Роман объект признание и расположение объекта, поведенческое тестирование у мышей на бюджет

Summary

Здесь мы предоставляем протокол, который включает подробные инструкции для создания экономических расположения мышиных объекта и Роман объект признание поведенческого тестирования, включая дизайн, стоимость и строительство необходимого оборудования, а также выполнение тестирования поведенческих, сбора данных и анализа.

Abstract

Этологических соответствующих поведенческое тестирование является важнейшим компонентом любого исследования, которое использует мышь модели для изучения когнитивных эффектов различных физиологических и патологических изменений. Задачи расположения объекта (OLT) и Роман объект признание (Норт) являются две эффективные поведенческие задачи, обычно используется для выявления функции и относительного здоровья мозга конкретных регионов в памяти. Хотя оба этих испытаний использовать присущие предпочтение мышей за новизну выявить памяти для ранее сталкивались с объектов, OLT главным образом оценивает пространственного обучения, которая опирается на деятельность гиппокампа. Норт, напротив, оценивает непространственный обучения идентификации объекта, который опирается на несколько областей мозга. Обе эти задачи требуют тестирования открытое поле Арена, объекты с эквивалентной ценности для мышей, соответствующие экологические сигналы и запись видео оборудования и программного обеспечения. Коммерчески доступных систем, в то время, как это удобно, может быть дорогостоящим. Эта рукопись деталей простых и экономически эффективных метода для построения Аренас и настройка оборудования, необходимых для выполнения OLT и Норт. Кроме того рукопись описывает эффективного тестирования протокола, который включает в себя OLT и Норт и предоставляет типичные методы для сбора данных и анализа, а также представителя результаты. Успешное завершение этих испытаний может обеспечить ценную информацию в памяти функции различных систем модель мыши и оценки базовой нейронных регионов, которые поддерживают эти функции.

Introduction

Эффективное когнитивных тестов изолировать и оценить функцию нейронных регионов конкретных мозга путем изучения поведения в контролируемой среде¹. В организме человека конкретные задачи были разработаны для оценки эффективности целенаправленных мозга регионов, таких как Висконсин карта, Сортировка задач для префронтальной функции или парные associates обучения тест (Кембридж нейропсихологического тестирования автоматизированных батареи Кембриджский университет) для гиппокампа функция^2,3. Эти тесты предназначены для изучения функций мозга конкретных регионов в организме человека путем оценки поведения, которые в результате нейронной активности этих регионов. Конечная цель наиболее биомедицинских исследований является улучшение здоровья человека; Однако многие исследования функции мозга здоровья или болезни не могут выполняться этически с человека участников. Для исследований, которые не могут использовать человека участников мелкие грызуны, такие как мышей зачастую модель выбора. С помощью мыши модели позволяет для прямого контроля над экспериментальных манипуляций включая изменения экспрессии генов, индукции травмы или даже модуляции схемы активности через optogenetic методов. Поведенческое тестирование мышей, похож на человека тестирования, стремится оценить влияние экспериментальной переменных на функции мозга путем измерения поведения, которые полагаются на конкретных регионах.

Гиппокамп является необходимая структура для формирования памяти в⁴люди и грызунов. Говоря более конкретно гиппокамп играет важную роль в декларативных памяти с участием реляционных представлений, но не процедурный, которая опирается на моторные центры мозга⁴. Функция гиппокампа памяти был в центре внимания исследования во многих областях нейронауки, потому что это изысканно чувствительна к возмущений. Отрицательные возмущения, начиная от длительного стресса и старения приступы и инсульт, связаны с гиппокампа повреждения⁵. В отличие от позитивного вмешательства, такие как социальное взаимодействие, физической окружающей среды обогащения или упражнения, улучшить гиппокампа функции^6,,78. Грызун исследования с правильное тестирование гиппокампа памяти может выявить понимание молекулярных и клеточных медиаторов памяти, а также последствия различных экологических мероприятий на гиппокампа функции.

Грызунов были разработаны несколько тестов для изучения гиппокамп зависимых обучения и памяти^9,10,11. Они могут быть широко подразделяются на задачи, которые требуют стимул с эмоциональной валентности добиться изменения в поведении и задачи, которые привлекают на грызунов предпочтения расследовать новые стимулы¹¹. Например, контекстная страх кондиционирования, пары неприятный раздражитель (фут шок) с экологический контекст и потом памяти тесты для контекста, измеряя страх индуцированной замораживания поведение-^9,11. Лабиринт Морриса воды и ее сухой коллегой, Барнс лабиринт, использовать негативные внешние подкрепление для продвижения пространственного обучения^4,11. В каждом конкретном случае грызуны стремятся уйти от отрицательной ситуации, погружают в холодную воду или воздействию на ярко освещенной платформе, соответственно. Радиальный/консольный торцовочный лабиринт, напротив, полагается на положительное подкрепление, как животные используют природные пищевое поведение, в сочетании с пространственной памяти для извлечения мелких продовольственной награды^4,11. Эти задачи используются широко и дали фундаментальные знания о гиппокампа памяти. Однако отрицательных и положительных внешних подкрепления или страхом заставить стимулы как шок добавить эмоциональной составляющей в эти поведенческие тесты, которые в некоторых случаях может быть нежелательным. К примеру дорсальной и вентральной гиппокампах связаны с отдельными функциями, пространственной памяти против эмоционального регулирования, соответственно¹². Тесты, которые полагаются на эмоциональной реакции на стимулы не может точно отражать нарушения пространственной памяти если функции брюшной гиппокампа эмоционального регулирования также затронуты.

OLT-это простой и эффективный тест, который представляет собой меру пространственной памяти гиппокамп зависимых¹³. Задача опирается на встроенные предпочтение животного новизна без дополнительных внешних подкрепления и поэтому обычно можно избежать осложнений, связанных с дифференциальной эмоциональные реакции¹³. Настоящий Протокол для OLT представлена для мышей, но он эффективен также в крыс если размеры оборудования масштабируются надлежащим образом. Протокол состоит из акклиматизации мыши Арена открытым поле тестирование и затем позволяет ему расследовать 2 объектов связи с пространственными аллюзиями окружающей среды. Мышь затем удаляется от арены, и во время задержки (интервал между пробной или ITI), один из объектов перемещается. После ITI мыши вновь на арену и позволено свободно исследовать. В общем мыши предпочитают новизны, и если они помнят расположение объектов от их первоначального воздействия, они будут тратить больше времени расследование перемещенного объекта. Животные с гиппокампа поражения нарушениями пространственной контекстного обучения и следовательно продемонстрировать нет предпочтения для объектов в романе месте^14,15.

OLT может использоваться самостоятельно или в сочетании с дополнительным тест памяти, которая опирается на нейронной активности от нескольких областях мозга, Роман объект задачи распознавания (Норт). Норт идентичен OLT до этапа тестирования, когда один из объектов заменяется Роман объекта вместо переносится в новое местоположение. Как и в случае с OLT, мышей с хорошей памятью объектов спонтанно предпочитают расследование Роман объект. В отличие от объекта местоположение памяти, которая опирается на гиппокампа субстратов, объект признание памяти, как представляется, полагаться на различных регионов мозга и участие гиппокамп является нестабильной. Многие исследования доклад, что гиппокампа поражения или инактивации не влияет на роман объект предпочтение^10,13,16,17, в то время как другие найти противоположные^18,19. Однако это все еще часто используемых задач для оценки функции общей памяти в грызунов.

Протокола, представленные здесь очерчивает шаги в инициировании и осуществлении OLT и Норт, оба из которых используют тестирование открытое поле Арена. Коммерчески доступные поведенческих испытательное оборудование может быть непомерно, особенно для небольших лабораторий. Этот протокол включает в себя дизайн и простых шагов для построения Аренас доме при минимальных затратах и без специальных инструментов. Кроме того этот протокол детали идеально поведенческих тестирования области, включая размещение Аренас, контекстные подсказки и запись видео системы, которая закладывает основу для осуществления протоколов OLT и Норт. Представитель как успешных, так и недостатки исследований результаты, подчеркивая важность оптимизации все материалы и процедуры для каждого исследования.

Описание	Параметр	Количество
Часть A: акриловый лист - непрозрачный белый (0,635 см х 40 см х 40,64 см)	Маршрутизируемое края	2
Часть B: акриловый лист - непрозрачный белый (0,635 см х 40 см х 41,91 см)	Маршрутизируемое края	2
Часть C: акриловый лист - непрозрачный белый (0,635 см x 41.91 см x 41,91 см)	Маршрутизируемое края	1
Акрилик цемента (1 pt).	NA	1
16 калибровочных гипо аппликатор	NA	1
Сочетание площадь	NA	1
HD веб-камера	NA	1
Программное обеспечение захвата видео	NA	1
USB 2.0 Удлинительный кабель	NA	1
Кабель канал	NA	1

Таблица 1: Подробный список материалов и оборудования, необходимых для поведенческого тестирования.

Protocol

Следующий протокол был одобрен институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) в Огайо государственного университета (ОГУ).

1. строительство арены

1. Заказать материалы, изложенные в таблице 1: пять листов, акрил, акриловая цемента и 16 G гипо аппликатор.
2. Износ оборудования безопасности в соответствии с инструкциями производителя, которые могут включать глаз, кожи и другие виды защиты.
3. Удалите защитное бумажное покрытие с акриловые листы.
4. Сухой подходят все материалы для подтверждения, что размеры являются правильным (Рисунок 1A).
5. Соберите и загрузить шприц с акриловой цемента.
6. Совместите длинной внешней стене (часть B) с верхним краем базы (часть C) и убедитесь, что они перпендикулярны друг другу с помощью комбинации или машинист площади.
7. С помощью шприца, нанесите небольшой и устойчивый цемента непосредственно на углу двух соединяемых частей.
8. Держите две части (части B и C) в месте до тех пор, пока они изначально настроены (примерно 5 минут).
   Примечание: Как правило, они будут 80% закаленной в 24 часа, но Ассамблея может продолжаться после 5 мин.
9. Повторите шаги 1,5 – 1,7 с другими за пределами стены (часть B) в ту же базу.
10. Приложите две внутренние стены (часть A), один в то время, к основанию, используя шаги 1,5 – 1,7.
11. Кроме того, с помощью шприца применить небольшой и устойчивый шарик цемента непосредственно в углу, теперь формируется по внешней стене (часть B) и внутри стен (часть А).
12. Подержите эти куски в течение 5 мин.
13. После 24-48 ч перейдите к Настройка поведения среды тестирования.

2. Настройка поведения среды тестирования и оборудование

1. Место экологические сигналы (как описано в разделе обсуждение) напротив друг друга и с видом на аренах в области тестирования (рис. 1B).
2. Организовать четыре тестирования арены, в духе 2 на 2 на пол или крепкий стол на соответствующих расстояниях от подсказок и камеру, чтобы максимизировать визуальный ввод для мышей (рис. 1B).
3. Проверки видимости с помощью метр палки, подпер от каждого пола арены через стену к сигналы для подтверждения, что эти расстояния между Аренас и сигналы являются подходящими.
4. Определите длину оптимального оптического пути, которая позволяет видео документации всех четырех Аренас, регулируя высоту камеры или высоту таблицы. (Рис. 1B).
5. Подключите камеру к USB удлинитель.
6. С помощью кабеля дорожек качения, запустить кабель через потолок и вниз стены на компьютер под управлением видео захвата программного обеспечения.
7. Скройте компьютер за занавесом, который будет разделять мышей в области тестирования от исследователя (рис. 1 c).
8. Соберите 4 по крайней мере 3 различных объектов, которые находятся примерно в 2-5 см в длину и ширину и до 10 см в высоту для тестирования (рис. 1 d).

Рисунок 1: поведенческое тестирование подготовки. (A) открытое поле тестирование Арена Ассамблея с части A соответствует внутренней стены, часть B как наружной стены и часть C как база. Готовой Арена будет иметь два наружных стен (часть B), которые работают весь край основания и две внутренние стены (часть A), которые помещаются между наружных стен по краям смежные базы (часть C). Все стены будет лежать на верхней части основания. (B) представитель аранжировка аренах на 0,62 м высокий стол, 60 x 90 см экологические сигналы, огни и камеры для полигона, которая позволяет захват всех четырех аренах одновременно. (C) A занавес скрывает экспериментатор и компьютерной системы от мышей во время испытаний. Верхний свет на для целей принятия на этой фотографии, но во время тестирования, только торшеры на. Кроме того один из экологические сигналы был удален для этой фотографии области тестирования, но во время тестирования, это четвертый сигнал перед Аренас, сталкиваются с все черные cue за столом. (D) A представитель объекта (и линейки шкалы), подходит для OLT или Норт тестирования с мышами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

9. Проверьте эти объекты.
   1. Получить как минимум 8 мышей дикого секса, деформации и возрастной группы представитель экспериментальной мышей, которые будут использоваться (например, 6-9 week-old мужского и женского мышей C57Bl/6).
   2. Обработка всех мышей ежедневно в течение 1 мин в течение 3-5 дней до начала испытаний.
   3. Разделите мышей на группы по 4 и, если они не размещены уже поодиночке, переместить их в лицо, чистый Холдинг клетки.
   4. Принесите их в комнату, тестирования и позволяют им акклиматизироваться по крайней мере 30 минут.
      Примечание: Присутствие экспериментатора в комнате для этих 30 мин снизит нагрузку на мышей во время задачи, особенно если экспериментатор мужчины²⁰.
   5. После того, как делается адаптационного и экспериментатор готовы начать, начните запись видео.
   6. Место каждой мыши, Облицовка стен одного угла арены (так называемый выпуска угловой) (рис. 2A).
   7. Разрешить мышей, чтобы исследовать Аренас свободно в течение 10 мин.
   8. Остановите запись видео.
   9. Вернуть их чистый Холдинг клетки мышей в течение 20 мин.
   10. Очистить все арены с животных Фонда рекомендовал, очистки методы, такие как протирка с 70% этанола для сведения к минимуму обонятельные сигналы до следующего использования.
   11. С помощью двухсторонней ленты, аффикс 2 различных объектов вблизи 2-релиз углы, таким образом, что объекты сбалансирован на арене, и 6 x 6 см² от каждой стены этого угла (Рисунок 2Б).
   12. Начните запись видео.
   13. Место каждой мыши, Облицовка стен в углу выпуска.
   14. Разрешить мышей расследовать Арена и объекты свободно в течение 10 мин.
   15. Остановите запись видео.
   16. Место мыши обратно в их клетках чистый холдинг в течение 20 мин.
   17. Очистить все арены и объекты с животных Фонда рекомендовал очистки методы, такие как протирка с 70% этанола для сведения к минимуму обонятельные сигналы.
   18. Повторите учебных судебных разбирательств с 2 новых объектов, проставленный в тех же местах, до тех пор, пока все объекты (по крайней мере три различных объектов при проведении OLT и Норт) были протестированы с каждой мыши.
   19. Исключить объекты, которые позволяют мышей, чтобы сидеть на вершине объект.
   20. Анализировать время расследования каждого мыши с каждым объектом согласно шаг 4.
   21. Исключить объекты, которые имеют негативные или позитивные ценности.

3. проведение поведенческого тестирования

1. Одну неделю до начала испытаний: ознакомление лицам проводить поведенческие тесты
   1. Обработайте взрослых 6-9 week-old мышей женщины и мужчины C57Bl/6 ежедневно в течение 1 мин в течение 3-5 дней до начала испытаний.
2. День 1: привыкание сессий
   1. Разделите мышей на группы по 4 и, если они не размещены уже поодиночке, переместить их в лицо, чистый Холдинг клетки.
   2. Привести их зале испытаний и позволяют им акклиматизироваться к тестирования номер для по крайней мере 30 минут.
      Примечание: присутствие экспериментатора в комнате для этих 30 мин снизит нагрузку на мышей во время задачи, особенно если экспериментатор мужской²⁰.
3. После того, как делается адаптационного и экспериментатор готовы начать, начните запись видео.
4. Место каждой мыши на арене (один мышь на Арена) Облицовка стен выпуска угла (рис. 2A).
5. Разрешить мышей, чтобы исследовать Аренас свободно за 6 мин.
6. Остановите запись видео.
7. Вернуть их чистый Холдинг клетки мышей во время интервала между пробной (ИТИ).
8. Очистить все арены с животных Фонда рекомендовал, очистки методы, такие как протирка с 70% этанола для сведения к минимуму обонятельные сигналы.
9. Повторите шаги 3.3 – 3,9 два раза для в общей сложности 3 привыкания сессий для каждой мыши.
10. Возвращение всех мышей в их дома клетки.
11. Очистите все арены с животных Фонда рекомендовал очистка методы, такие как протирка с 70% этанола для сведения к минимуму обонятельные сигналы перед использованием следующий день.
12. День 2: учебные разбирательства, Олт, Норт
    Примечание: Норт является дополнительный тест.
    1. После 24 часов принести же группе мышей в тестирования комнату и позволяют им акклиматизироваться к тестирования номер для по крайней мере 30 мин, как это сделано до сессий привыкания в предыдущий день.
    2. Провести подготовку судебного разбирательства с помощью 2 объекты, помещенные на арене (Рисунок 2Б).
       1. С помощью двухсторонней ленты, аффикс объектов 6 x 6 см² от 2-релиз углы, таким образом, что они являются сбалансирован на арене.
       2. Начните запись видео.
       3. Место каждой мыши, Облицовка стен релиз угла, как это сделано в ходе сессий привыкания.
       4. Разрешить мышей расследовать Арена и объекты свободно в течение 10 мин.
       5. Остановите запись видео.
       6. Место мыши обратно в их клетках чистый Холдинг для ITI 20 мин.
       7. Очистить все арены и объекты с животных Фонда рекомендовал очистки методы, такие как протирка с 70% этанола для сведения к минимуму обонятельные сигналы.
    3. Выполните OLT.
       1. Переместить один из объектов, используемых в подготовке судебного разбирательства на новый угол не релиз и прикрепить объект 6 см от каждой стены этого угла с двухсторонней ленты (рис. 2 c).
          Примечание: Другой объект должен оставаться, где он был во время подготовки судебного разбирательства.
       2. Начните запись видео.
       3. Место каждой мыши, Облицовка стен в углу выпуска.
       4. Разрешить мышей расследовать объекты за 10 мин.
       5. Остановите запись видео.
       6. Место мыши обратно в их клетках чистый Холдинг для ITI 20 мин.
       7. Очистить все арены и объекты с животных Фонда рекомендовал очистки методы, такие как протирка с 70% этанола для сведения к минимуму обонятельные сигналы.
    4. Выполните Норт.
       1. Заменить объект, который не был перемещен во время OLT с объектом Роман и прикрепить объект Роман 6 см от двух стен углу с двухсторонней ленты (Рисунок 2D).
       2. Начните запись видео.
       3. Место каждой мыши, Облицовка стен в углу выпуска.
       4. Разрешить мышей расследовать объекты за 10 мин.
       5. Остановите запись видео.
       6. Место мышей обратно в свои дома клетках.
       7. Очистить все арены и объекты с животных Фонда рекомендовал очистки методы, такие как протирка с 70% этанола для сведения к минимуму обонятельные сигналы до следующего использования.

Рисунок 2: Арена конфигурации для судебных разбирательств. (A) полевых испытаний Арена без объектов для привыкания сессии. Черная стрелка указывает угол выхода. Этот угол должен быть же относительное расположение каждой арене и последовательно для каждой мыши проходит испытания и для каждого судебного разбирательства. (B) для подготовки судебного разбирательства, два различных объектов закреплены на открытом поле в 6 x 6 см от их соответствующих стены. (C) для Олт, один объект перемещается на новое место, также 6 x 6 см от стен и не релиз углу. (D) для Норт, объект, который был стационарные в OLT заменяется Роман объекта, а перемещенный объект из OLT является теперь знакомые. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

4. анализ поведенческих тестовых данных

Примечание: Анализ видео в идеале должен быть завершен, по крайней мере двух независимых, ослепленный экспериментаторов.

1. Откройте видео файл.
2. Примените прозрачный круг, предоставляющий границы 2 см вокруг каждого объекта на экране, чтобы помочь определить активного расследования. Используйте видео файл изображения с правителем, помещены в арену для калибровки этой сетки.
3. Наблюдать поведение мыши и записывать время мышь активно изучает объект, который состоит из его носа, указал на объект на расстоянии 2 см от этого объекта.
   1. Запись отметку времени мышь начинает расследовать объекта и штамп времени, когда он останавливается, расследование этого объекта.
   2. Повторите это для обоих объектов на арене в течение всего судебного разбирательства.
   3. Рассчитайте совокупное время мыши расследование каждого объекта путем вычитания время начала, время от времени остановки для каждого экземпляра объекта расследования и добавить все эти значения.
4. Рассчитайте процент времени всего расследования или дискриминации индекса со следующими формулами:
   1. Расчет процентов всего расследования времени =
      
      Примечание: Значение выше 50% показывает больше расследования Роман места или объекта.
   2. Рассчитать индекс дискриминации =
      
      Примечание: Положительное значение означает больше времени расследование Роман объект. Нулевой индекс дискриминации означает, равное время, проведенное с обоих объектов.
5. Графически представлять результаты и полный статистический анализ с использованием t теста или дисперсионного анализа в зависимости от количество сравниваемых групп.

Results

На рисунке 3 приведены примеры типичных положительные и отрицательные результаты, полученные с мужского и женского пола взрослых мышей C57Bl/6, используя этот протокол⁶. Интерпретация данных OLT и Норт всегда применяется к статистические данные группы (см. обсуждение ниже). Исследование времени для одной мыши не может толковаться как памяти или нехватка памяти. Однако работы группы мышей (т.е., несколько образцов) можно сравнить с другими группами или фиксированной шансы уровни с помощью статистических испытаний. Во время типичного учебные разбирательства группы мышей не показывают значительное предпочтение в среднем для любой из объектов как они оба одинаково Роман и не имеют каких-либо неразрывно отрицательное или положительное значение для мышей (Рисунок 3А и 3Б). Если статистические данные группы мышей показывают значительное предпочтение одного объекта над другим во время обучения, эти объекты не должны использоваться в потому что присущие предпочтение/страх будет смешивать результаты в последующих судебных разбирательств. Кроме того, время полного расследования всех мышей должны соответствовать минимальным стандартам (традиционно набора на 20 секунд²¹) и следует сравнить с убедитесь, что нет базовых разницы в расследования, которые могут повлиять на последующие тесты памяти.

Во время OLT память для расположения объекта отражается мышей, в среднем они тратят значительно больше, чем 50% от времени всего расследования с перемещенного объекта (рис. 3A). Если время всего расследования отдельных мышей различаются, результаты лучше изображается как дискриминации индекс для объектов (рис. 3B). Значительное увеличение индекса средней дискриминации в рисунке 3B указывает, что мыши больше времени с объекта после того, как она переехала. Ли измеряется увеличением процент времени или дискриминации индекс, увеличение исследование объекта после его перемещения предполагает, что мышей запомнить, где объект находился в процессе обучения.

Последний судебный процесс настоящего Протокола оценивает объект признание памяти. Пример с одной группе мышей демонстрирует высокий средний процент времени расследования (рис. 3 c) а также позитивной дискриминации индекс (рис. 3D) по сравнению с фиксированной управления значения 50% и 0, соответственно. Как с OLT данными, если есть существенные различия в общее расследование время между отдельными мышей, индекс дискриминации является вероятно метод лучше для визуализации данных. 3E рисунке показан пример сравнения 2-группа в Норт и некоторые из статистической осложнений, которые могут возникнуть в ходе этих испытаний (см. обсуждение). В то время как один t тест для группы B показывает расследование значительно выше 50%, то же тест, Группа не. Этот вывод не означает, что A и B отличаются друг от друга. Чтобы определить группу различия, должны выполняться отдельные двух непараметрические Манна-Уитни тест сравнение групп B в A. Двухвыборочный непараметрический тест Манна-Уитни этой представительной группы данных показывает никакого существенного различия (p = 0,66) между двумя группами в процентах от времени расследования новых объектов.

OLT и Норт очень чувствительны к внутренней стоимости объектов и тщательное тестирование объекта эквивалентности необходима для того, что есть нет встроенных предвзятости, что может сбить с толку результаты. Рисунок 3F и 3 G показывают пример неправильного объекта выделения. В пилотного тестирования образца размером 4 мышей показало тенденцию к тратить меньше, чем 50% времени расследования с объектом при паре против объект B (Рисунок 3F). Когда эти объекты были затем использованы в Норт с объектом A как Роман объект и больше размер выборки 16, мышей провел значительно меньше, чем 50% времени расследования с объектом A (рис. 3 g). Это отвращение к объекту Роман легко узнаваемые здесь как технический изъян в эксперименте и иллюстрирует почему пилотного тестирования объектов для присущих предпочтение/отвращение имеет важное значение.

Рисунок 3: поведенческие данные тестирования с дикого типа взрослых мышей C57Bl/6. (A) сравнение процента всего расследования время перемещения объекта в ходе подготовки судебного разбирательства против OLT показывает значительное увеличение расследования, после перемещения объекта. p < 0,0001, парный t тест. (B) представитель результаты расследования перемещенного объекта во время обучения и испытания Олт, отображается как индекс дискриминации также свидетельствуют о значительном увеличении в исследование объекта после его перемещения. p < 0,0001, парный t тест. (C) процент всего расследования время Роман объекта в Норт показывает значительное предпочтение для изучения новых объектов. ** p = 0,0024, один образец t тест против. 50%. (D) представитель результаты для Роман объект расследования в Норт, отображается как индекс дискриминации аналогично отдают предпочтение для изучения новых объектов. ** p = 0,0024, один образец t тест против 0. (E) представитель результаты анализа Норт, с участием двух различных групп мышей. Группа B значительно отличается от 50% на один t тест (** p = 0,0024), но не группа A (p = 0.5837). В отдельный анализ, для сравнения групп, двухвыборочный тест Манна-Уитни используется из-за неравномерного группы размеров и найдена статистически значимого различия в расследовании (p = 0,66, ns). (F) процент времени с объектом во время проверки испытаний в небольшой размер выборки показывает тенденцию к отвращение к объекту. p = 0.2159, один образец t теста. (G) с большим размером выборки и объект из (F) используется в качестве объекта роман в Норт, обнаруживается значительное отвращение к объекту, даже если это новый объект. * p = 0.0270, один образец t теста. Это пример технического сбоя в выделенных объектов. Данные представлены как средний ± SEM. данных из панелей, C-E взяты из предыдущей публикации⁶. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Этот протокол обеспечивает эффективный метод для проведения расположения объекта и Роман объект признание поведенческое тестирование у мышей. Эти тесты позволяют оценку гиппокампа функции, а также функции других корковых регионов, таких как префронтальной коры, участвующих в объект признание¹⁰. OLT и Норт имеют преимущество избежания раздражителей с сильным эмоциональным валентности, которые требуются для Моррис воды лабиринт, контекстная страх кондиционирования, Барнс лабиринт или Радиальный/консольный торцовочный лабиринт. Они также избежать необходимости лишения пищи в качестве необходимых для Радиальный/консольный торцовочный лабиринт. Кроме того этот протокол описывает простой процедуры тестирования два дня, которая не требует большой или сложной оборудования для выполнения или анализа. Один недостаток этих задач является, что они не предусматривают мер обучения или приобретения. Разница в новизна исследования может быть вызвано беднее изучение объектов во время обучения, бедных памяти за то, что узнал или оба. Общее время, затраченное расследование объектов является важной мерой для решения любых присущи различия в разведке диск, но не является мерой обучения. Если меры обучения имеют важное значение для экспериментальной вопрос, воды лабиринт, Барнс лабиринт, или Радиальный/консольный торцовочный лабиринт, вероятно, будет предпочтительнее.

Пользовательские здание поведенческих Аренас имеет потенциал, чтобы спасти сотни долларов и привести объект тестирования в пределах финансовых досягаемости широкий спектр лабораторий. Этот протокол устраняет множество препятствий и упрощает процесс изготовления сделать более доступным для ученых, без специализированной подготовки строительства собственных арены в акрил. Важно отметить, что покупка Цветные акриловые листы, которые будут контрастируют с мышей, таких как белый акрил для черный мышей и черная акриловые для белых мышей, облегчит сбор данных и анализ, особенно при использовании коммерчески доступных программное обеспечение для анализа. Заказ, вырезать по размеру листов с «перенаправленного края» устраняет необходимость для таблицы увидел (Таблица 1), и использование акрилового цемента удаляет необходимость бурения и зенковки отверстия. Завинчивание крепеж, сверление и резка акрила часто вызывает перерыв, чип и трещины из-за его хрупкий характер. Потому что цемент растворителя, он будет поступать в соединяемых районе, растворяя и смягчения любых акриловых он сталкивается. Таким образом она не применялось к каждой части отдельно как если бы это был традиционный клея. В отличие от клея цемент не будет заполнить негативных пространства или поверхностях. Это основная причина заказать «маршрутизируемых края», как это обеспечит гладкая и плоская края, создание гораздо лучше Бонд. Когда цемента высыхает, он будет слились две акриловые листы в один кусок в процессе, называемом «растворителя сварка». Как сварки металлов, готового продукта является цельного куска, но сварные области всегда будет оставаться слабым местоположение. Таким образом после того, как арены используются, следует избегать прямого воздействия или крайнего стресса в эти моменты.

Этот протокол также показывает, как настроить 4 арен для одновременного тестирования до 4 мышей (рис. 1 и рис. 2). Непрозрачные стены арены предотвратить мышей видеть друг друга во время тестирования, но все еще существует возможность того, что наличие других мышей в зале вызывает запах или шум отвлекает, которые могут повлиять на результаты тестирования. Привыкания испытания как подробную здесь может помочь смягчить эту проблему, как мышей подвергаются воздействию многих животных комнатных условий перед поведенческое тестирование. Однако если отвлекаться от других мышей или экспериментатор шум, связанный с обработкой других мышей сильную озабоченность, одна арена с одной мыши могут использоваться, а также, хотя это увеличит время, необходимое для завершения OLT и Северный с несколько мышей. Более чем 4 арены теоретически могли бы быть использованы также, но большинство камер не имеют достаточно широкое поле зрения чтобы показать, что многие аренах с хорошим разрешением.

Размеры и расстояния при условии, что здесь находятся общие руководящие принципы для мыши поведенческого тестирования в типичном зале тестирования, 16 x 16 x 16 м³ в измерениях (рис. 1B и 1 C). Настроить соответствующие экологические сигналы, арены и запись видео оборудования должны быть оптимизированы для каждой среды. Подсказки могут состоять из крупных форм или шаблонов (обычно в черный и белый), которые позволяют мышей пространственно ориентироваться во время OLT. Вместо размещения подсказки в разных местах друг напротив друга, подсказки также могут быть установлены на стенах области тестирования. Этот протокол рекомендует разделить тестирования комнате занавес, чтобы скрыть исследователь и компьютер в ходе поведенческого тестирования. Во время всех привыкания, интервалы между судебной и активных процессов исследователи должны закрыть занавес, чтобы отделить себя от зоны контроля. Если это не практический, компьютер может оставаться с учетом мышей, но исследователь должны перейти из поля зрения во время задачи. Если исследователь, мышей может попытаться полагаться на ей или ему как пространственные биток.

Все поведенческого тестирования должен быть завершен в условиях температуры и влажности с тусклым, но даже освещение на около 310 lux и минимальным посторонних звука или сильной экологической запах подсказки, например духи на экспериментаторов. Между каждый день судебного разбирательства и тестирования все арены и объекты должны быть очищены с животных фонда, Рекомендуемые методы стерилизации как протирка с 70% этанол или без запаха отбеливатель салфетки для сведения к минимуму обонятельные сигналы. Если используются химические Дезинфектанты, окончательное полоскание с 70% этанол рекомендуется, потому что многие химических дезинфицирующих средств может быть раздражающим для животных ноги.  Как с любой поведенческих задач, обработка мышей на несколько дней, прежде чем тестирование нужно ознакомить их с лицами, которые будут выполнять OLT и Норт и уменьшить стресс во время тестирования^20,22. Как мышей может испытывать острый стресс из-за незнакомых людей вблизи полигона, рекомендуется также, что все поведенческого тестирования должна быть завершена к же лицо. Тестирование параметров и условий, подробно изложены в настоящем протоколе были оптимизированы для 6-9 week-old взрослых мышей C57Bl/6 и будет наиболее полезной в выявлении нарушениями памяти из-за травмы в этой возрастной группе или нарушениями памяти из-за возраста сам в старых мышей. Если цель состоит в том, чтобы проверить для улучшения памяти в молодых мышей, больше ITI, начиная от 1 часа до 1 суток было бы более уместно избежать воздействия потолка на производительность в легче версии ITI 20 мин. Действительно ИТИС может варьироваться от 5 мин (для немедленного отозвания) до нескольких часов или дней (для удаленного воспоминания), в зависимости от конкретных потребностей эксперимент и штаммов и возрастов мышей. Важно отметить, что независимо от длины, все ИТИС должно быть согласовано между сессиями в эксперименте. Как различных штаммов и возрастов мышей демонстрируют различия в поведении и обучения, сроки для каждого судебного разбирательства и интервал, тестирование области договоренности, и используемые объекты могут быть изменены согласно конкретного штамма мышей, их возраст и конкретный ущерб / болезнь/вмешательство модель тестируется^9,21,23,25.

В то время как гиппокампа зависимость функции пространственной памяти испытания в OLT устоявшихся, Норт может или не может полагаться на гиппокамп. Интерпретация данных из Норт следует принять этот нюанс учетной записи. Определение переменных для ли участие гиппокампа, в объект признание памяти не согласованы еще, но могут включать ITI длины или значимости пространственными аллюзиями¹⁸. Примечательно представленные протокол использует пространственное OLT до Норт, который может исказить мышей к использованию гиппокампа процессов в Норт. Таким образом важно отметить, что порядок может быть отменено, или каждая задача может выполняться самостоятельно, в зависимости от экспериментаторов вопросы и потребности.

Выбор объектов является важнейшим аспектом OLT и Норт-^22,24. Идеальные объекты являются достаточно тяжелый, чтобы не быть легко перемещены с помощью мыши и изготовлены из материала, как стекло или металла, что мышь не может повредить, жевания или царапин. Деревянные, пены, или мягкие пластиковые объекты не подходят как они легко деформируются и трудно держать запаха. Кроме того объекты, используемые в исследованиях должны быть относительно аналогичных по размеру, текстура, запах и материала. Рисунок 1 d дает пример соответствующего объекта, который может быть использован. Это оранжевый пластиковая фигурка цыпленок с песком, чтобы придать ему достаточно веса и опечатаны для предотвращения утечки чистящих реагентов или другие агенты, вызывающие запах. Из-за формы верхней мышей способны подняться на верхней части или сидеть на этот объект. OLT или Норт этот объект лучше всего в паре с другим объектом аналогичного размера, веса, материала, цвета и сложности, как аналогичные пластиковая фигурка кролика. Чтобы убедиться, что объект расследования действительно отражает предпочтение новизны, все объекты должны быть проверены для эквивалентной ценности с минимум 8 мышей в том же напрягаться, пола и возраста экспериментальной группы как описано в разделе 2.9 Протокола. Кроме того объекты следует рандомизированных в терминах, которые объекта является объект роман или перемещении между мышей в том же исследовании для дальнейшего обеспечения что своиственные характеристики объектов не влияют на предпочтения. Размещение объекта может также сильно повлиять на успех или провал OLT и Норт. Объекты должны быть уравновешенным в аренах и не быть слишком близко к стенам. Угол, переполненном объектом является привлекательным местом для мышей, чтобы скрыть, и это будет смешивать меры расследования.

Важной предпосылкой для сбора данных является определение «активного расследования», которая, когда мышь участвует объект с его носом указал на объект от не более 2 см. Мышь двигаться над верхней части объекта или глядя мимо объекта не квалифицируются как активного расследования. Кроме того поскольку OLT и Норт зависят от мыши, вспоминая пространственного расположения или фактические особенности объекта, должны быть достаточно изучения этих во время подготовки судебных разбирательств. Таким образом исследователь должен определить время минимальный расследования и исключить любые предметы, которые не отвечают, что базовый уровень расследования, традиционно устанавливается на 20 секунд²¹.

Количественная оценка объектов расследования время может осуществляться различными способами, с или без дорогих анализа программного обеспечения. Если используется ручная биговка, как описано здесь, наиболее полный сбор данных может быть достиган записи отметки времени на видео, когда мышь изучает объект. Запись времени начала и остановки объектом расследования в ходе трех отдельных испытаний создает постоянный журнал объективное время марок и облегчает точное Вычисление вручную данных в отличие от альтернативных методов, например с помощью секундомер для аддитивно Запишите общее время мышь исследует каждый объект.

Коммерческие пакеты программного обеспечения также доступны для озвучивания объект расследования. Коммерчески доступное программное обеспечение может обеспечить большой объем данных за руку, озвучивание данных, описанных здесь, включая общее расстояние ездил, количество времени, проведенное в некоторых областях арены и скорость движения^16,23. Программное обеспечение, однажды правильно откалиброван и подтвердил надежно обнаружить объект расследования, могут также принести данные гораздо быстрее, чем ручная биговка. Это быстрее данных доходности в долгосрочной перспективе, может доходность чистая экономия по сравнению с человека часов, необходимых для ручная биговка. Однако большинство пакетов программного обеспечения для анализа поведения имеют высокие начальные расходы, которые могут быть непосильными для многих лабораторий и ручная биговка часто может быть достигнуто путем студент исследователей, делая почасовые затраты поведенческого скоринга минимальным. Коммерческое программное обеспечение также часто приходит с ограничениями на сколько пользователи могут получить доступ программного обеспечения одновременно, ограничение пропускной способности и времени сбережения данных. Хотя есть много преимуществ для этих пакетов программного обеспечения, они не являются необходимыми для сбора важной информации время расследования объекты из OLT и Норт. Возможность вручную приобретать эти данные делает Роман объект задачи более финансово доступным для более широкого круга исследователей.

Дополнительной функцией настоящего Протокола является, что первая сессия привыкание это по существу разбирательства в открытом поле, которое может принести данные о деятельности и уровень тревоги. Уровни активности могут быть количественно с помощью всего расстояния или средняя скорость, если отслеживание программного обеспечения доступен. Аналогичным образом с отслеживания программного обеспечения, меры тревоги могут быть получены от времени провел в центре арены или расстояния в центре. Эти данные могут также приобретаться вручную путем наложения видео Арена с сеткой и количественного определения пересечений. Это открытое поле данные могут помочь исключать валового мотор дефицита или чрезмерного беспокойства, которые могли бы помешать объект расследования позже.

Статистические тесты, используемые в настоящем Протоколе, представитель традиционных методов анализа. При сравнении 2 группы мышей, два образца, двустороннее t теста рекомендуется проверить значимость разницы в процент времени расследование объект перемещенный или роман между группами. Если размеры выборки распределяются неравномерно, имеют исключительно высокой изменчивости, или показать неравномерным изменчивость между группами, непараметрический тест рекомендуется вместо, как многие из основных посылок, t-теста будут нарушены в этих условиях. При сравнении 3 или более групп мышей, ANOVAs, рекомендуется проверить, имеет ли группа значительное влияние на процент времени расследование перемещенный или Роман объект. Исправлена ошибка пост hoc тесты, такие как Тьюки тест или исправлены Бонферрони попарных сравнений, затем могут применяться для проверки разница во времени процент расследования между каждой парой групп. С OLT дополнительный способ анализа данных — для проверки существенных изменений в процент времени расследование перемещенный объект от подготовки OLT испытания. С только одной группе мышей, этот тест будет принимать форму парных, двустороннее t тест, тестирование на значительные изменения в процент времени с перемещенного объекта от обучения в OLT в каждой мыши (имея в виду, что эти парные анализы и не независимой измерения, поскольку каждая мышь дает две точки данных). С двумя группами мышей, неоднократные меры, которые будут использоваться двусторонний ANOVA, с повторные измерения время судебного разбирательства (подготовка против OLT) и назначение группы, будучи вторым фактором. Пост hoc тесты для различия между группами лечения следует сравнить группы друг с другом в рамках судебных разбирательств.

В качестве альтернативы если доказательства памяти в OLT или Норт является все, что в настоящее время проверяется, может использоваться один образец t тест процент времени расследование объект против фиксированное значение 50%. Процент времени, значительно выше, чем 50% предлагает память для объекта. Процент времени значительно ниже 50% предлагает отвращение (по некоторым причинам), и выбор объекта должны быть пересмотрены. Однако один t тест не может выявить, отличаются ли две или более группы друг от друга. Например, в эксперименте с двумя группами мышей, если группа A провела 60% времени с новым объектом для p = 0,049 на один-t тест сравнения до 50% и Группа B только провел 59% из времени с новым объектом для p = 0,051 , Группа значительно отличается от 50% (а не группы B). Однако это ошибочно заключить, что эти две группы значительно отличаются друг от друга. Двухвыборочный t тест сравнение A и B можно легко выявить, что эти две группы статистически неотличимы. Если конечной целью является для сравнения производительности памяти двух или более групп, эти группы должны быть статистически по сравнению друг с другом, не только по сравнению с внешним стандартом. Аналогичные руководства применяется для сравнения времени с перемещенного объекта между профессиональной подготовкой и OLT. В этом случае найти значительная разница в процентах времени с перемещенного объекта между профессиональной подготовкой и Олт, в одной группе, а не в другой не показывают, что эти группы статистически отличаются. Группы должны быть пост hoc по сравнению друг против друга в течение каждого судебного разбирательства, не только через испытания в пределах группы.

Важно иметь в виду, что время расследование любых индивидуальных мышь не может использоваться в качестве доказательства за или против памяти. Скорее память для объекта местоположение или личность в выполнении этих задач можно заключить только основаны на статистических данных, которые статистически по сравнению с другой группы статистических данных или фиксированной шансы уровней (50% на время, 0 для дискриминации соотношение). Размер выборки необходимо будет сильно зависеть Размер эффекта особое манипуляции и изменчивости в поведении, оба из которых в свою очередь будет зависеть от используемого мышей. Возраст, пол и манипуляций все воздействия изменчивости. В примере данные, представленные в рисунке 3а и 3Б, n = 14 предметов были использованы, давая эффект размер 0,68 и мощь 0,65 для парных t тест с α = 0,05. Если мощность 0,8 были для этого сравнения, размер выборки 18 потребуется.

Эта дискуссия строится вокруг p значения и значение предохранители потому что эти меры и анализ наиболее обычно сообщили OLT и Норт данных и поэтому вероятно знакомы экспериментаторов и рецензентов. Эта зависимость p значения была подвергнута резкой критике как статистически недействительными²⁶. Однако хотя методы альтернативного анализа существуют и утверждаются в некоторых журналах²⁷, ни были широко приняты биомедицинских и поведенческих поля как стандартные²⁶.

Таким образом этот протокол испытаний эффективно памяти у мышей при минимальных затратах. Для обеспечения успешного осуществления с любой небольшой грызун модели включены рекомендации для соответствующих изменений к протоколу. Применение настоящего протокола к конкретным травм или терапевтического вмешательства модели можно выявить ценные функциональной релевантности, который дополняет изучаются механизмы клеточной и молекулярной.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Знак белый - 9% полупрозрачный и непрозрачный цветной литой акрил (Chemcast)	TAP Plastics	NA	1/4" x 15,75" x 15,75" с фрезерованными краями
Знак белый - 9% полупрозрачный и непрозрачный цветной литой акрил (Chemcast)	TAP Plastics	NA	1/4" x 15,75" x 16,5" с фрезерованными краями
Знак белый - 9% полупрозрачный и непрозрачный цветной литой акрил (Chemcast)	TAP Plastics	NA	1/4" x 16,5" x 16,5" с фрезерованными краями
TAP Акриловый цемент (1 pt.)	TAP Plastics	NA
16 G Гипо Аппликатор	TAP Plastics	NA
Дебют Программное обеспечение для захвата видео Pro Edition	NCH Software	NA
Stanely SAE/метрическая гребенка Square	Grainger	6R171
Logitech Pro Stream Webcam C922x	CDW	4429927
Belkin 16' USB 2.0 Активный удлинительный кабель	CDW
Panduit Pan-Way LD Surface Pulsway (8')	CDW	300902
Пространственные/Экологические подсказки	Переменные	NA
Объекты для тестирования	Variable	NA
70% этанол	Variable	NA
Двусторонняя лента	Variable	NA