С помощью роботизированных систем для обработки и внедрить толстой мышиных проб для гистологического анализа

Summary

Отсутствие стандартизации для обработки мышиных ткани уменьшает качество мышиных гистопатологические анализа по сравнению с человеческих особей. Здесь мы представляем протокол для выполнения гистопатологические экспертизы мышиных воспаленной и рифамицин толстой тканей чтобы показать возможности робототехнических систем, обычно используются для обработки и встраивание человеческих образцов.

Abstract

Понимание человеческих заболеваний были значительно расширены благодаря изучению животных моделей. Тем не менее гистопатологические оценки экспериментальных моделей должен быть жестким, что применяется для человеческих образцов. Действительно надежные и точные выводы критически зависит от качества ткани секции подготовки. Здесь мы описываем протокол для гистопатологические анализа мышиных тканей, который реализует несколько автоматизированных шагов во время процедуры, от первоначальной подготовки для встраивания парафин мышиных образцов. Сокращение методологических переменных путем стандартизации строгий протокол от автоматизированных процедур способствует увеличению общей надежности мышиных патологических анализа. В частности этот протокол описывает использование автоматизированной обработки и внедрение робототехнических систем, обычно используются для обработки тканей и парафин встраивание человеческих образцов, для обработки мышиных образцы кишечные воспаления. Мы делаем вывод, что после внедрения стандартизированных и автоматизированных методов значительно повышена надежность гистопатологические осмотра мышиных тканей.

Introduction

В последние десятилетия были разработаны несколько экспериментальных моделей вскрыть патогенетических механизмов, ведущих к заболеваний человека^1,2. Для того чтобы оценить тяжесть заболевания, исследователи должны оценивать эффект от лечения и исследования цитологического и гистологического архитектурных изменений или количество воспаления³. Для выполнения этих экспериментальных моделей, необходимы подробные анализы гистопатологические, часто сравнивая мышиных и человеческих образцов^4,5.

Кроме того людские пробы обычно обрабатываются и забил гистопатология основной зал и опытных человека патологоанатомов через стандартизированные гистопатологические критерии и методы. И наоборот мышиных ткани обычно фиксированной, встроенные и проанализированы исследователями с ограниченным опытом гистопатологические протоколов. Качество и надежность гистопатологические осмотра начинается с подготовки разделов ткани высокого качества. Несколько факторов способствуют критически увеличение или уменьшение, качество окончательного анализа, включая фиксацию, макроскопической секционирование, переработка, парафин встраивание и встраивание образцы^6,7.

Все эти проходы с участием манипуляции образца подвергаются ручной ошибок, в том числе ручного встраивания образцов и, в меньшей степени, ручной правки микротомных секционирование и пятнать. В настоящее время весь процесс подготовки мышиных тканей для гистологического оценки опирается на протоколы, которые варьируются от лаборатории для лабораторных и ручной протоколов. Цель этого исследования заключается в реализации стандартных автоматизированных протоколов для уменьшения ошибок и изменчивости в мышиных гистопатологические экспертизы.

Насколько нам известно мы опишем здесь первые протоколы для полностью автоматизированной ткани обработки и внедрение оценки гистологических мышиных тканей; Обычно они используются в патологии подразделений для анализа человеческих особей. Как практический пример возможности метода, проанализировано модель мышиных кишечного воспаления, т.е., модель хронический колит вызванные повторного отправления декстран сульфата натрия (DSS) в питьевой воде^{8 ,9}. Эта экспериментальная установка тесно напоминает человека воспалительных кишечника (IBD) заболеваний¹⁰ , поскольку DSS-лечить животных проявлять признаки кишечной воспаления, например, потеря веса, жидкий стул или понос и укорочение толстой кишки, а также фиброз ^8,9,11. Как заметил человека IBD пациентов, DSS лечения создает сложное заболевание курс. В этом контексте сложных гистологических оценок необходимо понять глубокие изменения архитектуры ткани. Таким образом осуществление описанных протоколов для повышения качества подготовки образца может пользу исследователи, опираясь на интерпретации гистологические и иммуногистохимическое анализирует мышиных экспериментальных параметров. Мышиных экспериментальных моделях заболеваний человека с участием изменения архитектуры ткани, присутствие клетчатки инфильтрат или воспаление в различных тканях и органах (ЖКТ, мозга, печени, кожи) может использовать увеличение качества Пробоподготовка для гистопатологические осмотра.

