Методическая статья

Изоляция, виртуализации и анализа внеклеточного микроРНК от мезенхимальных стволовых клеток человека

DOI:

10.3791/58655

⸱

8 марта 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Interdisciplinary Nanoscience Centre, Aarhus University, 2Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол показано, как очистить внеклеточного микроРНК носителя культуры клеток для малых РНК библиотеки строительных и следующего поколения последовательности. Чтобы позволить читателям понять, чего ожидать при работе с низкой ввода образцы как exRNAs описаны различные контрольно-пропускные пункты контроля качества.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внеклеточные и циркулирующего РНК (exRNA) производятся многие типы клеток организма и существуют в многочисленных телесных жидкостей, таких как слюна, плазмы, сыворотки, молоко и мочи. Одно подмножество этих молекул РНК являются посттранскрипционного регуляторы – микроРНК (интерферирующим). Разграничить адаптивной, производимых типов конкретных клеток, в пробирке культуры системы могут использоваться для сбора и профиль exRNAs, полученных от одного подмножество ячеек. Выделяется факторы мезенхимальных стволовых клеток вовлечены в облегчении многочисленных заболеваний и используется как в пробирке модель системы здесь. Этот документ описывает процесс сбора, очистки малых РНК и библиотека поколения внеклеточного интерферирующим последовательности. ExRNAs от культуры средств массовой информации отличаются от клеточной РНК, будучи низкий входной образцов РНК, которая вызывает для оптимизации процедур. Этот протокол обеспечивает полное руководство для малых exRNA последовательности носителя культуры, показаны контрольно-пропускные пункты контроля качества на каждом этапе во время exRNA очистки и последовательности.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внеклеточные и циркулирующих РНК (exRNAs) в различных жидкостях и устойчивы к полиадениновый1,2. Их многочисленность, стабильность и легкость доступа являются привлекательными для клинической оценки как диагностические и прогностические маркеры3. Режим транспорта для exRNAs включают внеклеточного везикулы (EVs), ассоциации с липопротеинов (например липопротеидов высокой плотности; HDL) и рибонуклеопротеида комплексы (такие как с Argonaute2 комплексами)4.

Подмножество exRNAs являются микроРНК (интерферирующим), которые являются небольшие некодирующих РНК из около 22 nt, которые регулируют экспрессию генов посттранскрипционного. Экс адаптивной были причастны к ячейке коммуникации и регуляции гомеостаза клетки5. К примеру, HDL поставляет экс мир-223 эндотелиальных клеток для подавления Межмицеллярная молекула 1 (ICAM-1) и воспаление6. Интересно, что мир-223 рассматривается также перевозимых на внеклеточные везикулы легких раковых клеток, программирование их брать на более инвазивных фенотип7из лейкоцитов. Таким образом транскриптом экс адаптивной различных телесные жидкости и клетки культуры среднего значительно улучшит наше понимание экс miRNA сигнализации.

Некодирующие РНК последовательности (seq малых РНК) является мощным инструментом, который может использоваться для понимания transcriptomics малых РНК. Не только можно сравнить различные образцы среди дифференциально выразил известный РНК, но Роман малых РНК также могут быть обнаружены и характерны. Следовательно это также надежный метод идентификации дифференциально выраженной интерферирующим при различных условиях. Однако одна из трудностей малых РНК seq является трудность в создании малых РНК seq библиотек из низких exRNA ввода жидкостей, таких как спинномозговой жидкости, слюна, моча, молока, сыворотки и культуры средств массовой информации. TruSeq малые РНК библиотека Prep протокол от Illumina требует примерно 1 мкг высокого качества всего РНК и протокол NEBNext малых РНК библиотека Prep набор из Новой Англии Biolabs требует 100 нг-1 мкг РНК8,9. Зачастую всего РНК из этих образцов находятся ниже предела обнаружения для обычных-УФ Вид спектрофотометры.

Экс адаптивной производным от жидкостями являются потенциально хорошие диагностических и прогностических маркеров. Однако чтобы изучить функциональные последствия или определить происхождение конкретных экс адаптивной, клетки культуры системы часто используются вместо этого. Мезенхимальных стволовых клеток (МСК) были изучены широко потому, что их EVs были вовлечены в облегчении многих заболеваний, включая инфаркт миокарда, болезни Альцгеймера и трансплантат против принимающей болезни10. Здесь мы демонстрируем очистки экс адаптивной из костного мозга, полученных MSCs (BMSCs) и конкретные шаги, используемые для оптимизации малых РНК библиотека строительства, последовательности и анализ данных (рис. 1).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: Средство роста мезенхимальных стволовых клеток (MSC СМИ) готовится заранее, как указано в Таблице материалов.

