Методическая статья

Цифровой анализ иммуностоинга взаимодействующих белков в тканях легких человека

4.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58551

⸱

1 мая 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hematology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, 2Department of Thoracic Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, 3Department of Human Anatomy, Histology and Embryology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences, School of Basic Medicine, Peking Union Medical College, 4Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences, Wuhan University, 5Department of Gastroenterology, Central Hospital of Wuhan, 6Department of Transfusion, Zhongnan Hospital of Wuhan University

В этой статье

Краткое содержание

Взаимодействующий белок W10 (ЗВИНТ) участвует в митотической шпиндельной контрольно-пропускной пункт и патогенезе карциномы. Здесь мы вводим методологию иммуностоинга зВИНТ в тканях рака легких человека, а затем цифровое сканирование целых слайдов и анализ изображений. Эта методология может обеспечить высокое качество цифровых изображений и надежные результаты.

Аннотация

Целью данного исследования является внедрение методологии иммуностоинга тканей легких человека, за которой следует цифровое сканирование и анализ изображений. Цифровое сканирование — это быстрый способ сканировать стопку слайдов и создавать цифровые изображения с высоким качеством. Он может производить соответствующие результаты с помощью обычной световой микроскопии (CLM) патологоанатомами. Кроме того, наличие цифровых изображений позволяет позволить одним и тем же слайдам одновременно наблюдаться несколькими людьми. Кроме того, цифровые изображения слайдов могут храниться в базе данных, что означает, что можно избежать длительного износа стеклянных слайдов. Ограничения этого метода таковы. Во-первых, она нуждается в высококачественной подготовленной ткани и оригинальных слайдах иммуногистохимии (IHC) без каких-либо повреждений или избыточного остатка герметика. Во-вторых, опухолевые или неопухолевые области должны быть указаны опытными патологоанатомами перед анализом с помощью программного обеспечения, чтобы избежать путаницы о опухоли или неопухолевых областях во время скоринга. В-третьих, оператор должен контролировать воспроизведение цвета на протяжении всего процесса оцифровки в визуализации с целью сканирования.

Введение

Взаимодействующий белок W10 (ЗВИНТ) является необходимым компонентом кинетохорного комплекса, который участвует в митотической шпиндельной контрольно-пропускной пункте1,2,3. Сообщалось, что истощение ЗВИНТ приводит к аномальной преждевременнойхромосомной сегрегации 1,2,3. Недавние исследования показали, что ЗВИНТ участвует в патогенезе множественных опухолей, способствуя пролиферации опухолевых клеток4,5. Ранее мы сообщали о переэкспрессии зВИНТ при раке легких5. Общепризнано, что анализ слайдов патологоанатомов с использованиемCLM занимает много времени, а не количественный 6,7,8. Кроме того, износ хранимых стеклянных слайдов может сделать невозможным втягивание ранее созданных слайдов. Новый метод компьютерной, цифровой визуализации цельного слайда (WSI) может преодолеть эти ограничения6,7,8.

С этой целью мы описываем методологию иммуностоинга зВИНТ в тканях рака легких человека в сочетании с цифровым сканированием и программным анализом изображений. Основным преимуществом этой методики является производство соответствующих результатов с CLM. Эта технология может быть широко использована в области патологического скоринга гематоксилин-эозина окрашивания (H и E) и IHC, флуоресценция на месте гибридизации (FISH), ткани microarrays (TMA), и открытие и развитие наркотиков.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все описанные здесь методы были одобрены Этическим комитетом больницы Чжуннань Уханьского университета и больницей Ренмин Уханьского университета.