Protocol

Животных процедуры были одобрены министерством здравоохранения (авт. 127/15, 27/13) Италии и руководящими животных ухода Европейского института онкологии IACUC (институциональный уход за животными и использования Комитета)

1. хронический колит индукции администрацией повторяющихся DSS

1. Отдельный возраст и пол соответствует мышей в 2 группах (лечение DSS против управления H₂O, по крайней мере 5 мышей однопометники в экспериментальной группе).
2. Администрировать 2,5% DSS (40 кДа) в питьевой воде за 7 дней до группе лечения и воды к группе элементов управления.
   Примечание: Эта модель индуцирует Трансмуральное хронического воспаления кишечного⁹.
3. После 7 дней прекратить лечение DSS и дать воде обеих групп на 14 дней. Повторите эту процедуру 3 раза.
   Примечание: Повторяющихся отправления DSS вызывает изменения слизистой кишечника, напоминающий человека IBD, т.е., фиброз⁹.
4. Пожертвовать мышей в соответствии с процедурами, уполномоченным институциональных IACUC, т.е., , CO₂ ингаляции.
5. Откройте с помощью скальпеля мыши живота и брюшины.
   Примечание: Стерильность рекомендуется, но не строго необходимым.
6. Отделяйте толстой кишки от тонкой кишки с щипцами и пинцет. Акцизный толстой кишки с помощью пинцета и пинцет.
   Примечание: Измерение длины двоеточия (рис. 1A) является метод для определения, если колит произошло в DSS-лечение мышей.
7. Промойте двоеточие в чашке Петри с 10 мл холодного 1 x фосфатный буфер (PBS) и аккуратно нажмите, чтобы удалить фекалии.

2. мышиных тканей фиксации

1. Погрузите каждую мышиных Колон образца в 10 мл 10% нейтральных буферизуются формалина (NBF) на RT (комнатной температуры).
   Примечание: Стерильность рекомендуется, но не строго необходимым.
2. Исправить ткани на 18 – 24 h на RT.

3. Колон секционирование и подготовка тканей

1. Удаление фиксированных тканей из NBF контейнера с небольшой помощью пинцета и положить их в чашке Петри. Положите толстой кишки на секущей работы тарелку с небольшой помощью пинцета.
2. Вырежьте двоеточия в фрагментов (0,2 см до 0,3 см длины) с стерильным скальпель. Этот фрагмент длина является оптимальным, чтобы не превышать толщину кассеты.
3. Подобрать одно двоеточие сегмент малых пинцетом (рис. 2A). Вставьте один из пластика, выступающие советы ориентированные парафина, встраивание кассету с небольшой помощью пинцета (рис. 2B) одно двоеточие сегмента.
4. Повторите данную операцию (3.2-3.3) с дополнительной 3 Колон сегментами одну кассету. Избегайте вставки сегментов в прилегающих выступающие советы, чтобы свести к минимуму дублирование тканей
5. Плотно закройте кассету, осторожно нажав четырех краев (рис. 2 c). Избегайте, сжимая ткани, чтобы предотвратить повреждение тканей.
6. Вставьте пластиковые несущую рамку сетки. Ярлык несущую рамку для идентификации образца. Повторите для каждого биологического образца.

4. ткань обработка

1. Включите автоматические процессора, нажав на кнопку питания (рис. 3A, 3B).
2. Прогреться в течение 1 ч для обеспечения плавления парафина. Подождите, пока этот документ подтверждает, что парафин полностью растаял, наблюдая за присутствие выделенный значок (рис. 3 c).
3. Вставьте каждый ориентированной кассеты (содержащие образцы ткани) вручную в корзины металла, предоставляемый автоматизированных процессора (рис. 3D). Место кассеты вертикально накладки их недалеко от одного к другому, чтобы оптимизировать размещение корзина.
4. Закройте корзины металла (Рисунок 3E).
5. Откройте крышку реторты (Рисунок 3F). Реторта является местом, где корзина вставляется в машину. Вставьте корзину в выделенный корпус процессора (Рисунок 3 g). Закройте крышку реторты (рис. 3 H).
6. Используйте сенсорный экран на компьютере инструмент для определения рабочей протокол (Рисунок 3I). Выберите последовательность решений, время и температуры должна осуществляться по схеме приводятся в таблице 1.
7. Назначьте протокол для запуска на реторты, содержащие в корзину, нажав на иконку выделенный компьютер (Рисунок 3J). Запустите протокол, нажав на Кнопку «Пуск» (рис. 3 L).
8. Подождите, пока прибор подтверждает в конце протокола, путем наблюдения за присутствие выделенный значок и услышав сигнал из машины.
9. Откройте крышку реторты. Выньте корзину из процессора (рис. 3 M).

5. ткани встраивание

1. Включите автоматические embedder, нажав кнопку питания (рис. 4A).
2. Прогреться в течение 1 ч для обеспечения плавления парафина. Подождите, пока этот документ подтверждает, что парафин полностью растаял, наблюдая температуры Парафиновая ванночка, обозначается внутренний термометр инструмента.
3. Вручную перенести все обработанные кассеты из корзины процессора embedder стойки. Каждый шкаф может содержать до 32 кассеты. (Рис. 4б, 4 C).
4. Открывайте крышку главной embedder (рис. 4 c, 4 D, 4E).
5. Использовать сенсорный экран на компьютере инструмент Робототехнические системы, что стойки вставить (Рисунок 4F).
6. Откройте крышку корпуса впуска (Рисунок 4 g). Вставьте решетку в входе жилья. Каждый embedder может содержать до 4 стойки одновременно (рис. 4 H, 4I). Закройте крышку корпус впускного (Рисунок 4J).
7. Используйте сенсорный экран на компьютере инструмент для начала внедрения процедуры, согласно таблице 2 (рис. 4 K).
   Примечание: Каждая стойка 32 кассеты занимает 45 мин должен быть внедрен.
8. Подождите, пока прибор подтверждает в конце протокола, наблюдая за присутствие выделенный значок (рис. 4 L).
9. Удалите выход стойки (рис. 4 M). Закройте крышку главной embedder.
10. Удалите встроенные блоки (содержащие ориентации сеток) из стойки. Передачи встроенных блоков в картонной коробке хранения.

6. микрометр секционирование

1. Включите охлаждающей плиты микротома. Установите температуру между -8-10 ° c.
2. Включите термостатической водяной бане микротом, содержащий 2 Л дистиллированной воды. Установите температуру водяной бане между 42 – 45 ° C.
3. Место парафина внедренные блоки охлаждения пластины. Подождите, по крайней мере 5 минут чтобы позволить блоки для охлаждения.
4. Возьмите один блок от охлаждения пластины и поместите его в держатель блока микротома.
5. Установите вырезать толщиной до 10 мкм. отделка блок путем разрезания он 6 раз в 10 мкм толщина микротома.
6. Измените параметр толщина микротома от 10 мкм 3 µm. вырезать один 3 мкм секции для окрашивания гематоксилином и эозином (H & E).
7. Соберите в разделе 3 мкм с маленькой кистью. Поместите в разделе 3 мкм в водяной бане, тщательно класть его на поверхности воды для уменьшения морщин на ткани. Соберите в разделе ткани с термостатическим водяной бане на слайде одного стекла.
   1. При необходимости, сократить дополнительные разделы.
8. Ярлык стеклянное скольжение, написав идентификации образца.
9. Поместите слайды в 37 ° C духовке в течение по крайней мере 10 мин.
10. Положите стекло слайды в стойки для немедленного анализа или в коробки хранения.