1. клеточная культура

Примечание: Можно получить мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга, жировой ткани или других источников11. Кроме того использования могут быть куплены через поставщика. BMSCs, используемые в настоящем протоколе были получены из костного мозга пациентов и купил от компании.

  1. Размораживание 1 х 106 BMSCs в T175 колбу, содержащий 20 мл MSC средств массовой информации. Инкубировать клетки при 37 ° C с 5% CO2 и заменить средства массовой информации каждые 2-3 дня до 80% confluency.
  2. Вымыть клетки с 5 мл ПБС и отбросить PBS.
  3. Отсоединить клетки, добавив 5 мл 0,05% трипсина-ЭДТА и инкубации клеток для 5 минут при 37 ° C. Постучите по стенкам колбы для облегчения отряда.
  4. Добавляют 15 мл MSC СМИ инактивирует трипсина, отсоединить клетки от поверхности и пипетки вверх и вниз, чтобы получить одну ячейку суспензий.
  5. Соберите клетки в 50 мл трубки и спин вниз на 5 мин на x 300 g Пелле клетки.
  6. Ресуспензируйте клеток в 1 мл MSC СМИ и подсчитать количество ячеек с помощью Горяева.
    Примечание: Основная костного мозга человека MSCs на 80% confluency в T175 колбу — около 2 х 106 клеток.
  7. Использования плиты в 2000 клеток/см2 свежих MSC СМИ в 5 T175 колбы. Рост клеток при 37 ° C с 5% CO2 и заменить средства массовой информации каждые 2-3 дня до получения 5 флакон фляги вырожденная T175 90%.

2. EVs и РНК связанные биомолекул коллекции

Примечание: EV коллекции СМИ готовится заранее (средний [DMEM] Дульбекко изменение орла с плода бычьим сывороточным [FBS] 10% и 1% пенициллина/стрептомицина [P/S]). EV коллекции СМИ является нормальной MSC СМИ, но приготовленные коммерческих EV-истощены FBS (Таблица материалов). Это позволяет избежать крупного рогатого exRNA загрязнения от FBS, который обычно содержит exRNAs, связанные с EVs, ribonucleoproteins и липопротеинов. Для малых РНК библиотека подготовки exRNAs, производного от 5 вырожденная колбы MSCs необходимы для включения библиотеки строительство.

  1. Вымыть клетки 3 x с 20 мл PBS на T175 колбу. Добавить 20 мл EV коллекции средств массовой информации за вырожденная T175 флакон MSCs и инкубировать при 37 ° C с 5% CO2 в течение 48 часов.
  2. Сбор средств массовой информации и центрифуги СМИ за 10 мин на 300 x g и 4 ° C.
  3. Собирать супернатант и центрифуги СМИ за 20 минут, 2000 x g и 4 ° C.
  4. Собирать супернатант и центрифуги СМИ за 30 мин на 15500 x g и 4 ° C. Затем собирают супернатант.
  5. Средства массовой информации передавать ультрацентрифуга трубы и Пелле exRNAs 90 мин 100 000 x g и 4 ° C. Здесь используется фиксированный угол ротора и гранулы, привязанный к стороне трубки. Марк на стороне крышки и нарисуйте круг на стороне трубки, где ожидается гранулы.
  6. Удалить супернатант, сухой внутри трубки, инвертирование трубку на абсорбирующий бумаги и использовать небольшие кусочки фильтровальной бумаги для удаления жидкости внутри трубки не касаясь в нижней части трубки. Ресуспензируйте гранулы в 200 мкл PBS, vortexing для 30 s и закупорить вверх и вниз 20 x.
  7. Оценить EVs и биомолекул с наночастиц, отслеживания анализа (НТА) (Рисунок 2).
    Примечание: EVs и биомолекул можно оценить с наночастиц, отслеживания, анализа (НТА), Динамическое рассеяние света (DLS) или передачи электронной микроскопии (ТЕА)12.
  8. Храните EVs и биомолекул на-80 ° C до далее вниз по течению экспериментов.
    Примечание: Если EVs будет использоваться для функциональных исследований, 20% глицерина необходимо добавить для их защиты от разрыва. Клетки могут быть собраны с помощью стандартных процедур, в случае необходимости.

