Method Article

Структура решения Cerulean флуоресцентный белок, используя MeshAndCollect

DOI:

10.3791/58594

⸱

March 19th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1European Synchrotron Radiation Facility, Structural Biology Group, 2European Molecular Biology Laboratory, 3Univ. Grenoble Alpes, CNRS, CEA, IBS (Institut de Biologie Structurale)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем использование протокола MeshAndCollect, чтобы получить набор данных полный дифракции, для использования в определении последующих структуры, состоящий из частичного дифракции наборов данных, собранных от многих мелких кристаллов флуоресцентный белок Cerulean.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рентгеноструктурного анализа является основной метод, используемый для получения высокого разрешения информацию о 3-мерной структуры биологических макромолекул. До недавнего времени, одним из основных требований было наличие относительно большой, хорошо Дифрагирующая кристаллы, которые зачастую сложно получить. Однако появление серийный кристаллографии и возрождения в методах сбора данных несколькими кристально означает, что наличие крупных кристаллов больше не нужно быть ограничивающим фактором. Здесь мы иллюстрируют использование автоматизированных MeshAndCollect протокол, который сначала определяет позиции многих мелких кристаллов, установлен на том же держатель образца, а затем направляет коллекции из кристаллов из ряда частичных дифракции наборов данных для последующего слияния и использование в определении структуры. MeshAndCollect может применяться к любому типу микро кристаллы, даже если слабо Дифрагирующая. В качестве примера мы представляем здесь использование техники для решения Кристаллическая структура Лазурный голубой флуоресцентный белок (СПФ).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Макромолекулярной кристаллографии рентгеновского снимка (MX) является, безусловно, наиболее используемый метод для получения атомной резолюции проницательность в трехмерной структуры биологических макромолекул. Однако основных узких мест является требованием для относительно большой, хорошо Дифрагирующая кристаллов.

Часто и особенно при кристаллизации мембранных белков, только очень маленькие кристаллы несколько микрон в крупнейших измерения могут быть получены. Излучения ущерб, который эффекты предел разрешение полного дифракции данных набора, могут быть собраны из монокристаллов микро2и очень часто, это необходимо улучшить соотношение сигнал-шум и следовательно данные резолюции, путем слияния нескольких частичные дифракции наборы данных из разных, но изоморфных кристаллов. Увеличение плотности потока рентгеновских лучей на источники синхротронного и в других местах (например свободных электронах рентгеновские лазеры (X-Фельс)), означает, что наборы данных полезно частичное дифракции может быть собрана из даже очень маленькие кристаллы биологических макромолекул. Это, в свою очередь, привело к разработке новых методов для сбора и объединения частичных дифракции наборов данных собранных из многих различных кристаллов для того чтобы произвести полный набор данных для структуры решения. Такие методы часто называются серийный кристаллографии (SX)3,4,5,6,,78. Прототипом примером SX является использование устройств инжектор ввести узкий поток пульпы кристалл в рентгеновского луча3,4,5. Дифракционный рисунок регистрируется каждый раз, когда кристалл подвергается рентгеновских лучей, ведущих к коллекции, из многих тысяч отдельных кристаллов, «еще» дифракционного изображения, информация, которая затем объединяются для получения полного набора данных. Однако значительный недостаток этого типа коллекции последовательных данных является, что обработка неподвижных изображений может быть проблематичным. Значительно улучшено качество данных Если кристаллы можно вращать и/или несколько дифракции изображений собраны из же кристалл во время последовательного кристаллографии эксперименты6.

MeshAndCollect1 был разработан с целью объединения SX с «стандарт» MX вращение сбора данных и позволяет, в автоматической моды, экспериментаторов собирать наборы данных частично дифракции от многочисленных кристаллы же макромолекулярных целевого монтируется на одинаковые или разные держатели. Затем набор данных полный дифракции получается путем слияния наиболее Изоморфное частичных наборов данных, собранных. MeshAndCollect совместим с рентгеновское излучение любой-искусство синхротронного MX для (идеально объекта вставки устройства с относительно небольшим (20 мкм или менее) пучка размер позиции образца). Помимо компиляции полные наборы данных из ряда небольших, хорошо Дифрагирующая кристаллов метод также очень подходит для первоначальной экспериментальной оценки дифракционного качества микро-кристаллов и для обработки непрозрачными образцами, например, в мезо выросли микрокристаллов мембранных белков9.