7. гематоксилином и эозином (H & E)

1. Включите автоматические Стайнер, нажав кнопку питания. Разрешите инициализацию манипулятор, наблюдая изменения панели загрузки на экране монитора инструмента.
2. Вставьте стекла слайды в стойку Стайнер, вертикально Вставка до 30 слайдов.
3. Ярлык стойку с соответствующим радиочастотной идентификации (RFID) пластиковые тегом. RFID меток — это система идентификации правильный протокол окрашивание загружена в компьютер ситечко.
4. Вставьте решетку в ситечко. Разрешить компьютеру автоматически загружать и запускать окрашивание протокол согласно признанию RFID метки.
   Примечание: Протокол для H & E пятнать описан в Таблица 3.

8. иммуногистохимическое окрашивание

1. Выполнения иммуногистохимических и Мэллори trichrome окрашивание как описано выше⁷.

Results

Экспериментальная хронический колит, вызванных повторного отправления DSS в питьевой воде является моделью мышиных кишечного воспаления, напоминающий человека IBD^8,9. Рисунок 1 описывает эффекты лечения DSS, включая двоеточие сокращения (Рисунок 1A), широко используется параметр Оценка присутствия DSS-индуцированной воспаления и толстой выражение генов провоспалительных, ...

Discussion

Мы используем различные автоматизированные действия во время подготовки мышиных тканей для гистопатологические анализа. Этот протокол направлен на обеспечение технического Советы увеличить воспроизводимость и стандартизации процесса в целом, повышая тем самым общее качество окончательной гистопатологические оценки. Мы реализовали автоматизированных инструментов и методов для подготовки и внедрения тканей, обычно используются в патологии основной зал для изучения человеческих особей.

Чтобы прод...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Абсолютный этанол безводный	Карло Эрба	414605	реактив
Абсолют ETOH	Honeywell	02860-1L	реактив
Сульфат алюминия	SIGMA	A6435	Анилин
Blue	SIGMA	415049	реагент
карбол Fuchsin	SIGMA	C4165	реактив
CD11b (клон M1/70)	TONBO biosciences	35-0112-U100	антитело
CD20 IHC (клон SA275A11)	Biolegend	150403	антитело
CD3 (17A2)	TONBO biosciences	35-0032-U100	антитело
CD4 (GK1.5)	BD Biosciences	552051	антитело
CD45.2 (клон 104)	BioLegend	109837	антитело
CD8 (53-6.7)	BD Biosciences	553031	антитела
Цитратный буфер pH 6 10x	SIGMA	C9999	реактив
Dab	Vector Laboratories	SK-4100	реактив
DPBS 1x	Microgem	L0615-500	реактив
DSS	TdB Consultancy	DB001	реактив
EDTA	SIGMA	E9884	реактив
EnVision Flex Пероксидаза-блокирующий реагент	DAKO		compreso в GV80011-2
EnVision Flex Substrate	DAKO		compreso в GV80011-2
EnVision Flex/HRP	DAKO		compreso в GV80011-2
EnVision Flex+ Rat Linker	DAKO		compreso в GV80011-2
Eosin	VWR	1.09844	реагент
F4/80 (клон BM8)	BioLegend	123108	антитело
Формалин	PanReac	2,529,311,215	реагент
ледяная уксусная кислота	SIGMA	71251	реактив
Goat-anti-Rat-HRP	Agilent	DAKO P0448	антитело
гематоксилин	DIAPATH	C0303	реактив
LEICA Rotary microtome (RM2255)	Leica	RM2255	оборудование
Ly6g (клон 1A8)	BD Biosciences	551459	антитела
Mercury II Oxide	SIGMA	203793	реактив
Omnis Clearify Clearing Agent	DAKO	CACLEGAL	реактив
Omnis EnVision Flex TRS	DAKO	GV80011-2	реактив
Orange G	SIGMA	O3756	реактив
Парафин	Реактив Sakura	7052
Peloris	LEICA		оборудование
Percoll	SIGMA	P4937	реактив
RPMI 1640 без L-глютамина	Microgem	L0501-500	реактив
STS020	Leica		оборудование
Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette	SAKURA	7022	оборудование
Файенс-Тек Автоматизированный заделщик парафинов	Сакура		оборудование
Xylene	J.T.Baker	8080.1000	реагент