3. EVs и РНК связанные биомолекул коллекции дифференцированных клеток

Примечание: EVs и РНК связанные биомолекул также может быть собраны из СМИ культуры клеток, в то время как клетки проходят дифференциацию. Пример, изображенные в протоколе описывает osteoblastic дифференциация и exRNA коллекции в день 0 и 7 дифференциации. Если различие не требуется, пропустите раздел 3 и перейдите к разделу 4.

  1. Подготовить osteoblastic дифференциация СМИ (DMEM с 10% FBS, 1% P/S, β-Глицерофосфат 10 мм, 10 Нм дексаметазон, 50 мкм аскорбат-2-фосфат и 10 мм 1,25 витамин D3) свежий каждый раз.
  2. После того как MSCs 80% притока, измените СМИ MSC osteoblastic дифференциация СМИ.
  3. Пополнение osteoblastic дифференциация СМИ после 2-3 дня.
  4. На 5 день дифференциации, удалите средства массовой информации и вымыть клетки 3 x с 20 мл PBS на T175 колбу.
  5. Добавить 20 мл EV коллекции сред, содержащих 10 мм β-метронидазол, 10 Нм дексаметазон, 50 мкм аскорбат-2-фосфат и 1,25 витамин D 10 мм3 за вырожденная T175 флакон MSCs. инкубировать клетки при 37 ° C с 5% CO2 в течение 48 часов обеспечить продолжение дифференциация во время сбора EVs и биомолекул.
  6. Сбор средств массовой информации на 7 день и перейти к изоляции EVs и биомолекул, как описано в шагах 2.2-2.6.
  7. Для контроля качества семян клетки в 96-колодцев или скважин-6 для оценки дифференцировки, используя assay активность щелочной фосфатазы (ALP) или с количественных полимеразной цепной реакции (ПЦР), соответственно.
    Примечание: На рисунке 3 является пример, показывающий Остеогенные дифференцировки клеток.

4. РНК добыча и контроль качества

  1. Оттепель образцы из шага 2.8 на льду. Извлечь РНК с помощью комплекта изоляции РНК (Таблица материалов).
  2. Элюировать РНК из столбца комплекта изоляции РНК (Таблица материалов) в 100 мкл РНКазы свободной воды.
  3. Концентрат РНК через этанола осадков, добавив 1 мкл гликогена, 10 мкл 2 М-рН 5,5 натрия ацетата и 250 мкл предварительно охлажденные 99% этанола в 100 мкл очищенный РНК.
  4. Проинкубируйте образцы при-20 ° C на ночь, чтобы осадить РНК. Пелле РНК центрифугированием на 20 мин в 16000 x g и 4 ° C.
    Примечание: Гранулы белого вследствие совместного осадков с гликогена.
  5. Удалить супернатант и помыть лепешка РНК с 1 мл 75% этанола. Пелле РНК снова за 5 мин на 16000 x g и 4 ° C.
  6. Удаление этанола и оставьте крышку трубки РНК открытой для 5-10 мин в воздух сухой Пелле РНК. Ресуспензируйте Пелле РНК в 7 мкл РНКазы свободной воды.
  7. Проверьте качество РНК и концентрации с помощью чип основе капиллярного электрофореза машины для определения РНК по данным производителя протокола до начала строительства библиотеки.
    Примечание: Представитель размер распределение РНК показано на рисунке 4.
  8. Экстракт клеточной РНК, при необходимости, с комплектом коммерческой очистки (Таблица материалов).

5. Библиотека строительство и контроль качества

Примечание: Малые РНК библиотеки построены с использованием коммерческих комплекты (Таблица материалов) с изменениями из-за низкой РНК ввода. Строительство библиотеки выполняется на блоке охлажденной.

