Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Дифференциация стволовых клеток нерва по одношаговый атмосферной плазмы лечение в пробирке

6.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/58663

⸱

11 января 2019 г.

 ,  , 
1State Key Laboratory of Advanced Electromagnetic Engineering and Technology, Huazhong University of Science and Technology, 2College of Life Science and Health, Wuhan University of Science and Technology, 3Department of Pathophysiology, Beijing Neurosurgical Institute/Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол направлен на обеспечение подробные экспериментальные шаги для лечения холодной плазмы атмосферного нервных стволовых клеток и обнаружение иммунофлюоресценции для дифференциации повышение.

Аннотация

Как развитие физической плазменной технологии, холодный атмосферной плазмы (CAPs) широко исследованы в дезактивации, лечение рака, заживление ран, лечение корневых каналов, и т.д., формируя новое поле исследований имени плазмы медицины. Будучи смесью электрические, химические и биологические реактивных видов, шапки показали свои способности активизировать дифференцировки стволовых клеток нерва как в пробирке и в естественных условиях и являются становится перспективным способом для лечения неврологических заболеваний в будущем. Гораздо более интересные новости, что с помощью шапки может реализовать один шаг и безопасно направлены, дифференцировка нервных стволовых клеток (NSCs) для перевозки ткани. Мы демонстрируем здесь подробный экспериментальный протокол с помощью самодельное устройство CAP струи для повышения НСК дифференциации в C17.2-NSCs и первичных крыса нервные стволовые клетки, а также наблюдения за судьбу клеток, Перевернутый и микроскопии флуоресцирования. С помощью иммунофлюоресценции, окрашивание технологии мы обнаружили, как NSCs, показал ускоренными темпами дифференциальных чем группе необработанных и ~ 75% NSCs выборочно дифференцированной в нейроны, которые в основном пожилые, холинэргические и мотор нейроны.

Введение

Направленного дифференцирования NSCs в определенной линии для транспортировки ткани считается одним из самых перспективных терапии нейродегенеративных и neurotraumatic заболеваний1. К примеру catecholaminergic дофаминергические нейроны особенно желательны в лечении болезни Паркинсона (PD). Однако традиционные методы подготовить нужные ячейки для перевозки имеют много недостатков, таких как химическая токсичность, рубцов или другие, которые во многом препятствует приложения NSCs в регенеративной медицине2. Таким образом это очень необходимо найти Роман и безопасный способ для дифференциации НСК.

Плазма это четвертый состояние вопросы, следующие твердых, жидких и газовых, и он составляет более 95% вопросов во всей Вселенной. Плазмы электрически нейтрален с несвязанных позитивных/негативных и нейтральных частиц и обычно генерируется высоковольтного разряда в лаборатории. В последние два десятилетия применение плазмы в биомедицине привлекает огромное внимание во всем мире как развития технологии холодного атмосферного давления, плазмы. Благодаря этой технике стабильной низкотемпературной плазмы могут создаваться в окружающий воздух в атмосферу без образования дуги и состоит из различных реактивных видов, таких как химически активные разновидности азота (RNS), реактивнооксигенных видов (ров), ультрафиолетового (УФ) излучения, электроны, ионы и электрическое поле3. Кепки имеют уникальные преимущества для инактивации микроорганизмов, лечение рака, ранозаживляющее, лечение кожных заболеваний, пролиферации и дифференцировки клеток4,5,6,7. В предыдущей работе мы продемонстрировали, что холодной атмосферы плазменной струи может повысить дифференциация NSCs в мышиных нервных стволовых клеток C17.2 (C17.2-NSCs) и первичной крыса нервные стволовые клетки, выставке большой потенциал, чтобы стать мощным инструментом для направленного дифференциация NSCs8. Хотя механизм повышения CAP НСК дифференциации полностью не поняли еще, NO, порожденных шапки доказано, чтобы быть ключевым фактором в процессе. В этой работе, мы стремимся предоставить подробный экспериментальный протокол использования атмосферное давление гелиево кислородную плазменной струи для лечения NSCs в пробирке, подготовка клетки и предварительной обработки, морфология наблюдение с помощью инвертированного микроскопа, и флуоресценции наблюдение микроскопии иммунофлуоресценции пятнать.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. сотовый культур и Predifferentiation