1. Подготовка слайдов IHC

  1. Исправить образец легочной ткани, погрузив фрагмент легочной ткани человека (около 3 х 3 см) в 4% параформальдегида в фосфат-буферированном солей (PBS) в течение 24 ч при комнатной температуре (RT).
  2. Обезвождение ткани в 80%, 95%, и 100% этанола в течение 15 мин, 20 мин, и 20 мин, соответственно, при комнатной температуре. Наконец, погрузите ткань в 100% ксилена 3x на 20 минут каждый при комнатной температуре.
  3. Для встраивания погрузите ткань в парафин (63 градуса по Цельсию) в течение 30 мин. Измените парафин и погрузите ткань еще на 45 мин. Наконец, изменить парафин снова и погрузить ткани в него еще на 1 ч.
  4. Используйте роторный микротом, чтобы разрезать ткань на 5 мкм толщиной разделов и поместить их на 20 мкг /мЛ поли-L-лизин покрытием слайдов.
  5. Для девокинга поместите горки в духовку 65 градусов по Цельсию в течение 2 ч, а затем погрузите секции в диметилбензен в течение 15 мин, а затем замачивайте 100% ксилена в течение 15 мин.
  6. Гидрат слайды с тканевой секции 2x на 5 мин в 100% этанола, а затем лечение с последовательно разбавленного этанола 5 мин в 95% этанола, 5 мин в 80% этанола, 5 мин в 70% этанола, и 5 мин в 50% этанола.
  7. Выполните антигенный ремонт.
    1. Разбавленная лимонная кислота ремонт жидкости (20x) до 1x с двойной дистиллированной H2O (ddH2O).
    2. Поместите слайды с секциями тканей и 1x лимонной кислоты ремонт жидкости (300 мл) в антиген ремонт коробки, а затем, тепло их в микроволновой печи при высокой мощности в течение 2 минут, а затем нагрева при низкой мощности для поддержания кипения в течение 6 мин.
    3. Дайте секциям остыть естественным образом до комнатной температуры.
    4. Замените лимонную кислотную ремонтную жидкость 0,01 М ПБС, промойте секции 3x, каждый раз в течение 5 мин, в роторный шейкер при комнатной температуре.
  8. Устраните эндогенную переоксидаза.
    1. Разбавить 30% H2O2 до 3% с ddH2O, добавить его в слайды (убедитесь, что она охватывает все ткани), и инкубировать слайды во мокром ящике при комнатной температуре в течение 30 минут.
      Примечание: Влажная коробка представляет собой пластиковую коробку 10 х 15 см и может содержать воду.
    2. Вымойте слайды 3x, каждый раз в течение 5 минут, с 0,01 М PBS в роторной шейкер при комнатной температуре.
  9. Блокируйте неспецифический антиген.
    1. Разбавить концентрированную нормальную козью сыворотку до 10% козьей сыворотки с PBS с 0,1% Tween 20 (PBST).
    2. Добавьте 10% козьей сыворотки к горок и инкубировать их в мокрой коробке при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут.
      Примечание: Сыворотка козы должна охватывать все ткани в слайдах.
  10. Попятнайте ткани.
    1. Инкубировать слайды с кроликом анти-человеческого анти-ЗВИНТ антитела (1:50) на 4 КС в одночасье.
    2. Вымойте слайды 3x, каждый раз в течение 5 мин, с 0,01 M PBST (1 мл 0,1% Tween 20 в 1000 мл PBS) в роторный шейкер при комнатной температуре.
    3. Инкубировать слайды со вторичными антителами (анти-кроличья система обнаружения, 1:200) в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия.
    4. Вымойте слайды 3x, каждый раз в течение 5 минут, с 0,01 M PBST в роторный шейкер.
  11. Чтобы визуализировать иммуностоидинг, добавьте слайды до 300 кл свежего 3,3-диаминобензидина, а затем промойте горки водопроводной водой при комнатной температуре.
    Примечание: Степень окрашивания контролируется под микроскопом (увеличение 10X - 40X).
  12. Противопоставление ткани. Пятно горки с гематаксилином окрашивающий раствор в течение 2 мин при комнатной температуре, а затем, мыть горки с водопроводной водой в течение 15 минут.
    Примечание: Ядро появляется синий под микроскопом (увеличение 10X - 40X). Если степень синего окрашивания является более мощным, дифференциация соляного алкоголя на 3 - 5 с может быть использована, а затем промыть ткани обратно в синий с водопроводной водой в течение 15 минут, чтобы облегчить видные окрашивания ткани.
  13. Обезвоживать горки в течение 5 мин в 50% этанола, 5 мин в 70% этанола, 2x в 80% этанола в течение 5 мин, 5 мин в 95% этанола, и, наконец, 2x на 5 мин каждый в 100% этанола при комнатной температуре.
  14. Для прозрачности погрузите секции тканей в бак, содержащий 100% ксилена в течение 15 мин, и перенесите секции в другой резервуар, содержащий 100% ксилен в течение 15 мин при комнатной температуре.
  15. Для уплотнения возьмите 50 - 100 л нейтральной десен и добавьте 5% ксилена в смесь (избегайте смешивания пузырьков). Добавьте 15 кл.л. вышеупомянутой смеси в разделы легочной ткани. Запечатать пленку с крышкой стекла и осторожно нажмите пузырьки.

2. Автоматическое сканирование всего слайда слайдов IHC

  1. Дайте запечатанным горки высохнуть в течение 12 ч при комнатной температуре, чтобы высушить их.
  2. Выберите опцию Bright field вручную и введите интерфейс ручного сканирования.
  3. Пересмотрите название слайдов и выберите путь хранения для изображений.
  4. Установите область сканирования и выберите примеры сканирования опции с использованием пороговых значений, установленныхпользователями. Порог составляет около 50 с значением расширения области сканирования 200 мкм.
  5. Установите значение фокусировки сканирования, выберите фокус автоматически — оно колеблется от 1050 до 2650 и, наконец, выберите однослойныйрежим.
  6. Загрузите слайды IHC на рабочую станцию и начните автоматическое сканирование.
    Примечание: Убедитесь, что слайды не повреждены. Поддержание слайдов чистыми и полупрозрачными и избежать пыли, конфетти, и избыток остатков герметика на слайдах. Стеклянная горка и крышка должны быть лишены знаков. Не чистите горки ксиленом. Размер слайдов приведен в таблице 1.
  7. Автоматическое сканирование всей секции тканей на слайде с 20X, 40X или 100X увеличение.
  8. Сбор и хранение изображений в конце сканирования в целом слайда.

3. Анализ слайдов с помощью программного обеспечения для визуализации

  1. Начните гистопатологический анализ изображений программного обеспечения и выбрать локальный компьютер.
  2. Откройте файл, в котором хранятся данные сканирования.
  3. Выберите подходящий уровень масштабирования в диапазоне 2X до 40X.
  4. Отрегулируйте цвет, чтобы установить оптимальный контраст через настройки цвета Toggle.
  5. Вручную обведите круг и назовите части интереса на каждом изображении.
    Примечание: Например, вы можете объехать одну область и назвать ее областью опухоли.
  6. Выберите плагины и КК. В это время всплывает строитель сценариев.
  7. Выберите квант плотности и отрегулируйте панель Detection.
    Примечание: Этот процесс должен быть выполнен тщательно. Бар голубой толерантности используется для регулировки цвета клеточного ядра. Бар толерантности Браун используется для регулировки насыщенности заполнения цвета изображения. Результаты изображений после корректировки должны соответствовать исходным аналогам.
  8. Отрегулируйте уровни Оценка, чтобы сделать интенсивность окрашивания кружевных областей, аналогичных исходным изображениям.
    Примечание: Темно-коричневый цвет указывает на сильный положительный, коричнево-желтый умеренно положительный, светло-желтый слабо положительный, а белый отрицательный.
  9. Храните и назовите модель файлом. Примените модель к другим слайдам и выберите выбранную аннотацию".
  10. Пусть программное обеспечение автоматически вычислит H-оценку для обведемых областей на изображении.

4. Количественная оценка баллов с использованием H-системы подсчета баллов9,10

  1. Рассчитайте процент иммуностоинга и интенсивность окрашивания (0: отрицательный, 1 ": слабый, 2 ": умеренный, 3": сильный).
  2. Используйте систему скоринга (H-score) для расчета патологического скоринга опухоли и прилегающих неопухолевых областей.
    Примечание: H-оценка (% клеток со слабой интенсивностью x 1) (% клеток с умеренной интенсивностью x 2) (% клеток с сильной интенсивностью x 3). Таким образом, максимальный H-оценка составляет 300, если 100% клеток количественно с сильной интенсивностью.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы измерили уровни экспрессии зВИНТа в 28 парах немелкоклеточного рака легких (NSCLC) образцов (опухолевые и прилегающие неопухолевые ткани), в том числе 14 плоскоклеточных карциномы (SCCs) и 14 аденокарциномы (ADCs), По МХК. Полное скользящное цифровое сканирование слайдов обеспечило цифровые изображения высокого качества(рисунок 1A). Результаты показали, что H-оценка рака легких была значительно выше, чем у соседних нераковых тканей (P lt; 0.0001, ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Сканирование цельного слайда становится горячей темой для его надежного сканирования и производства высококачественных изображений для клинических и исследовательских целей11,12,13. Изображения могут быть получены с помощью слайд-сканирования микроскопов в течениеминут 11,12,13. Применяя эту методологию, мы получили высококачественные и...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Этот проект был поддержан Национальным природным фондом Китая (No 81500151, 81400121, 81270607, 81541027 и 81501352) и Природным фондом провинции Хубэй (Китай) (No 2017CFB631). Авторы выражают свою признательность Го Цинь, Чан Мин, Ли Хуэй, и их коллеги в Wuhan Google биологических технологий Co., LTD за их техническую поддержку. Авторы также благодарят Мухаммада Джамаля за редактирование языка.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Pannoramic MIDI3D HISTECHCat: PMIDI-040709Автоматизированный цифровой сканер слайдов с замечательным набором функций: емкость 12 слайдов, флуоресцентное сканирование и многое другое.
QuantCenter3D HISTECHСкачан с официального сайта компанииФреймворк для приложений 3DHISTCH для анализа изображений.
LEICA RM2235Leica MicrosystemsCat: 14050038604Повышенная точность новых аксессуаров повысит удобство при приближении блока к ножу, а также ориентации образца.
Антитело кролика к человеку Anti-ZWINTAbcamCat: ab197794Иммуногистохимический анализ ZWINT в легочной ткани человека.
Вторичное антитело против кроликаWuhan Goodbio TechnologyCat:GB23303-1Вторичное антитело для окрашивания ИГХ.
Фосфатно-солевой буферWuhan Goodbio TechnologyCat:G0002Раствор, содержащий фосфатный буфер.
OLYMPUS CX23OLYMPUSМикроскоп Cat:6M87620для обнаружения H& Слайды E или IHC.
ДиметилбензолShanghai Lingfeng Chemical ReagentCat:1330-20-7Бесцветная, легковоспламеняющаяся жидкость, используемая в качестве растворителя и осветляющего агента при подготовке срезов тканей для микроскопического исследования.
Раствор для окрашивания гематоксилинаWuhan Servicebio technologyCat:G1039Обычно используется для гистологических исследований, часто окрашивает ядра клеток в синий цвет.
Tween 20BaitgCat:2005-64-5Это неионогенное поверхностно-активное вещество полисорбатного типа, образованное этоксилированием сорбитана перед добавлением лауриновой кислоты. Он используется в качестве отпугивающего средства и эмульгатора в фармакологических приложениях.
Жидкость для восстановления лимонной кислотыWuhan Servicebio technologyCat:G1202Is используется для восстановления антигена после фиксации во время процедуры IHC.
LEICA ASP200sLeicaCat: 14048043626Он был разработан для рутинной и исследовательской гистопатологии до 200 кассет.
LEICA Arcadia HLeicaCat: 14039354103Это станция для заделки парафина с подогревом, которая обеспечивает простую эксплуатацию и точное управление, что приводит к повышению качества, бесперебойному рабочему процессу и надежности.
LEICA Arcadia CLeicaCat: 14039354102Это холодная пластина, вмещающая более 60/65 кассет на своей большой рабочей поверхности. Он был разработан с адаптивным к окружающей среде модулем управления, чтобы гарантировать, что рабочая температура всегда стабилизируется на уровне -6°C.
Программное обеспечение CaseViewer3DHISTECH

Ссылки

  1. Endo, H., Ikeda, K., Urano, T., Horie-Inoue, K., Inoue, S. Terf/TRIM17 stimulates degradation of kinetochore protein ZWINT and regulates cell proliferation. The Journal of Biochemistry. 151 (2), 139-144 (2012).
  2. Wang, H., et al. Human Zwint-1 specifies localization of Zeste White 10 to kinetochores and is essential for mitotic checkpoint signaling. Journal of Biological Chemistry. 279 (52), 54590-54598 (2004).
  3. Lin, Y. T., Chen, Y., Wu, G., Lee, W. H. Hec1 sequentially recruits Zwint-1 and ZW10 to kinetochores for faithful chromosome segregation and spindle checkpoint control. Oncogene. 25 (52), 6901-6914 (2006).
  4. Ying, H., et al. Overexpression of Zwint predicts poor prognosis and promotes the proliferation of hepatocellular carcinoma by regulating cell-cycle-related proteins. OncoTargets and Therapy. 11, 689-702 (2018).
  5. Yuan, W., et al. Bioinformatic analysis of prognostic value of ZW10 interacting protein in lung cancer. OncoTargets and Therapy. 11, 1683-1695 (2018).
  6. Higgins, C. Applications and challenges of digital pathology and whole slide imaging. Biotechnic & Histochemistry. 90 (5), 341-347 (2015).
  7. Webster, J. D., Dunstan, R. W. Whole-slide imaging and automated image analysis: considerations and opportunities in the practice of pathology. Veterinary Pathology. 51 (1), 211-223 (2014).
  8. Al-Janabi, S., Huisman, A., van Diest, P. J. Digital pathology: current status and future perspectives. Histopathology. 61 (1), 1-9 (2012).
  9. Bonomi, P. D., et al. Predictive biomarkers for response to EGFR-directed monoclonal antibodies for advanced squamous cell lung cancer. Annals of Oncology. 29 (8), 1701-1709 (2018).
  10. Villalobos, M., et al. ERCC1 assessment in upfront treatment with and without cisplatin-based chemotherapy in stage IIIB/IV non-squamous non-small cell. Medical Oncology. 35 (7), 106(2018).
  11. Griffin, J., Treanor, D. Digital pathology in clinical use: where are we now and what is holding us back? Histopathology. 70 (1), 134-145 (2017).
  12. Huisman, A., Looijen, A., van den Brink, S. M., van Diest, P. J. Creation of a fully digital pathology slide archive by high-volume tissue slide scanning. Human Pathology. 41 (5), 751-775 (2010).
  13. Gray, A., Wright, A., Jackson, P., Hale, M., Treanor, D. Quantification of histochemical stains using whole slide imaging: development of a method and demonstration of its usefulness in laboratory quality control. Journal of Clinical Pathology. 68 (3), 192-199 (2015).
  14. Hofman, F. M., Taylor, C. R. Immunohistochemistry. Current Protocols in Immunology. 103, Unit 21.4 (2013).
  15. Ramos-Vara, J. A. Principles and Methods of Immunohistochemistry. Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).
  16. Otali, D., Fredenburgh, J., Oelschlager, D. K., Grizzle, W. E. A standard tissue as a control for histochemical and immunohistochemical staining. Biotechnic & Histochemistry. 91 (5), 309-326 (2016).
  17. Clarke, E. L., Treanor, D. Colour in digital pathology: a review. Histopathology. 70 (2), 153-163 (2017).
  18. Potts, S. J. Digital pathology in drug discovery and development: multisite integration. Drug Discovery Today. 14 (19-20), 935-941 (2009).
  19. Tabata, K., et al. Whole-slide imaging at primary pathological diagnosis: Validation of whole-slide imaging-based primary pathological diagnosis at twelve Japanese academic institutes. Pathology International. 67 (11), 547-554 (2017).
  20. Saco, A., Bombi, J. A., Garcia, A., Ramírez, J., Ordi, J. Current Status of Whole-Slide Imaging in Education. Pathobiology. 83 (2-3), 79-88 (2016).
  21. Griffin, J., Treanor, D. Digital pathology in clinical use: where are we now and what is holding us back? Histopathology. 70 (1), 134-145 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

DABAPEZWINT

Похожие статьи