  1. Chill Отопление блока для 0.2 мл ПЦР пробирок на льду и Пипетка 5 мкл РНК из шага 4.6 в 0,2 мл, RNase бесплатно ПЦР трубы на блоке охлажденной.
  2. Разбавьте 3' адаптеры (1:10) в РНКазы свободной воде в ПЦР-пробирку 0,2 мл, RNase бесплатно. Добавить 0,5 мкл разбавленного адаптер и смешать с 5 мкл РНК, закупорить вверх и вниз 8 x и центрифуги кратко, чтобы собрать все жидкости в нижней части трубки.
  3. Инкубировать структуре РНК и 3' адаптер при 70 ° C в течение 2 минут в разогретой тепловая велосипедист и затем поместите образец обратно на блоке охлажденной.
  4. Добавьте 1 мкл буфера перевязки, 0.5 мкл битор РНКазы и 0,5 мкл T4 РНК лигаза (удаление мутант) в РНК и 3' адаптер смесь. Смешать, закупорить вверх и вниз 8 x и центрифуги кратко.
  5. Инкубируйте трубки на 28 ° C в течение 1 ч в разогретой тепловая велосипедист.
  6. Добавить 0,5 мкл раствора стоп в пробирку образца с трубки, оставаясь в тепловая велосипедист, смешивать, закупорить вверх и вниз 8 x и продолжать Инкубируйте на 28 ° C в течение 15 мин.
  7. Разбавьте 5' адаптеры (1:10) в РНКазы свободной воде в ПЦР-пробирку 0,2 мл, RNase бесплатно. Добавить 0,5 мкл 5' адаптер в отдельный бесплатно РНКазы 0.2 мл ПЦР-пробирку, тепла 5' адаптер при 70 ° C в течение 2 минут в разогретой тепловая велосипедист и затем поместите образец на блоке охлажденной.
  8. Добавить 0,5 мкл 10 Нм АТФ, 0.5 мкл лигаза РНК T4 адаптер трубы 5', смешивать, закупорить вверх и вниз 8 x и центрифуги кратко собрать все жидкости в нижней.
    Примечание: Держите адаптер 5' на охлажденные блок как можно больше.
  9. Добавление в 1,5 мкл смеси адаптер 5' от шаге 5.6 и очень осторожно перемешать путем дозирования 8 x медленно. Проинкубируйте образцы на 28 ° C в течение 1 ч в разогретой тепловая велосипедист.
  10. Разбавьте RT грунтовка 1:10 в РНКазы свободной воде в свободной РНКазы ПЦР-пробирку 0,2 мл. Добавить 0,5 мкл разбавленного RT грунтовки в выборку из шага 5.9, смесь очень мягко, закупорить вверх и вниз 8 x медленно и центрифуги кратко.
  11. Инкубировать образца при 70 ° C в течение 2 минут в разогретой тепловая велосипедист и затем поместите образец на охлажденные блока.
  12. Добавьте 1 мкл 5 x первая прядь буфера, 0.5 мкл 12,5 мм dNTP смеси, 0.5 мкл 100 мм Дитиотреитол (DTT), 0.5 мкл битор РНКазы и 0,5 мкл обратной транскриптазы. Очень осторожно перемешать, закупорить вверх и вниз 8 x медленно и центрифуги кратко.
  13. Инкубируйте образца на 50 ° C в течение 1 ч в разогретой тепловая велосипедист получать cDNA.
  14. Добавление 4.25 мкл ультрачистая вода, 12,5 мкл, комплекса ПЦР, 1 мкл индекс грунта и 1 мкл Универсальный грунт в cDNA. Смешать, закупорить вверх и вниз 8 x и центрифуги кратко.
  15. Поместите образец в тепловая велосипедист и настройте циклователь следующим: 98 ° C за 30 сек; 15 циклов 98 ° c 10 сек, 60 ° C за 30 s и 72 ° C для 15 s; и в конце цикла с 72 ° C для 10 мин.
    Примечание: Подготовленные библиотека может храниться при температуре-20 ° C на одну неделю.
  16. Очистить библиотеки РНК, отделив библиотеки на ДНК гель и резки гель (гель извлечение) между 140 bp и 160 bp и элюирующие библиотеки из геля после протокол, предоставляемые библиотека строительства комплект.
    Примечание: В этом исследовании, подготовленный библиотеки из шага 5.15 загружается на коммерческих гель (Таблица материалов) и библиотека между 140 bp и 160 bp, очищается от автоматизированных фракционатор размер ДНК (Таблица материалов) согласно Протокол от производителя.
  17. Сосредоточиться и мыть библиотеки из шага 5.16 с использованием комплекта очистки на основе столбцов ПЦР (Таблица материалов) и наконец элюировать библиотеки в 10 мкл РНКазы свободной воды.
  18. Загрузите 1 мкл очищенный библиотеки в микросхему ДНК (Таблица материалов) для проверки размера библиотеки после производителя протокол.
  19. Разбавьте 1 мкл очищенный библиотеки (1: 1000) в 10 мм pH 8.0 трис-HCl с 0,05% Полисорбат 20 и количественно библиотеки, используя набор для количественной оценки коммерческая библиотека для количественного определения концентрации Библиотека, с использованием стандартов ДНК в комплект ПЦР.
  20. Бассейн равное количество библиотек согласно требованиям машины последовательность и последовательность на систему виртуализации высокой пропускной способности.
    Примечание: Библиотека строительство клеточной РНК может быть сделано с использованием же наборы, следуя стандартным протоколом комплектов.