В начале эксперимента MeshAndCollect позиции, в двух измерениях, каждого из многих кристалла, содержащихся в держатель единого образца определяется с помощью низкой дозы рентгеновского сканирования. Дифракционные изображения, собранные в ходе этой проверки автоматически анализируются программой дозор1, которая сортирует позиции кристаллов на держателя образца согласно их соответствующих дифракции прочность. Позиции для коллекции частичных наборов данных назначаются автоматически на основе отключения прочность дифракции и, в последнем шаге, небольшие клинья дифракции данных, обычно ±5 ° вращения, собраны из каждой выбранной позиции. Опыт показал, что этот диапазон вращения обеспечивает достаточное количество отражений на кристалл для частичного набора данных, масштабирование целей, хотя в то же время сокращение возможных кристалл центрирования вопросы и вероятность разоблачения несколько кристаллов в особенно тесно поддержка1. Клинья данных отдельных дифракции (частичное наборы данных), затем обрабатываются либо вручную или с помощью автоматизированной обработки данных трубопроводов10,11,12,13. Для определения нижнего течения структуры необходимо затем найти наилучшее сочетание частичных наборов данных для слияния в14,,1516 после чего полный результирующий набор данных может рассматриваться таким же образом как один из одного кристалла эксперимент.

В качестве примера MeshAndCollect на практике мы представляем здесь решение кристаллической структуре Лазурный голубой флуоресцентный белок (СПФ), с использованием набора данных дифракции, построенных из комбинации частичных наборов данных, собранных из серии микрокристаллы монтируется на такую же поддержку образца. Лазурный был инженерии от Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) от медузы Aequorea victoria17, чьи хромофора флуоресцентного autocatalytically формируется из циклизация трех последовательных аминокислотных остатков. Лазурный получается из GFP мутирует соответственно первый и второй остатки хромофора, серина и тирозина, треонин (S65T) и триптофан (Y66W) и адаптации среды хромофора с далее мутации (Y145A, N146I, H148D, M153T и V163A) производить значительные, но неоптимальный флуоресценции уровень QY = 0,4918,19,20. Неоптимальный флуоресцентные свойства Cerulean было предложено быть связаны с динамика сложных белков, с участием несовершенной стабилизации одного из одиннадцати β-нити белка21 и размещение двух различных хромофора изомеров в зависимости от рН и облучения условий22. Мы решили работать с Cerulean как модель белка, иллюстрирующие использование протокола MeshAndCollect из-за относительно простота настройки размер кристалла в зависимости от кристаллизации. В структуре Cerulean очень похож на что его родительского белка GFP, как он состоит из β-баррель формируется из одиннадцати β-нити вокруг α-спирали, которая несет хромофора.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. выражение и очистки Cerulean

Примечание: Это базируется на протоколе, Опубликовано Lelimousin соавт. 21

  1. Выразить его меткой Cerulean в Escherichia coli BL21 клетки, выращенных при 37 ° C в 4 Л авто индуцибельной средних23 до600OD = 1, а затем Инкубируйте на ночь на 27 ° C.
  2. Урожай бактериальные клетки в 5000 x g и лизировать клетки через sonication (40%, 5 мин, 10 с-пульс, пауза 10 s) в 200 мл буфера, состоит из 20 мм трис рН 8,0, 500 мм NaCl и 1 x ЭДТА бесплатно ингибиторов протеазы.
  3. Загрузить супернатант на столбце Ni-НТА его ловушку и элюировать Cerulean с 100 мм имидазола в тех же условиях буфера.
  4. Бассейн ярко желтый цветных фракций. Белок неразрывно цветные, поэтому Cerulean содержащие фракции легко различимы.
  5. Очищайте белка (4 мл) на столбец S75 в 20 мм трис pH 8.0.
  6. Бассейн ярко желтый фракций и концентрата белка решения до 15 мг/мл.

