Скрининг Хлопковых Генотипов для Сопротивления Нематод Рениформ

Краткое содержание

Здесь представлен протокол для быстрого неразрушающего скрининга хлопковых генотипов на рениформную устойчивость нематод. Протокол включает в себя визуальное изучение корней нематод-инфицированных саженцев хлопка для определения реакции инфекции. Вегетативная съемка с каждого растения затем распространяется для восстановления растений для производства семян.

Аннотация

Быстрый неразрушающий reniform nematode (Rotylenchulus reniformis) протокол скрининга необходим для развития резистентного хлопка (Gossypium hirsutum) сортов для улучшения управления нематод. Большинство протоколов включают извлечение нематод вермиформа или яиц из корневой системы хлопка или почвы для заливки для определения плотности населения или скорости воспроизводства. Эти подходы, как правило, отнимают много времени с небольшим количеством оцениваемых генотипов. Здесь описан альтернативный подход, в котором корневая система визуально исследуется на нематодную инфекцию. Протокол включает в себя прививку саженцев хлопка через 7 дней после посадки с вермиформными нематодами и определение количества самок, прикрепленных к корневой системе через 28 дней после прививки. Данные выражаются как количество самок на грамм свежего корневого веса, чтобы приспособиться к изменению роста корней. Протокол предоставляет отличный метод оценки устойчивости хозяина-растения, связанного со способностью нематод установить место заражения; однако, сопротивление, которое препятствует репроизводству нематод не оценивается. Как и в других протоколах скрининга, вариации обычно наблюдаются при нематодной инфекции среди отдельных генотипов внутри и между экспериментами. Данные представлены для иллюстрации диапазона вариаций, наблюдаемых с помощью протокола. Чтобы приспособиться к этому изменению, в эксперименты включены контрольные генотипы. Тем не менее, протокол обеспечивает простой и быстрый метод оценки устойчивости хоста и растений. Протокол успешно используется для выявления устойчивых присоединений от G. сбор зародышевой плазмы и оценка сегрегации популяций более чем 300 особей для определения генетики резистентности. Был также разработан метод вегетативного распространения для восстановления растений для размножения резистентности. После удаления корневой системы для оценки нематод, вегетативная съемка пересаживается, чтобы позволить развитие новой корневой системы. Более 95% побегов обычно развивают новую корневую систему, растения достигают зрелости.

Введение

Ротиленчулус рениформис (Линфорд и Оливейра), обычно называют reniform нематод, является одним из основных паразитических видов нематод, присутствующих в почвах юго-восточной части Соединенных Штатов^1,2,3. Нематод является облик, сидячий полуэндопаразит, требующий принимающей завод для завершения своего жизненного цикла^2,4. Vermiform preadult женские нематоды проникают в корневую систему хозяина, чтобы установить место кормления в стеле^2,3. Как нематод питается и созревает, задняя часть, оставшаяся за пределами корня хозяина будет набухать на производство яиц, образуя характерную форму почек (Рисунок 1). Rotylenchulus reniformis способен питаться корневой системой более 300 видов растений, в том числе хлопка^4. Нагорный хлопок (Gossypium hirsutum L.) широко культивируется на юго-востоке Соединенных Штатов, но отсутствие R. резистентные сорта reniformis препятствуютуправлению нематодом 2,³. Стратегии управления, такие как обработка нематидов и вращение с непринимающими видами сельскохозяйственных культур, были использованы для уменьшения почвы R. reniformis плотность населения^5,6, но потери урожайности хлопка семян обычно может варьироваться от 1 до 5%². Симптомы R. reniformis инфекции может включать задержку роста растений, подавленный рост корней, дефицит питательных веществ, аборт ы плодоовощ, и задержка зрелости². Тем не менее, симптомы не могут быть очевидными из-за единообразия симптомов по всей области; поэтому подходы к оценке R. reniformis инфекции необходимы для выявления и разработки устойчивых горных сортов хлопка. Оценка R. резистентность reniformis в хлопке считается трудной 7, потому что зараженная корневая система может казаться нормальной, даже если растение может показать симптомы инфекции^8.

Эффективный протокол скрининга нематод необходим для идентификации R. reniformis устойчивые присоединения из хлопка зародышевой плазмы коллекции, а также для определения генетики сопротивления для этих присоединений. Такой протокол поможет в передаче генов сопротивления на горн-хлопку. Различные методы биоассажа были использованы для оценки R. reniformis инфекции в хлопке^{8,9,10,11,12,13,14,15}. В целом, для идентификации R. reniformis устойчивых хлопка генотипов. Наиболее часто используемый подход включает в себя извлечение яиц и/иливермиформных нематод из инфицированных растений или почвы 8,^11,12,14,15. Общая методология такого подхода включает в себя посадку семян для отдельных генотипов хлопка в отдельных горшках, что позволяет саженцы развиваться в течение 7 до 14 дней, прививки саженцы, добавив смесь vermiform этапов R. reniformis к почве, и позволяет нематод заразить корневую систему в течение 30 до 60 дней. Далее, vermiform нематод и / или яйца извлекаются из зараженной корневой системы каждого растения или из почвы заливки. Затем определяется количество извлеченных нематод или яиц для оценки плотности населения и скорости размножения, которые сравниваются с контрольными генотипами для выявления устойчивых генотипов.

Альтернативный подход, как описано здесь, включает в себя микроскопически изучения корневой системы хлопка, который был инфицирован нематод, чтобы определить количество женщин нематод паразитирующих корни^10,16. Как и другие подходы, хлопковые генотипы высаживаются в отдельные горшки и прививаются вермиформными нематодами примерно через 7 дней после посадки. В течение 30 дней после прививки корневая система удаляется из отдельных растений и почва промывается из корней. Далее, нематоды, прикрепленные к корневой системе,окрашены красным пищевым краситель17 , и корни микроскопически рассмотрены, чтобы определить количество инфекции сайтов с устойчивыми генотипами хлопка (определяется на основе количества нематод на грамм корня) по сравнению с восприимчивым контролем¹⁶. Преимущество этого второго подхода заключается в увеличении пропускной связи за счет сокращения количества дней, необходимых для оценки, и увеличения числа отдельных генотипов, оцениваемых в рамках одного эксперимента. Методологии скрининга, которые оценивают плотность населения или скорость воспроизводства, часто занимаютбольше времени, чем методы, основанные на визуальных наблюдениях признаков инфекции 7. Однако одним из ограничений этого подхода является то, что устойчивость к растениям, которая препятствует репроизводству нематод, как это определено производством яиц, не оценивается^13.

Протоколы скрининга для R. сопротивление reniformis часто разрушают корневую систему во время оценки⁷ и включают вегетативную съемку, отбрасываемую. Для преодоления этого ограничения был разработан метод вегетативного распространения, позволяющий восстанавливать растения для производства семян^18. После удаления корневой системы для оценки нематод, вегетативная съемка посажается в почву заливки, чтобы корневая система вырасти. Этот метод имеет широкие применения для большинства R. протоколы скрининга reniformis. Простой и быстрый метод вегетативного распространения имеет решающее значение для размножения R. reniformis устойчивых горных сортов хлопка, где восстановление потомства требуется для продвижения устойчивых генотипов для следующего поколения.

Представлен протокол для масштабного скрининга хлопковых генотипов на резиформную устойчивость нематод. Цель состоит в том, чтобы разработать простой и быстрый неразрушающий метод скрининга для оценки популяций хлопка для нематодной устойчивости, чтобы помочь в разведении устойчивых сортов хлопка на горней. Используя этот протокол, данные обычно получаются в течение 35 дней, при этом более 300 генотипов оцениваются в одном эксперименте. Данные представлены для устойчивых и восприимчивых генотипов, чтобы проиллюстрировать вариации обычно наблюдаются с помощью этих методов.

Протокол

1. Поддержание источника R. reniformis Инокулум

1. Заполните терракотовые глиняные горшки (15 см в диаметре, 13,5 см в высоту) паровой пастеризованной смесью из 1-часть песчаного суглинка и 2-частей песка. Завод восприимчивых помидоров (Solanum lycopersicon) разнообразие в каждом горшке и место горшки в стеклянной лавке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Другие восприимчивые сорта растений, такие как хлопок могут быть использованы вместо помидоров.
2. Прививать томатные растения с vermiform reniform нематод (см. шаг 3.3). Поддерживайте растения в стекольном доме при температуре около 28 градусов по Цельсию.

2. Посадка хлопка Генотипы для R. reniformis Оценка сопротивления

1. Подготовка почвы путем объединения 2-частей мелкого песка с 1-часть песчаного суглинка, собранного с поля.
2. Паровая пастеризация почвенной смеси, чтобы убедиться, что почва свободна от нематод и почвенных растительных патогенов.
3. Добавьте почвенную смесь в конические пластиковые горшки (4 см в диаметре, 21 см в высоту). Перед заполнением горшков, поместите шарик хлопка в нижней части горшка, чтобы предотвратить потерю почвы. Частично заполните горшки с почвой примерно на 2 см сверху.
4. Подготовьте пластиковый кол для каждого горшка, чтобы обозначить генотип, который будет посажен.
5. Завод семена хлопка генотипов, отобранных для оценки.
   1. Посадите одно семя в каждом горшке для оценки сегрегации популяций, в котором каждое семя представляет собой уникальный генотип.
   2. Для сортов хлопка или прорастания присоединения, завод от 2 до 3 семян в одной кастрюле, чтобы обеспечить прорастание по крайней мере одно растение с другими саженцами удалены из горшков до прививки нематод.
      Примечание: Кроме того, семена могут быть прорастают от 24 до 72 ч до посадки, чтобы свести к минимуму количество горшков с нежизнеспособными семенами.
6. Завод семена выбранных устойчивых и восприимчивых генотипов управления.
   Примечание: Генотипы управления реплицируются от 5 до 10 раз для оценки естественных изменений, присущих методологии скрининга.
7. Заполните горшки с дополнительной почвой, чтобы покрыть семена в каждом горшке.
8. Поместите горшки в камеру роста. Поддержание постоянной температуры 28 градусов по Цельсию, температура окружающего воздуха, для камеры роста. Обеспечить искусственное освещение со смесью флуоресцентных и ламп накаливания с 16 ч фотопериод.
9. Поместите излучатели воды в каждый горшок, и поливать горшки два раза в день с помощью автоматической системы полива. Отрегулируйте систему полива для подачи дополнительной воды по мере роста растения.

3. Нематод прививка хлопковых растений и подготовка корневых образцов

1. Извлеките vermiform reniform нематод поддерживается на восприимчивых томатных растений (см. шаг 1) с помощью элутриации¹⁹ и центробежной флотации²⁰ методологий за день до прививки. Храните извлеченные нематоды при 4 градусах Цельсия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Baermann воронка извлечения²¹ является альтернативным методом для добычи нематод.
2. Определить количество нематод, извлеченных путем подсчета количества нематод в 100 л подобразца и подготовить подвески 1000 нематод / мл в водопроводной воде для прививок.
3. Прививать саженцы хлопка 7 d после посадки с нематод подвески. Создайте небольшую депрессию в почве рядом с растением, и пипетка 1 мл рениформной нематодной подвески в депрессию.
4. Удалить растения из горшков 28 d после прививки для оценки нематод.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе, растения примерно 15 см в высоту с 4 до 6 полностью расширенные листья.
   1. Удалите большинство полностью расширенных листьев из растений с помощью ножниц до удаления растений из горшков.
   2. Чтобы удалить растения из горшков, сожмите горшок и сдвиньте почву в руку.
   3. Аккуратно удалите почву из корней, агитируя корневую систему в водопроводной воде в контейнере 10 л. Кратко промойте корневую систему в контейнере с чистой водопроводной водой.
   4. Удалите корневую систему с растения примерно на 1 см ниже линии почвы с помощью ножниц.
5. Поместите корневую систему в пластиковый, нестерильный, одноразовый контейнер для образцов, а также пластиковый кол из горшка, используемого для идентификации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько образцов обрабатываются перед переходом к шагу 3.7. Приступить к шагу 4 для вегетативного распространения растения стрелять.
6. Подготовьте 12,5% (v/v) раствор красного пищевого красителя¹⁷ в водопроводной воде, чтобы запятнать нематоды, прикрепленные к корневой системе.
7. Добавьте приблизительно 30 мл раствора красного пищевого краситель к корневому образцу в контейнере образца, чтобы полностью покрыть корневую систему.
8. Поместите контейнер образца в микроволновую печь и нагрейте образец корня до тех пор, пока раствор окрашивания не закипит. Удалите образец из микроволновой печи и дайте образцу остыть при комнатной температуре.
9. Декант красный пищевой окраски раствор из корневого образца и добавить около 100 мл водопроводной воды в контейнер образца для удаления избыточного пятна. Поместите крышку на контейнер образца и храните образец в холодильнике при 4 градусах Цельсия. Приступить к шагу 5 для оценки корневой инфекции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь, прежде чем приступить к шагу 5.

4. Вегетативное распространение для восстановления растений для производства семян

1. Поместите шарик из хлопка в нижней части конической пластиковой кастрюле (см. шаг 2.3) и частично заполнить горшок с торфяным мохом заливки средств массовой информации. Затем поместите вегетативную стрелять в кастрюлю и твердо добавить заливки средств массовой информации для заполнения горшок. Поместите новую маркированную пластиковую долю в каждый горшок, чтобы обозначить генотип хлопка.
2. Поместите лоток горшков в пластиковый контейнер (73,6 см длиной х 45,7 см шириной х 15,2 см высотой) с водой и кратко поливать растения, чтобы смочить горшок средств массовой информации. Поместите горшки в камеру роста с постоянной температурой 28 градусов по Цельсию с помощью фотопериода 16 ч. Добавьте дополнительную воду в пластиковый контейнер по мере необходимости для поддержания влажности почвы.
3. Пересадите растения в большие горшки для производства семян примерно через 30 д. Частично заполните 6 л пластикового горшка с помощью подсобных проемов (см. шаг 4.1), удалите растение из небольшого горшка, поместите растение в 6 L горшок, и твердо добавить горшок для заполнения горшка.
4. Поместите растения в стеклянный дом и добавить воду, чтобы смочить горшок средств массовой информации. Поддержание температуры в теплицах при температуре около 28 градусов по Цельсию (искусственное освещение не требуется).
   1. Вода растения вручную по мере необходимости примерно 30 г.
   2. Когда примерно 75% растений требуют ежедневного полива, водные растения ежедневно используют автоматическую систему полива. Отрегулируйте автоматическую систему полива на воду чаще, как это необходимо для роста растений.
   3. Добавьте примерно 10 г медленного удобрения к каждому горшку до начала цветочного начала.
5. Урожай растений в зрелости и обработки образцов семян хлопка для получения семян для дальнейшей оценки.
   1. Для сбора семян хлопка, удалить хлопок из открытых столбов на заводе вручную и поместить его в маркированный бумажный пакет. Семена крепятся к хлопковым волокнам, которые удаляются в следующих шагах.
   2. Удалите ворсволокна из образцов семян с помощью 10-пилового лабораторного джина.
   3. Удалите волокна пуха из образцов семян с помощью концентрированной серной кислоты. Нейтрализовать образцы семян в 15% (v/v) растворе карбоната натрия, промыть образцы водопроводной водой и высушить образцы в принудительной сушилке воздуха.
   4. Поместите образцы семян в маркированные конверты для хранения.

5. Оценка R. reniformis Корневая инфекция

1. Удалите образец корня из контейнера образца и подсчитайте количество женских нематод, прикрепленных к корневой системе, с помощью стереомикроскопа (увеличение 20X).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Только женские нематод рениформы способны заражать корни растений.
2. Поместите корневую систему на бумажные полотенца в течение примерно 10 минут, чтобы удалить избыток влаги. Взвесьте корневую систему, чтобы определить вес свежего корня.
3. Введите количество нематод и свежие данные о весе корней в программу электронной таблицы компьютера и вычислите количество самок на грамм корня.

Результаты

Rotylenchulus reniformis инфекции корневой системы для двух сортов представлена на рисунке 1. Относительно меньше женских нематод рениформспособных способны установить место кормления для устойчивого генотипа хлопка по сравнению с восприимчивым генотипом. Вариации в росте корней распространены между присоединениями, как показано на рисунке 2. Это изменение, измеряемое свежим корневым весом, также можно наблюдать между ра...

Обсуждение

Эффективный протокол скрининга необходим для 1) идентификации R. reniformis устойчивых хлопковых генотипов для того, чтобы оценить генетику сопротивления и 2) размножения устойчивых сортов. Большинство протоколов оценивают R. reniformis плотность населения или скорость воспроизводства путем извлечения нематод вермиформа или яйца из системы корней хлопка или заливки почвы^8,11,12,

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Рэй Лич Кону-тайнер	Stuewe and Sons Inc.	SC10U
Конус-тайнер поднос	Stuewe and Sons Inc.	RL98
Песок	различные
ватные шарики
пилоны 4 дюйма растительные этикетки (4 in L x 5/8 in W)	Pylon Platics	L-4-W	Принимается любая марка или поставщик.
Контейнеры для образцов на 4 унции	Fisher Scientific	16-320-731	Принимается любая марка или поставщик.
Красный пищевой краситель	McCormick & Co., Inc.
наконечники для пипеток объемом 1 мл	различные
контейнеры по 10 л	различные		недорогие ведра.
Горшки 6 л	Nursery Supplies Inc.	Poly-Tainer-Can No2A	Допустима любая марка или поставщик. Можно использовать горшки разных размеров
: Почвенная среда	Sun Gro Horticulture	Metro-Mix 360	Любая марка или поставщик приемлемы.
Удобрение	Everris NA Inc.	Osmocote Plus	Любой бренд или поставщик приемлемы.
Пластиковый контейнер (73,6 см Д x 45,7 см Ш x 15,2 см Г)	Rubbermaid	3O29	Допустим любой бренд или поставщик.