6. Биоинформатика конвейер

Примечание: Это внутренний конвейер и программы, используемые здесь перечислены в таблица материалов.

  1. Trim от низкого качества чтения и удалите адаптер последовательности из сырья читает.
  2. Сопоставьте чистой читает различные виды РНК.
    1. Аннотируйте tRNAs, позволяя два несоответствия, потому что сильно измененной последовательности tRNA вызывают частые базовый misincorporation, обратной транскриптазы.
    2. Аннотируйте интерферирующим путем сопоставления для человека интерферирующим от miRBase v21, позволяя нулевой несоответствия. Так как интерферирующим подлежат A и U nontemplated 3' конца дополнений, последовательности, которые не являются 3', обрезается до трех A и/или T НТС, после чего читает сопоставляются человека адаптивной и другие интерферирующим от miRBase v21, позволяя нулевой несоответствия.
    3. Аннотации для других соответствующих малых РНК (мяРНК, snoRNA, Пирна и Y РНК), позволяя одно несоответствие.
    4. Карта оставшихся несопоставленные читает длинные наборы РНК (рРНК, других РНК от Rfam и мРНК) для оценки степени деградации.
    5. Аннотируйте последовательности генома человека.
    6. Аннотируйте последовательности для бактериальных геномов.
    7. Нормализовать Мирна выражение, используя следующую формулу: Мирна подсчитывает / общая подсчитывает все сопоставленные интерферирующим) x 106.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метод, описанный в настоящем Протоколе оптимизирован для сбора exRNA от MSC культуры для следующего поколения последовательности. Общая схема рабочего процесса на рис. 1 на левой стороне и соответствующего контроля качества контрольно-пропускные пункты на право.

Морфология клеток в день сбора для недифференцированные (Рисунок 3А) и дифференцированной (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем протокол для следующего поколения последовательности exRNAs, который позволяет анализ дифференциального выражение от низкого входного образцов. Придерживаясь определенных протоколов для изоляции EV и exRNA важно, потому что даже небольшие изменения (например, шаг ultracentrifugation или изменения в тип ротора) могут влиять транскриптом и Мирна уровнях13,14. Таким образом независимо от того, как exRNA изолирован, важно применить ту же процедуру ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарны г-н Клаус автобус и г-жа Рита Rosendahl на iNANO за их технической помощи. Особая благодарность д-р Даниэль Otzen позволяя нашим частым использованием его ультрацентрифугирования. Это исследование было поддержано в инновационный фонд Дании (MUSTER проекта).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Мезенхимальные стволовые клетки, полученные из костного мозгаATCCPCS-500-012Клетки, используемые в этом протоколе, были куплены у ATCC
MSCGM BulletKitLonzaPT-3001Называется как среда для роста мезенхимальных стволовых клеток (MSC media)
Истощенный экзосомами FBSGibcoA2720801
среда для сбора ExRNA: MSCGM, но с заменой FBS на FBS
Трипсин-ЭДТАGibco25200056
T175 КолбаSarstedt833,912
Пенициллин-стрептомицинGibco15140122
фосфатный буферный физиологический растворСигма806552
ультрацентрифугиBeckman Coulter
Поликарбонатная бутылка с крышкой в сбореBeckman Coulter355618
Beckman Coulter Type 60 TiRotor использован здесь
NucleoCounterChemometecNC-3000Cell Counter
β-глицерофосфатCalbiochem35675Компоненты остеогенной дифференцировочной среды
ДексаметазонSigmaD4902-25MGКомпоненты остеогенных дифференцировочных сред
2-Фосфо-L-аскорбиновая кислота  кислота тринатриевая сольSigma49752-10GКомпоненты остеогенных дифференцировочных сред
1&альфа;,25-дигидроксивитамин  D3SigmaD1530-1MGКомпоненты остеогенной дифференцировочной среды
miRNeasy Mini KitQiagen217004набор для очистки микроРНК и общей РНК для этапа 4.8
Agilent RNA 6000 Pico KitAgilent Technologies5067-1514Машина для капиллярного электрофореза на основе чипов и чипов для анализа РНК и ДНК
Agilent 2100 БиоанализаторAgilent TechnologiesG2939BAАппарат для капиллярного электрофореза на основе чипов и чипы для анализа РНК и ДНК
Agilent High Sensitive DNA KitAgilent Technologies5067-4626Аппарат для капиллярного электрофореза на основе чипов и чипы для анализа РНК и ДНК
KAPA Наборы для количественного определения библиотеки KAPARocheKK4824Используемый здесь набор для количественного определения библиотеки
TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Набор A (24 rxns) (Набор A: индексы 1-12)IlluminaRS-200-0012Набор для подготовки к выбору библиотеки малых РНК, используемый в этом протоколе - используется в шаге 5
Pippin PrepSage ScienceАвтоматизированный экстрактор геля ДНК, используемый в этом протоколе; ручная экстракция также может быть выполнена
MinElute PCR Purification KitQiagen28004PCR очистка на шаге 5.17
FASTX_ToolkitCold Spring Harbor LabОбрезка некачественных прочтений на этапе 6
cutadaptУдаление адаптера на шаге 6
Галстук-бабочкаСопоставление чистых прочтений на шаге 6
SamtoolsСоздание профиля выражения на шаге 6
BedtoolsСоздание профиля выражения на шаге 6
с истощением экзосом.

