асептически отказаться от восстановления среды в блюдо 9-Ну микрокапель специально для покадровой микроскопии и записи. Средство восстановления накрыть парафинового масла и preincubate при 37 ° C с 6% CO₂ и 5% O₂.
      Примечание: Восстановление среды является средством культивирования для стадии бластоцисты эмбрионы с добавил человеческого сывороточного альбумина (HSA). HSA в среде восстановления должно быть 12 мг/мл. Чтобы заполнить дыры в 9-Ну блюдо, использовать дозатор для ооцитов денудации, чтобы избежать воздушных пузырей, а затем наложения области микрокапель с 30 мкл восстановления среды.
   2. В день потепления бластоциста асептически обойтись 500 мкл оттаивания решение (TS) в один хорошо 4-ну блюдо и позволить ей нагреться до 37 ° C в инкубаторе без CO₂.
   3. При комнатной температуре асептически обходиться одной капли 50 мкл разрежения (DS) решение и две капли 50 мкл моющего раствора (WS) в стерильных Петри. Обложка DS и и WS1 WS2 капли с парафинового масла.
      Примечание: Вместо чашку Петри, 4-хорошо блюдо может также использоваться.
2. Теплый бластоциста.
   1. Идентифицировать HSV соломы с стеклообразное бластоциста быть удалены из хранилища LN и быстро передавать LN-заполнены портативный водохранилище в рамках подготовки к процедуре потепления соломы.
   2. Поднимите соломы с щипцами, просто достаточно, чтобы разоблачить род цветной обработки. Используйте саморегулирующиеся зачистки проводов сократить соломы на высоте цветной обработки стержня.
   3. Захватить обработки стержня и извлечь его из соломы с быстрым, но контролируемые движения, и сразу окунуться изогнутые шпатель обработки стержня в 37 ° C TS.
   4. Аккуратно водоворот обработки стержня отсоединить бластоцисты и оставить его в общей сложности 1 мин в TS.
   5. При комнатной температуре Передача бластоцисты последовательно DS и WS1 WS2 4 мин в каждой среде.
   6. После потепления процедуры передать бластоциста 4-ну блюдо с восстановления средне и мыть все три капли мягко закупорить.
      Примечание: Стирка осуществляется в приблизительно 1 мин.
   7. Передать бластоциста покадровой 9-Ну блюдо с восстановления среды. Место 9-Ну блюдо под камеру замедленной съемки в инкубатор (при 37 ° C с 6% CO₂ и 5% O₂).
      Примечание: Автошоу потепления процедура, которая продолжается с размещением 9-Ну блюдо под камеру замедленной съемки в инкубаторе, длится приблизительно 17 мин.

11. промежуток времени записи во время восстановления после потепления бластоциста Re-расширения

1. Запуск покадровой записи программного обеспечения.
2. Выберите запись камеры.
3. Нажмите кнопку Live режиме .
4. Наведите курсор мыши на изображение и используйте кнопки прокрутки для его увеличения. Нажмите и удерживайте левую кнопку мыши и переместить курсор поставить наилучшим образом с бластоцисты в середине экрана.
5. Под фокусировкииспользуйте зеленые стрелки вверх вниз сосредоточиться плоскости записи бластоциста. В интенсивности светаЗадайте интенсивность света.
6. Нажмите кнопку Параметры Микроскоп для задания времени экспозиции и гамма.
7. Нажмите Закрыть режиме реального времени.
8. Нажмите кнопку запуска проекта и введите данные проекта, выберите тип культуры блюдо (3 x 3 или 4 x 4) и снимите все должности, за исключением одного быть записаны.
9. Установка захвата сроков принять снимок каждые 5 мин.
10. Начните запись, нажав на кнопку утвердить . Записи по крайней мере 150 мин.
11. Остановите запись, нажав кнопку остановить проект .
    Примечание: Видите представителя результаты записи нетронутыми (рис. 3) и рухнул бластоцисты (рис. 4) во время периода восстановления после потепления.

12. видео Редактирование записанных бластоциста во время расширения после потепления

1. Перейдите в папку проекта и найдите записанные изображения, которые примерно 80 KB в размер.
2. Создайте другую папку и передавать эти образы в него. Переименуйте изображения в цифрах по времени создания. Импортируйте их в программное обеспечение как последовательности изображений для редактирования видео.
3. Перейдите на вкладку видео → Фильтр → добавить и выберите пункт фильтр преобразования Null .
4. Нажмите кнопку Обрезка на правой стороне и обрезать изображения, оставляя видимыми только поле с записанные бластоциста. Подтвердите с ОК и снова ОК.
5. Выберите файл → → Экспорт последовательности изображений. Выберите JPEG в качестве выходного формата, задать каталог для хранения сохраненной последовательности изображений и нажмите кнопку ОК.
   Примечание: Это создаст размер (КРОП) изображения, подготовленные для дальнейших измерений в видео анализ программного обеспечения.

13. Установка шкалы измерений в видео анализ программного обеспечения для изображений, созданных с покадровой записи программного обеспечения

1. Запустите анализатор покадровой записи программного обеспечения.
2. Откройте проект с записанные бластоциста.
3. Нажмите кнопку Analyze на поле с записанные бластоциста.
   Примечание: Будет открыто новое окно Analyze. Нажмите на кнопку измерения , чтобы показать средство измерения.
4. Используйте средство измерения для измерения ширины всего изображения.
5. Щелкните правой кнопкой мыши на изображение и сохраните его. В свойства установите ширину изображения в пикселях.
6. Разделите фактической ширины изображения с его ширина в пикселях.
   Примечание: Это рассчитывает фактическую длину одного пикселя в этом изображении.
7. Запустите программное обеспечение анализа видео.
8. Перейдите на вкладку окна и выберите временная шкала.
9. В панели Timeline нажмите на знак газа фильма и выберите Добавить медиа... добавить последовательность изображений после теплых повторное расширение бластоциста.
10. Нажмите изображение → анализ → Задать шкалу измерений → Custom для открытия окна шкалы измерения. Для пикселей длины введите 1; для логическим длине введите ранее рассчитанный фактическую длину пикселей (шаг 13,6); Логические единицы введите мкм. сохранить пресет.

14. измерения бластоциста площадь поперечного сечения из изображений, созданных во время после теплого Re расширению

1. Как только шкала измерения набор и импорте последовательности изображений, измерьте бластоциста поперечного области так же, как описано в шаге 8, с той лишь разницей, что измеренная поперечного области в эти измерения имеют единиц в мкм² .

15. Редактирование файла данных с записанные бластоциста поперечного области от изображения созданные во время после теплого Re расширению

1. Передачи данных записанных бластоциста поперечного сечения областей из txt-файла в табличном редакторе.
2. Создайте переменную времени рядом с переменной области и добавить первое значение времени.
   Примечание: В этом случае, первый раз значение 0 минут, которая является началом покадровой записи. Каждый следующий раз подряд значение рассчитывается путем добавления 5 минут к предыдущему значению времени. Пять минут — интервал времени, используемый между двух последовательных покадровой записи.

16. Создание линии схемы

1. Импорт файла данных электронной таблицы в статистический анализ программного обеспечения для создания время участок бластоциста площадь поперечного сечения изменения во времени на этапе уравновешивания витрификации или ре расширение после потепления.

Results

В демонстрации мы показали бластоциста morphodynamics только один previtrification и одну фазу после потепления. Разница в объеме бластоцисты в конце этапа уравновешивания и в начале восстановления в среде культуры, показали интенсивность усадка эмбриона, который, по сути, интенсивность сохранения эмбрионов против льда кристаллизации.

Как можно заметить из рис. 1 и 1 видео, полность...

Discussion

Протокол для наблюдения бластоциста morphodynamics во время и после криоконсервирования также может осуществляться с помощью аналогичных инструментов и программных средств от других производителей. Промежуток времени системы, скорректированные с учетом эмбриологии позволяют непрерывный мониторинг развития эмбриона. Целью этой работы было ввести количественная оценка бластоциста поведения во время подготовки бластоцисты стеклования и после их потепления. Это было сделано путем объективного измерения изменений в морфологии...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Инвертированный микроскоп Eclipse TE2000-U	Nikon, Япония
	Исследовательская лазерная система Saturn 5	, Ориджио, Дания
Цифровая камера DC1	Research Instruments, Оригио, Дания	/
Цифровая камера DC2	Research Instruments, Оригио, Дания
Cronus 3.7	Research Instruments, Origio, Дания	/	программное обеспечение для записи микроскопа
Инкубатор с 6% CO2, 5% O2	связующим, Германия	/
микроскоп Primo Vision	Vitrolife, Швеция	16600
Программное обеспечение Primo Vision Capture	Vitrolife, Швеция	16608	программное обеспечение для цейтраферной записи
Adobe Photoshop CS6 Расширенное программное обеспечение	Adobe Systems Incorporated, США	/	программное обеспечение для анализа видео
VirtualDub	Эйвери Ли	/	программа для редактирования видео
Microsoft Office Excell	Microsoft, США	/	редактор электронных таблиц
PrimoVision блюдо для культуры	Vitrolife, Швеция	16604
G2-plus medium	Vitrolife, Швеция	10132	среда для культивирования эмбрионов стадии бластоцисты Сыворотка
крови человека	Albumins Vitrolife, Швеция	10064
Парафиновое масло	Vitrolife, Швеция	10029
Уравновешивающая среда	Irvine Scientific, Ирландия	90131
Среда для витрификации	Irvine Scientific, Ирландия	90132
Среда для размораживания	Irvine Scientific, Ирландия	90134
Среда для разбавления	Irvine Scientific, Ирландия	90135
Среда для промывки	Irvine Scientific, Ирландия	90136
Трубочки для витрификации HSV	CryoBio System, Франция	025246, 025249, 025250, 025248
Жидкий азот	/
криососуд Biosafe 120 MD β	Cryotherm, Германия	229286
Криобак	Cryotherm, Германия
Щипцы	/	/
Ножницы	/	/
Пиппет для манипуляций с бластоцистами	Gynetics,	Бельгия ID275/10	диаметр 275 &микро; m
Пипетка для денудации ооцитов	Vitromed, Германия	V-DEN-135	диаметр 135 & микро; m
Пипеттор EZ-Grip	Research Instruments	7-72-2802
Цифровой интервальный таймер Assistent	Glaswarenfabrik Карл Хехт	41977010
IBM SPSS Statistics 21	IBM, программное обеспечение для США	/	статистического анализа
Саморегулирующийся инструмент для зачистки проводов	Knipex, Германия	1262180