2. кристаллизация

  1. Используйте drop висит паров диффузии техника24 при 20 ° C в Linbro пластины. Заполнение скважины с 1 мл осадителя раствора, состоящий из 100 мм HEPES на pH 6,75, 12% PEG8000 и 100 мм MgCl2. Для подвешивания капли микс 1 мкл белка сосредоточено до 15 мг/мл с 1 мкл осадителя раствора. Кристаллы должны появиться в течение 24 часов.
  2. Урожай полученные кристаллы и передачи их в 100 мкл заполнения буфера, состоит из 22% 0,1 М HEPES рН 6,75, PEG 8000.
  3. Измельчить кристаллы с 0,1 мл ткани точильщика и разбавленных в заполнение буфера (соотношение 1: 100).
  4. Дайджест Алиготе Стоковый раствор белка (15 мг/мл) с трипсина (0.5 мг/мл в буфере же) за 1 час (1:10 (v/v)).
  5. Mix решение Переваримый протеин с 10% семян содержащих буфера (v/v).
  6. Выращивать кристаллы (10 * 10 * 20 мкм3) в 0,1 М HEPES рН 7, 14% PEG 8000, 0.1, MgCl2 в 1-1,5 мкл висит падает с помощью метода диффузии паров.

3. Кристалл монтажа

  1. Используйте подходящий цикл, например, цикл 700 Квадратные отверстия сетки 25 мкм монтируется на стандартный образец держатель позвоночника25. Перевести кристаллы от падения кристаллизации (шаг 2.6) в 1 мкл раствора криопротектора (хорошо осадителя раствора, смешивают с глицерином (20% v/v в качестве окончательного)).
  2. Смонтируйте кристалл суспензии белка на цикле сетки, перемещая цикла под кристаллов и их отмены из падения. В идеале кристаллы должно быть в диапазоне размеров от 5 мкм — 30 мкм максимальная размерность с не перекрываются кристаллы, монтируется в цикле.
  3. Фитиль от лишней жидкости, прикоснувшись к горе быстро с фильтровальной бумаги. Отложения кристаллов так, что они сидят в плоскости цикла окружении как мало Основная жидкость как можно скорее.
  4. Окунитесь горе в unipuck полностью жидкого азота. Храните шайбу на 100 K в подходящей емкости до тех пор, пока луч время доступен.

4. автономный подготовка эксперимента синхротрон

Примечание: Запрос синхротрона луч время уже можно и следуйте онлайн руководство для доступных типов доступа и о том, как подать заявку для данного синхротрона. Европейский центр синхротронного излучения руководящих принципов можно найти на http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying. Если член группы блока распределения ESRF (мешок), приложения для каждого конкретного проекта не требуется. В этом случае экспериментаторов следует подходить к их ответственных мешок, относительно изменения списочного статуса луч времени.

  1. Предложение принято, и получил приглашение для эксперимента, после завершения обучения безопасности всех участников. Заполните «A-» (через пользовательский портал ESRF, http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form) с информацией безопасности на образцах. Свяжитесь с местным Контактное лицо для обсуждения эксперимент. После того, как представлены и проверены A-формы, то это даст вам эксперимент номер и пароль.
  2. Подключиться к расширенной ISPyB26 (http://www.esrf.fr/) и выберите MX.
  3. Войдите в систему эксперимент номер и пароль от A-формы.
  4. Выберите отгрузки | Добавить новые и заполните необходимую информацию.
  5. Выберите Добавить посылку и заполнить в соответствующих данных. Выберите Добавить контейнер, выберите unipuck и заполнить в требуемой информации, включая позиции держатели образца в шайбу.

5. Загрузка образца на излучение

  1. В экспериментальной загон, загрузить шайбу в пример смены (SC) Девар и отмечаем его позицию.
  2. Интерлок экспериментальной кабины и введите управления загон.
  3. Войдите в ISPyB (https://esrf.fr/). Выберите Подготовить эксперимент, найти груз, следующий и указывают на излучение и шайбой позиция в SC.
  4. Войти в излучение программное обеспечение управления, здесь MXCuBE227,28 с экспериментальной номер и пароль, указанный в A-форме.
    1. Нажмите кнопку Sync для синхронизации программного обеспечения управления излучение с базой данных ISPyB.
  5. Используйте программное обеспечение управления излучение, чтобы смонтировать держатель образца на гониометре. В MXCuBE2 щелкните правой кнопкой мыши на позиции в районе смены образца и выберите Гора образца.
  6. Воспользовавшись MK3 мини-Каппа гониометр29 установлен на большинстве ESRF MX излучение, использования MXCuBE2 в «визуальные перестройки» рабочего процесса30 для выравнивания плоскости держателя образца с осью вращения гониометра.
    1. Выберите кнопку центр , центр затем 3-Нажмите на середину края кончик петли. Сохраните позицию по центру, выбрав сохранить.
    2. Снова нажмите на кнопку центр , затем 3-Выберите центр в середине начала стволовых цикла. А также сохраните второе место, нажав на сохранить.
    3. Выберите один из сохраненных центру позиции, нажав на него.
    4. Разделе Дополнительнодобавьте рабочий процесс Visual переориентации в MxCuBE2 очередь сбора данных.
    5. Запуск рабочего процесса, нажав на сбор очереди.
    6. После того, как рабочий процесс выравнивание плоскости держателя образца с осью вращения гониометра, центр держателя образца снова, на этот раз где-то в середине сетки.
  7. Ориент держателя образца, так что лицо сетки перпендикулярно оси луча рентгеновского вращением оси Омега, используя MXCuBE2.
  8. В MXCuBE2 выберите размер луча, необходимые для сканирования держателя образца (только для излучение с переменной пучка размера).
    1. Нажмите на Диафрагма раскрывающегося меню в программном обеспечении управления излучение и выберите значение, например, 10 мкм.
  9. Определение сетки для сканирования сети.
    1. Нажмите на значок инструмента сетки в MXCuBE2. Появится окно инструмента сетки.
    2. В представлении Образец MXCuBE2 Нарисуйте сетку оставил щелкнув и перетащив указатель мыши над областью, содержащей кристаллов на держателя образца.
    3. Чтобы сохранить сетку нажмите на кнопку плюс в окне инструмента сетки (сетка становится зеленым).

6. подготовить и выполнить процесс MeshAndCollect

  1. В поле разрешение MXCuBE2 введите разрешение (dмин) на котором дифракционный изображения должны быть собраны, например, здесь 1.8 Å.
  2. Выберите MeshAndCollect на вкладке сбор данных Дополнительно , добавить его в очередь и выберите собрать очереди.
  3. В окне параметров, которое появляется можно используйте параметры по умолчанию зависит от излучение. В эксперименте описано здесь значения по умолчанию, параметры являются 0,037 s выдержка на сетку точек сканирования, передачи 100% (в этом случае приводит к 4 х 1011 ph/s), 1° колебаний на линии сетки сканирования.
  4. Нажмите кнопку Continue. Сетка сканирования запускается и анализируются и убывания силы дифракции с программным обеспечением дозор1дифракция изображений, собранных в каждой точке сетки. Этот процесс выполняется в фоновом режиме.
  5. После анализа дозор тепла карта создается и порядок для последующих частичных данных коллекций назначается автоматически в зависимости от прочности дифракции (см. Рисунок 1).
    Примечание: Результаты этого шага можно также проверить в ISPyB. Для коллекции частичных наборов данных, которые новую вкладку с настройками всплывает в программном обеспечении управления излучение выберите подходящие значения для вращения диапазон (т.е., 0,1 °), количество изображений (т.е., 100), время экспозиции, резолюции, передачи, Обратная луча и т.д. идеально доза для каждого клина собираться должна быть ниже предела Гарман (30 МГР). Приблизительные выдержка на изображение-0,037 s до 0,1 s в описанных экспериментальных условиях.
  6. Нажмите кнопку продолжить для запуска частичных данных коллекции.

7. обработка данных

Примечание: Частичное наборы данных интегрируются с подходящей программы (10XDS). Для этого будет использоваться сценарий Python, признает каждый набор индивидуальных данных, интегрирует его и делает уверен, что индексация между различными частичных наборов данных является последовательным.

  1. Откройте папку, содержащую изображения: /data/visitor/mxXXXX/beamline_name/date/RAW_DATA/Cerulean.
  2. Сделайте копию безопасности подпапке процесс, который можно найти в папке, где собраны частичных наборов данных.
    1. На терминале Linux используйте команду cp-r процесс process_backup.
  3. Перейдите в папку процесс и запустить сценарий обработки.
    1. На терминале Linux введите команду cd процесс и нажмите enter.
    2. Тип procMultiCrystalData и нажмите enter.
      Примечание: Скрипт спросит для пространства группы и ячейки параметры (эта информация является обязательным), введите те согласно инструкции. После последнего подтверждения пользователя сценарий будет выполняться автоматически.

8. Объединение наборов данных

Примечание: После всех частичных наборов данных интегрированы наилучшее сочетание из них объединяются производить окончательный набор данных для использования в определении структуры и изысканности. Различные цели этого процесса слияния можно получить лучшие данных статистики, полной комплектности (рекомендуется) или высокой кратности (высокий < I/σ(I) >, низкий R-факторы, и т.д.). Последний иногда может быть за счет полноты и/или количество элементов так, что этот вариант должен быть выбрано с большой осторожностью.

  1. Объединение частичных наборов данных с помощью программы ccCluster14. Она использует анализ иерархический кластер (HCA) для определения возможных комбинаций (Изоморфное частичных наборов данных).
    1. Введите ccCluster в Unix терминал, чтобы открыть ее графический интерфейс пользователя (GUI).
      Примечание: В ccCluster GUI рисуется дендрограмма. Это дает предложение какие частичных наборов данных может быть лучше объединены на основе изоморфизм между ними.
    2. Нажмите на узел, соответствующий значению около 0.4 на вертикальной оси. Как правило более высокие значения будут включать более частичные данные наборы но привести к слияния статистика как частичное наборы данных будут меньше Изоморфное хуже.
    3. Нажмите на Слияние данных. Выбранный кластер будет обрабатываться в фоновом режиме и предполагаемое слияние статистика появится в новой вкладке в GUI. Этот шаг может быть повторен для различных комбинаций наборов данных. Хорошее сочетание частичных наборов данных полноты должна быть близка к 100%, < I/σ(I) > значения высокой (10 или выше в оболочке низкие резолюции) и значения R-МЭС31 низкой (около 5% в оболочке низкого разрешения).
  2. Для каждой комбинации выбран используйте созданный входной скрипт для слияния частичное наборы данных, выбранного в одном МТЗ файл (т.е., бессмысленно32).
  3. Окончательно масштаб объединить интенсивности данные в этот файл, используя программу масштабирования (т.е., бесцельным32) и, как с помощью файла из коллекции данных одного кристалла, использовать выходные данные для последующих этапов и структура решения33 .

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MeshAndCollect, как это реализовано в MXCuBE2 (см. рис. 1а), была использована для коллекции наборов данных частично дифракции от мелких кристаллов Cerulean расположен на же держатель образца, в котором визуальной идентификации кристаллов было трудно. Для держателя образца, мы обратили сетки над центром meshloop (см. рис. 1B) и на основании дозор Оценка тепла карта 85 частичной дифракции (см. цифры 1 c, 1 D) наборы данных автоматически были собраны. Эти индивидуально были интегрированы, то слияние (см. выше) для получения набора данных с 99,8% полноты в dмин = 1.7Å (см. таблицу 1). Половина набор корреляции (1/2CC)34 в оболочке высокой резолюции было 60% (= 4,7). Как и ожидалось, Кристаллическая структура Cerulean может быть прямолинейно решена путем молекулярной замена33 с помощью созданного набора данных. После уточнения мы получили Rработать 22,8% и Rбесплатно 25,4%. Суперпозиция с ранее определяется структурой (PDB 2WSO запись21) показывает глобальные rmsd на позицииα C 0,1 Å.

Статистика объединенного набора данных
Кластеризация порог0,35
Количество частичных наборов данных25
Пространственная группаP212121
Ячейки (a, b, c)50.98, 62.76, 69.50
Резолюция диапазон46.58-1.70 (1,73-1,70)
Rmerge (все я + и -)0.133 (0,743)
Rmeas (все я + & I-)0,142 (0.813)
Rpim (все я + & I-)0.047 (0.318)
Замечания общего/уникальный220693/25129
Mean((I)/SD(I))13,8 (4,7)
MN(I) половину набор корреляции CC(1/2)0.994 (0.602)
Полнота99,8 (99,5)
Кратность8.8 (6.5)
Окончательный Rвече 22.8
Окончательный Rбесплатно 25,4

Таблица 1: Сбор статистики объединенный набор данных, указывающий высокое качество данных.

figure-results-1
Рисунок 1: использование MeshAndCollect для сбора ряда частичных наборов данных от ряда мелких кристаллов, содержащихся в том же держатель образца. A)-интерфейс MXCuBE2. Зеленый овал над полем на оси просмотра указывает инструмент «сетка». B) с ним сетка рисуется образ держатель образца в поле образ жизни. C) тепла карта дозор баллов. D) пример дифракционного изображения. E) дендрограмма после иерархический кластерный анализ. Наборы данных в красном были использованы для слияния. F) общая структура Cerulean. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Успех эксперимента MX обычно зависит от наличия относительно большой, хорошо Дифрагирующая кристаллов. Для проектов, где не оптимизации от небольших кристалл души в более крупные кристаллы MeshAndCollect предоставляет возможность получения полной дифракции набора данных для структуры решения через сочетание Изоморфное частичных наборов данных, собранных из серии мелких кристаллов. Метод совместим с Синхротронное излучение для MX, идеально с высоким фотонного потока и маленький луч диаметром, оснащен устройством дифрактометр состояние искусства и быстро индикация детектор. На конечной станции часть сбора данных такого эксперимента займет около 20 минут, в зависимости от числа частичных наборов данных должны быть собраны и количество кристалл содержащих держатели образца для анализа.

Наиболее важной предпосылкой для успеха MeshAndCollect эксперимента является наличие достаточного числа (по крайней мере 50, 100 идеально) из Дифрагирующая позиции на держателя образца. Из опыта минимальный размер кристаллов для анализа должна быть около 5 мкм в наименьший размер. Метод совместим с любой стандартной крио охлаждение совместимый образец Держатели с наилучшие результаты достигаются с помощью сетки ездовых животных, которые являются жесткие и прямые.

В Европейский центр синхротронного излучения MeshAndCollect реализуется в удобной для пользователя форме в Passerelle (http://isencia.be/passerelle-edm-en) рабочего процесса30 из программного обеспечения управления MXCuBE2 излучение. Основным преимуществом по сравнению с другими методами SX MeshAndCollect что собранные данные могут быть обработаны стандартных программ и автоматизированных трубопроводов для монокристаллов MX.

Как показывает наш пример, MeshAndCollect очень легко применять и приводит к серию частичную дифракции наборов данных, обычно собирают из маленькие кристаллы, которые могут быть объединены производить полный набор данных для использования в структуре решения. Кроме того MeshAndCollect имеет потенциал, чтобы открыть пространство выборки кристаллография протеина, как он предоставляет способ для сбора полезной данных от процессов кристаллизации где последний шаг оптимизации, производство крупных кристаллов, неудачной.

В свете текущих событий к ярче рентгеновских источников (например, чрезвычайно блестящей источник (EBS) проекта/ESRF35) можно предположить, что из-за повышенной радиации повреждения, типа мульти кристально данных коллекции способствует MeshAndCollect станет стандартным методом сбора данных, а не исключение – как в настоящее время в случае - на основе Синхротронное излучение MX.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Европейский центр синхротронного излучения для предоставления луч времени через программу собственных исследований.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Концентраторы BeamlineESRF ID 23-1
: Amicon Ultra-4 Ultracel -30KMerck МиллипорыUFC803024
Кристаллизационные пластины XDXm с герметикомHampton ResearchHR3-306
Ингибиторы протеазы без ЭДТАRoche4,693,159,001
Escherichia coli BL21 (DE3)Life Technologies Thermo Fisher НаучныйC600003
глицеринVWR Chemicals Prolabo14388.29T
HEPESEuromedex10-110-C
His-trap HPGE healthcare17-5247-01
имидазолSigma-Aldrich56750-500G
MgCl2Sigma-Aldrich13452-1KG
MicroMeshes 700/25MiTeGenАртикул:  M3-L18SP-25L
NaClFisher ChemicalS/3160/60
PEG8000Sigma-AldrichP5413-500G
Акустическая виброэлемент 75/15SONICS
Superdex 75 10/300 -GLGE здравоохранение17-5174-01
Трис базаEuromedex26-128-3094-B
ТрипсинСигма-ОлдричT9201-1G
Молекулярные размерыUnipuckMD7-601
Name<strong>CompanyНомер в каталогеКомментарии
>Программы
ISPyBESRFSolange Delageniè re, Патрис Бреншеро, Людовик Лаунер, Алан В. Эштон, Рикардо Леаль, Sté Фани Вейриер, José Габадиньо, Элспет Дж. Гордон, Сэмюэл Д. Джонс, Карл Эрик Левик, Seá n М. МакСвини, Sté Фани Монако, Макс Нанао, Даррен Спрус, Улоф Свенссон, Мартин А. Уолш, Гордон А. Леонард; ISPyB: информационная система управления для синхротронной макромолекулярной кристаллографии, Биоинформатика, Том 27, Выпуск 22, 15 ноября 2011 г., Страницы 3186– 3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535местное развитие
бесцельноеМРЦ Лаборатория молекулярной биологииЭванс,.Р., Муршудов, Г.Н. Насколько хороши мои данные и каково разрешение? Acta Crystallographica Section D Биологическая кристаллография. <стронг>69 (7), 1204– 1214, doi: 10.1107/S0907444913000061 (2013).
ccCluster ESRFСантони, Г., Зандер, У., Мюллер-Дикманн, К., Леонард, Г., Попов, А. Иерархическая кластеризация для экспериментов по кристаллографии мультикристаллических макромолекул: программа ccCluster. Journal of Applied Crystallography. 50 (6), 1844– 1851, doi: 10.1107/S1600576717015229 (2017).Местное развитие
DOZORESRFБуренков и Попов, неопубликованнаялокальная разработка
MeshAndCollect workflowESRFZander, U. et al. MeshAndCollect: автоматизированный рабочий процесс сбора мультикристаллических данных для пучков синхротронной макромолекулярной кристаллографии. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328– 2343, doi: 10.1107/S1399004715017927 (2015).Местное развитие
MXCuBE2ESRFGabadinho, J. et al. MxCuBE: среда управления синхротронным пучком, адаптированная для экспериментов по кристаллографии макромолекул. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700– 707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24– 226 (2014).Местное развитие
XDSMax-Planck-Institut fü r Medizinische ForschungKabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125– 132, doi: 10.1107/S0907444909047337 (2010)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zander, U., et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328-2343 (2015).
  2. Henderson, R. Cryo-Protection of Protein Crystals against Radiation Damage in Electron and X-Ray Diffraction. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 241 (1300), 6-8 (1990).
  3. Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
  4. Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. IUCrJ. 2 (2), 246-255 (2015).
  5. Stellato, F., et al. Room-temperature macromolecular serial crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (4), 204-212 (2014).
  6. Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (2), 87-94 (2014).
  7. Coquelle, N., et al. Raster-scanning serial protein crystallography using micro- and nano-focused synchrotron beams. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (5), 1184-1196 (2015).