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. The complexity, function and applications of RNA in circulation. Frontiers in Genetics. 4, 115(2013).
  2. Koberle, V., et al. Differential Stability of Cell-Free Circulating microRNAs: Implications for Their Utilization as Biomarkers. Plos One. 8 (9), e75184(2013).
  3. Anfossi, S., Babayan, A., Pantel, K., Calin, G. A. Clinical utility of circulating non-coding RNAs - an update. Nature Reviews Clinical Oncology. , (2018).
  4. Li, K., et al. Advances, challenges, and opportunities in extracellular RNA biology: insights from the NIH exRNA Strategic Workshop. JCI Insight. 3 (7), (2018).
  5. Turchinovich, A., Samatov, T. R., Tonevitsky, A. G., Burwinkel, B. Circulating miRNAs: cell-cell communication function. Frontiers in Genetics. 4, 119(2013).
  6. Tabet, F., et al. HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells. Nature Communications. 5, 3292(2014).
  7. Zangari, J., et al. Rapid decay of engulfed extracellular miRNA by XRN1 exonuclease promotes transient epithelial-mesenchymal transition. Nucleic Acids Research. 45 (7), 4131-4141 (2017).
  8. Illumina. TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 Support Input Requirements. , Available from: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html (2018).
  9. NEB. NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina Set 1, Set 2, Index Primers 1–48 and Multiplex Compatible Instruction Manual. , Available from: https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf (2018).
  10. Heldring, N., Mager, I., Wood, M. J. A., Le Blanc, K., Andaloussi, S. E. L. Therapeutic Potential of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells and Their Extracellular Vesicles. Human Gene Therapy. 26 (8), 506-517 (2015).
  11. Ullah, I., Subbarao, R. B., Rho, G. J. Human mesenchymal stem cells - current trends and future prospective. Bioscience Reports. 35 (2), (2015).
  12. Szatanek, R., et al. The Methods of Choice for Extracellular Vesicles (EVs) Characterization. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), (2017).
  13. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945(2016).
  14. Van Deun, J., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
  15. Raabe, C. A., Tang, T. H., Brosius, J., Rozhdestvensky, T. S. Biases in small RNA deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42 (3), 1414-1426 (2014).
  16. Reza, A. M., Choi, Y. J., Yasuda, H., Kim, J. H. Human adipose mesenchymal stem cell-derived exosomal-miRNAs are critical factors for inducing anti-proliferation signalling to A2780 and SKOV-3 ovarian cancer cells. Scientific Reports. 6, 38498(2016).
  17. Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
  18. Asghar, M. T., et al. Sphingomonas sp is a Novel Cell Culture Contaminant. Journal of Cellular Biochemistry. 116 (6), 934-942 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи