Здесь мы описываем методы оптогенетической манипуляции определенными типами нейронов во время мониторинга состояния сна/бодрствования у мышей, представляя нашу недавнюю работу над ядром кровати stria terminalis в качестве примера.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Оптогенетическое манипулирование нейронными цепями во время мониторинга сна / бодрствования государств у мышей
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В последние годы оптогенетика широко используется во многих областях нейронаучных исследований. Во многих случаях опсин, например канал родопсин 2 (ChR2), выражается вирусным вектором в определенном типе нейрональных клеток у различных мышей-кре-драйверов. Активация этих опсинов вызвана применением световых импульсов, которые поставляются лазером или светодиодом через оптические кабели, и эффект активации наблюдается с очень высоким разрешением времени. Экспериментаторы способны остро стимулировать нейроны при мониторинге поведения или другого физиологического исхода у мышей. Оптогенетика может позволить полезные стратегии для оценки функции нейрональных цепей в регуляции сна / бодрствования состояний у мышей. Здесь мы описываем методику изучения влияния оптогенетических манипуляций нейронов с определенной химической идентичностью во время электроэнцефалограммы (ЭЭГ) и мониторинга электромиограммы (ЭМГ) для оценки стадии сна мышей. В качестве примера мы описываем манипуляции ГАМК нейронов в ядре кровати stria terminalis (BNST). Острое оптогенетическое возбуждение этих нейронов вызывает быстрый переход к бодрствованию при применении во время сна NREM. Оптогенетические манипуляции наряду с записью ЭЭГ/ЭМГ могут быть применены для расшифровки нейрональных цепей, которые регулируют состояния сна/бодрствования.
Введение
Сон необходим для оптимальной когнитивной функции. Последние результаты также свидетельствуют о том, чтонарушения во сне связаны с широким спектром заболеваний 1,2,3. Хотя функции сна до сих пор в значительной степени нерешенными, значительный прогресс был достигнут в последнее время в понимании нейронных цепей и механизмов, которые контролируют сон / бодрствования государства4. У млекопитающих существует три состояния бдительности: бодрствование, небыстрое движение глаз (NREM) сна, и быстрое движение глаз (REM) сна. Пробуждение характеризуется быстрым....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты здесь были одобрены Комитетом по эксперименту и использованию животных Университета Цукуба, в соответствии с руководящими принципами NIH.
1. Хирургия животных, инъекция вируса, электрод для ЭЭГ/ЭМГ и имплантация оптического волокна
ПРЕДЕКТО: Соответствующие методы защиты и обработки должны быть выбраны на основе уровня биобезопасности вируса, который будет использоваться. AAV следует использовать в изолированной P1A градуированной комнате для инъекций, и трубка проведения AAV должны быть стерилизованы с автоклавом после того, как весь объем иссяк. Хирургическое место и весь....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Настоящее исследование показало влияние оптогенетического возбуждения нейронов ГАМКBNST на переходное состояние сна. ChR2-EYFP был focally выражается в ГАМК нейронов в BNST. На месте гибридизации гистохимических исследование показало, что ChR2-EYFP был colocalized в нейронах, выражающих GAD 67 мРНК сигналов, указывая, что это ГАМК нейронов. Иммуногистохимические срезаные образцы подтвердили положение оптического волокна, кончик которого был чуть выше BNST25.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы представили метод для оценки влияния оптогенетической стимуляции нейронов с особыми химическими идентичностями на состояние переходов сна / бодрствования и дал пример манипуляции ГАМКBNST нейронов. Наши данные показали, что оптогенетическое возбуждение нейронов ГАМКBNST приводит к немедленному переходу от сна NREM к бодрствунию.
Различные экспериментальные проекты доступны из-за разработки многочисленных типов оптогенетических инструментов. Можно активировать или.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Этот проект был частично поддержан финансово Мерк и Ко
Благодарности
Это исследование было поддержано Мерк Следователь исследований программы (#54843), KAKENHI Грант-в-помощь для научных исследований по инновационным областям, "WillDynamics" (16H06401) (T.S.), и KAKENHI Грант-в-помощь для исследовательских исследований по инновационным областям (T.S.) (18H02595).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1x1 Волоконно-оптические вращающиеся соединения | Doric | FRJ 1x1 FC-FC | для оптогенетики |
| 6-контактный разъем | KEL corporation | DSP02-006-431G | |
| 6-контактный разъем | Hirose | 21602X3GSE | |
| Аналого-цифровой преобразователь | Nippon koden | N/A | Аналого-цифровой преобразователь |
| AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP | 3.70&раз; 1013(геномные копии/мл) | ||
| AAV10-EF1a-DIO-EYFP | 5.82&раз; 1013(геномные копии/мл) | ||
| Ампициллин | Fuji пленка | 014-23302 | |
| Усилитель | Nippon koden | N/A | для записи ЭЭГ/ЭМГ |
| Анестетический вапорайзер | Muromachi | MK-AT-210D | |
| Автоматический инжектор | KD научный | 780311 | |
| Карбидный резак | Minitor | B1055 | φ 0,7 мм. Обозначается как бормашина, используется с высокоскоростным вращающимся микромотором |
| Адгезия цианоакрилатов (Арон альфа А) и ускорение | Konishi | #30533 | |
| Стоматологический полимеризующий свет | 3M | Elipar S10 | |
| Эпоксидный клей | Konishi | #04888 | изоляция вокруг припоя 6-контактного и экранированного кабеля |
| Волоконно-оптический патч-корд (ответвление) | Doric | BFP(#)_50/125/900-0.22 | |
| Gad67-Cre мыши предоставлено | доктором Кенджи Сакимурой | Ген рекомбиназы Cre вбит в аллель Gad67 | |
| Шприц Hamilton | Hamilton | 65461-01 | |
| Высокоскоростной роторный микромотор | комплект FOREDOM | K.1070 | Используется с твердосплавным резцом |
| Соединительная втулка | Thorlab | ADAF1 | φ 2,5 мм Керамика |
| Изофлуран | Pfizer | 871119 | |
| лазер | Rapp OptoElectronic | N/A | Длина волны 473 нм |
| Проверка интенсивности лазера | COHERENT | 1098293 | |
| Лазерный стимулятор | Биоисследовательский центр | STO2 | именуется как генератор импульсов в тексте |
| Оптическое волокно с наконечником | Thorlab | FP200URT-CANNULA-SP-JP | |
| pAAV2-rh10 | предоставлен PennVector Core | ||
| pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA | Addgene | plasimid # 20296 | |
| pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA | предоставлен доктором Карлом Дейссеротом | ||
| Патч-корд | Doric | D202-9089-0.4 | Длина 0,4 м, лазерный проводник между лазерами и вращающееся соединение |
| pHelper | Stratagene | ||
| Фотоотверждаемый стоматологический цемент | 3M | 56846 | |
| Серафиновый зажим | Stoelting | 52120-43P | |
| Экранированный кабель | mogami | W2780 | Пайка к 6-контактному гнезду для записи ЭЭГ/ЭМГ |
| Камера для записи сна | Н/Д | Н/Д | Custum-made (21 см; 29 см & 19 см) с держателем резервуара |
| для воды Программное обеспечение для сна | KISSEI COMTEC | N/A | для анализа ЭЭГ/ЭМГ |
| Контактное кольцо | neuroscience,inc | N/A | для анализа ЭЭГ/ЭМГ |
| Винт из нержавеющей стали | Yamazaki | N/A | φ 1,0 x 2,0 |
| Нержавеющая проволока | Кунер-проволока | AS633 | Стереотаксическая рамка диаметром 0,0130 дюйма |
| с цифровой консолью | Koph | N/A | Модель 940 |
| Игла для шприца | Hamilton | 7803-05 | |
| Программное обеспечение регистратора жизненно важных функций | KISSEI COMTEC | N/A | для записи ЭЭГ/ЭМГ |
Ссылки
- Spoormaker, V. I., Montgomery, P. Disturbed sleep in post-traumatic stress disorder: Secondary symptom or core feature? Sleep Medicine Reviews. 12 (3), 169-184 (2008).
- Dworak, M., Wiater, A., Alfer, D., Stephan, E., Hollmann, W., Struder, H. K.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