  8. Diederichs, K., Wang, M. Serial Synchrotron X-Ray Crystallography (SSX). Protein Crystallography. 1607, 239-272 (2017).
  9. Borshchevskiy, V. I., Round, E. S., Popov, A. N., Büldt, G., Gordeliy, V. I. X-ray-Radiation-Induced Changes in Bacteriorhodopsin Structure. Journal of Molecular Biology. 409 (5), 813-825 (2011).
  10. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
  11. Winter, G., et al. DIALS implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74 (2), 85-97 (2018).
  12. Winter, G. xia2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction. Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).
  13. Monaco, S., et al. Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810 (2013).
  14. Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. Hierarchical clustering for multiple-crystal macromolecular crystallography experiments: the ccCluster program. Journal of Applied Crystallography. 50 (6), 1844-1851 (2017).
  15. Zander, U., et al. Merging of synchrotron serial crystallographic data by a genetic algorithm. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (9), 1026-1035 (2016).
  16. Foadi, J., et al. Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (8), 1617-1632 (2013).
  17. Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).
  18. Heim, R., Prasher, D., Tsien, R. Y. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (26), 12501-12504 (1994).
  19. Cubitt, A. B., Woollenweber, L. A., Heim, R. Chapter 2: Understanding Structure-Function Relationships in the Aequorea victoria Green Fluorescent Protein. Methods in Cell Biology. 58, 19-30 (1998).
  20. Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nature Biotechnology. 22 (4), 445-449 (2004).
  21. Lelimousin, M., et al. Intrinsic Dynamics in ECFP and Cerulean Control Fluorescence Quantum Yield. Biochemistry. 48 (42), 10038-10046 (2009).
  22. Gotthard, G., von Stetten, D., Clavel, D., Noirclerc-Savoye, M., Royant, A. Chromophore Isomer Stabilization Is Critical to the Efficient Fluorescence of Cyan Fluorescent Proteins. Biochemistry. 56 (49), 6418-6422 (2017).
  23. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41 (1), 207-234 (2005).
  24. Rhodes, G. Crystallography made crystal clear: a guide for users of macromolecular models. , Elsevier/Academic Press. Amsterdam; Boston. (2006).
  25. Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).
  26. Delageniere, S., et al. ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography. Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).
  27. Gabadinho, J., et al. MxCuBE a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707 (2010).
  28. De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone. Consiglio Nazionale delle Ricerche. , (2014).
  29. Brockhauser, S., Ravelli, R. B. G., McCarthy, A. A. The use of a mini-κ goniometer head in macromolecular crystallography diffraction experiments. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1241-1251 (2013).
  30. Brockhauser, S., et al. The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984 (2012).
  31. Diederichs, K., Karplus, P. A. Improved R-factors for diffraction data analysis in macromolecular crystallography. Nature Structural Biology. 4, 269(1997).
  32. Evans, P. R., Murshudov, G. N. How good are my data and what is the resolution? Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1204-1214 (2013).
  33. Taylor, G. L. Introduction to phasing. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 325-338 (2010).
  34. Karplus, P. A., Diederichs, K. Linking Crystallographic Model and Data Quality. Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).
  35. Dimper, R., Reichert, H., Raimondi, P., Ortiz, L. S., Sette, F., Susini, J. ESRF upgrade programme phase II (2015 - 2022). The orange book. , (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

MeshAndCollectSerial CrystallographyX ray CrystallographyCrystal StructureCerulean ProteinPartial Data SetsMicro crystalsSynchrotron BeamlineMXCuBE SoftwareMolecular Replacement

Related Articles