  1. Культура нервных стволовых клеток и predifferentiation
    1. Подготовьте поли D-лизин покрытием coverslips. Стерильные coverslip (20 мм в диаметре) положите в тарелку 12-Ну. Слой покрытия стекла с поли D-лизин, 0.1% w/v, в воде (Таблица материалов) для улучшения адгезии клеток на coverslips, выполнив следующие шаги.
      Примечание: Оптимальные условия должны быть определены для каждой ячейки строки и приложения.
      1. Асептически пальто поверхности coverslip с поли D-лизин, 0.1% w/v, в воде. Рок мягко обеспечить ровное покрытие поверхности coverslip.
      2. После культивирования на ночь (~ 12 ч) при 37 ° C, удалить раствор поли D-лизин и промыть поверхность 3 x с 1 мл стерильной воды.
      3. Сухие клетки по крайней мере 30 мин перед посевом их.
  2. C17.2 (C17.2-НСК) культура мышиных нервных стволовых клеток и predifferentiation
    1. Инкубируйте C17.2-NSCs в колбу 25 см2 в среде Дульбекко изменение орла (DMEM) дополнены плода бычьим сывороточным (ФБС) 10%, 5% лошадь сыворотки (СС) и 1% пенициллина/стрептомицина при 37 ° C и 5% CO2 ~ 2-3 d.
    2. Когда клетки достигает 85% слияния, извлеките носитель, вымыть клетки с 1 мл раствора PBS и добавьте 1 mL свежих трипсина (0,25%) в колбу. Оставьте его в течение 1 мин; Затем добавьте 1 мл питательной среды в колбу и пипетки вверх и вниз несколько раз, чтобы обеспечить одну ячейку подвеска.
    3. Граф плотность клеток в суспензии с помощью Горяева. Рассчитайте необходимый объем суспензии клеток дать окончательный клетки концентрация 2 х 104 клеток/мл.
    4. Семя C17.2-NSCs на с покрытием coverslips в 12-ну пластины с плотностью ~ 2 x 10-4 клетки на хорошо. Проверьте плотность клеток под микроскопом.
      Примечание: Для лучшего результата, плотность оптимальной клеток должен быть определен перед иммунофлюоресценции эксперимент.
    5. Инкубируйте клетки при 37 ° C в ячейке инкубатор для 12 h для вложения.
    6. После вложения, вымыть клетки 2 x с 1 мл раствора PBS и культивировать клетки с дифференциации среднего, состоящий из DMEM/F12 с 1% N2 доплата за 48 ч до плазменной обработки.
  3. Основная крыса нервных стволовых клеток культуры и predifferentiation
    1. Культура первичной крыса НСК подвеска в крыса НСК среднего роста в неглазированные T25 колбы на плотности тарелок 5 x 105 клеток.
      Примечание: Основная крыса NSCs были изолированы после протокол СЕ и др. 9.
    2. Проверьте формирования neurospheres под инвертированным микроскопом. Убедитесь, что морфология neurospheres экспонатов сферических и прозрачной многоклеточных комплексов.
    3. Когда neurospheres достигают диаметра 3 мм или более, передать стерильных пластиковых пробирок 15мл нейросферы подвеска и пусть neurospheres урегулировать самотеком.
    4. Удалите супернатант тщательно, чтобы оставить neurospheres в минимальный объем среднего.
    5. Промыть neurospheres 1 x с 5 мл PBS и пусть neurospheres урегулировать самотеком. Удалите супернатант оставить минимальный объем PBS.
    6. Добавление подходящих тома дифференциации среды для настройки плотности клеток к neurospheres ~ 12-15 на миллилитр. Средством дифференциации первичных крыса NSCs состоит из DMEM/F12, 2% B27 и 1% FBS.
    7. 1 мл суспензии нейросферы на каждый с покрытием coverslip в пластине 12-ну семян.
      Примечание: Shake пластину осторожно, чтобы обеспечить равномерное распределение neurospheres. Этот шаг очень важен для лучшего результата иммунофлюоресценции.
    8. Установите пластину в инкубаторе и позволить ему predifferentiate за 24 ч до плазменной обработки.

2. Подготовка плазменной струи

  1. Выбор, половина открытый кварцевые трубки с внутренним диаметром 2 мм и наружным диаметром 4 мм. вставить провод высокого напряжения с диаметром 2 мм в трубу.
  2. Вставьте кварцевая трубка с провод высокого напряжения в шприц 5 мл и используйте держатель смонтировать внутри центр шприца. Задайте расстояние между запечатанном конце кварцевая трубка и кончик шприца на 1 см.
  3. Подключите 1 м трубы резиновые силиконовые (с внутренним диаметром 12 мм) к открытый конец шприца и, затем, подключите его к расходомера и газовый клапан в последовательности.

3. приобретение самолетов

  1. Соедените цепь по схеме, как показано на рисунке 1. Подключите выходной провод питания к устройству плазменной струи и, затем, подключите кончик зонда высокого напряжения с выходной провод для обнаружения напряжения. Подключите другой конец зонда высокого напряжения к осциллографу для записи информации выходного напряжения. Проверка всей цепи и убедитесь, что блок питания, осциллограф и высокого напряжения зонда обоснованы.
  2. Проверьте газовой линии. Убедитесь, что трубки газа был подключен к устройству плазменной струи; открыть клапан газового гелия (объёмная, 99,999%) и кислорода (объёмная, 99,999%) затем установите поток газа 1 L:0.01 Л/мин (2он: O).
    Примечание: Пусть потока газа на несколько минут перед включением питания в первый раз.
  3. Значение амплитуды импульса, частоту и длительность импульса как 8 кв, 8 кГц и 1600 ns, соответственно. Проверка цепи снова и, затем, включите кнопку Выход для создания плазменной струи.
    Предупреждение: Не касайтесь провод высокого напряжения в любое время.

4. Плазменная обработка нервных стволовых клеток

  1. Задайте расстояние между сопло шприц и хорошо отверстие клеток до 15 мм.
    Примечание: Расстояние измеряется от нижней части платформы, где 12-ну пластина помещается.
  2. 12-ну пластины из инкубатора и изменить среднего predifferentiated клеток до 800 мкл свежие дифференциации среднего.
  3. Ячейки можно разделить на три группы: группу управления необработанными, 60 s он и O2 (1%) газ потока лечения группу и группу лечения плазмы 60 s.
    Примечание: Существует нет очевидно жидких потери при условии обращения.
  4. Место пластину 12-ну под плазменной струи, убедитесь, что сопло шприц фиксируется в центре каждого отверстия и дать соответствующие обращения к различным группам, упомянутым на шаге 4.3.
    Примечание: Необработанные элементы хранились в дифференциации среднего при комнатной температуре в ходе экспериментальной процедуры для обеспечения единообразного толкования условий. Группе лечения потока газа2 (1%) он и O лечили только он и потока газа O2 (1%), без создания плазмы. Все процедуры должны выполняться в трех экземплярах.

5. нейронные стволовых клеток

  1. После лечения удалите самобытную культуру и добавьте 1 mL новой дифференциации среднего для каждой скважины.
  2. Инкубировать клетки в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2 на 6 d. изменить носитель каждый день.
  3. Проверьте статус дифференциации различных групп ежедневно под Перевернутый фазово контрастной световой микроскоп. Случайным образом выбрать поля, по меньшей мере 12 и снимать фотографии для записи морфологических изменений.

6. иммунофлюоресценции пятнать

  1. Промывка
    1. Взять образцы из инкубатора клеток и удалите среды путем аспирации. Промойте клетки 1 x с 1 мл раствора PBS.
      Примечание: После дифференциации, клетки легко отсоединяется. Это необходимо для добавления PBS со стороны культуры скважин, чтобы избежать смывания клетки.
  2. Фиксация
    1. Исправьте клетки с 500 мкл параформальдегида 4% в течение 20 минут при комнатной температуре. После фиксации, Осторожно промойте клетки 3 x с 1 мл раствора PBS, 5 минут, чтобы удалить остаточные параформальдегида 4%.
      Примечание: Точка оптимальное время для фиксации клетки должен быть определен согласно типы клеток. После фиксации добавляют 1 мл PBS со стороны культуры скважин и оставить образец на столе за 5 мин. Не использовать лаборатории шейкер, чтобы обеспечить минимальные потери клеток.
  3. Permeabilization
    1. Разрушения образцов с 0,2% TritonX-100 в PBS 10 мин при комнатной температуре. После permeabilization промойте клетки мягко с 1 мл раствора PBS для три раза по 5 минут.
      Примечание: Точка оптимальное время для клеток permeabilization должна определяться согласно типы клеток. После permeabilization добавить 1 мл PBS со стороны культуры скважин, оставьте образец на столе за 5 мин. Не использовать лаборатории шейкер для обеспечения минимальной потери клеток.
  4. Блокировка
    1. Добавить 1 мл 10% козьего сыворотки в PBS для каждой выборки и оставить образец на столе за 1 ч до блокировать любые неспецифического взаимодействия.
      Примечание: Не используйте лаборатории шейкер, чтобы предотвратить отключение слайд из клетки. Ополаскивание не является необходимым на данном этапе.
  5. Инкубация с основного антитела
    1. Разбавьте основное антитело, используя основное антитело буфером для разбавления проб.
      Примечание: Для получения оптимальных результатов, коэффициент разрежения окончательного основного антитела должны определяться предтестовая. Коэффициентам разрежения по анти Нестин (для недифференцированных стволовых клеток), анти β-тубулина III (для нейрона), анти О4 (для Олигодендроциты), анти NF200 (для зрелых нейронов), анти чат (для холинергических нейронов), анти LHX3 (для двигательных нейронов), анти ГАМК (для ГАМК нейроны), анти серотонина (для серотонинергической нейроны) и анти й (для дофаминергические нейроны), 1:80, 1: 200, 1: 100, 1: 100, 1: 100, 1: 200, 1: 100, 1: 200 и 1: 100, соответственно.
    2. Применить 300 мкл разбавленного первичных антител к различных образцов.
    3. Проинкубируйте образцы клетки на ночь при 4 ° C.
      Примечание: Рекомендуется инкубировать первичных антител при 4 ° C для уменьшения фона и неспецифические пятнать.
    4. Удаление первичных антител и осторожно промойте клетки 3 x с 1 мл раствора PBS.
  6. Инкубация с вторичного антитела
    1. Разбавьте Cy3-конъюгированных или Alexa Fluor 488-конъюгированных вторичные антитела, с помощью 3% козьего сыворотки в PBS.
      Примечание: Для получения оптимальных результатов, коэффициент разрежения окончательный вторичные антитела должны определяться предтестовая.
    2. Примените 300 мкл соответствующих вторичных антител для обнаружения каждого основного антитела.
      Примечание: Все последующие шаги должны быть выполнены в темноте, чтобы предотвратить тушения флуоресценции.
    3. Инкубируйте образец клеток в темноте втечение 2 ч при комнатной температуре.
    4. Вторичные антитела снимите и промойте клетки мягко с 1 мл раствора PBS 10 мин при комнатной температуре.
  7. Ядерные пятнать
    1. Примените 500 мкл рабочего раствора Hoechst 33258 погрузить образец клеток.
    2. Инкубируйте образец клеток в темноте для 8 мин при комнатной температуре на этикетке ядер.
    3. Осторожно промыть клетки 3 x с 1 мл раствора PBS, 10 мин каждая, защищенном от света.
      Примечание: Для минимальной потери клеток, состояние оптимальный режим стирки необходимо определить эмпирически.
  8. Монтаж
    1. Поместите одну каплю монтажа средних в центре микрослайдовому.
    2. Возьмите из coverslips (с примерами) с помощью пинцета и осторожно поместите образец поверх средства монтажа. Избегайте воздушных пузырей.
    3. Удалите любые излишки монтажной среды с фильтровальной бумаги.
  9. Наблюдение микроскопии флуоресцирования
    1. Наблюдать за образцы под микроскопии флуоресцирования, оснащены фильтрами для Hoechst 33258, Alexa Fluor 488 и Cy3. Для каждого образца произвольно выберите по крайней мере 8-12 поля и записи изображения с камеры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Морфология клеток наблюдалось под инвертированным микроскопом каждый день после лечения Кап. Рисунок 2 показывает изображения обычных Перевернутый фазово контрастной световой микроскоп дифференцировки клеток в обоих клеточных линий. Плазма лечение группа экспонатов коэффициента ускорения дифференцировки и высокая дифференциация соотношение по сравнению с группой потока управления и газа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

C17.2-NSCs является своего рода увековечен нервных стволовых клеток линии от новорожденных мыши мозжечковой зернистый слой клеток, разработанный Снайдер и другие10,11. C17.2-NSCs могут дифференцироваться в нейронах, астроциты и Олигодендроциты и широко используются в неврологии12. В нашем предыдущем исследовании шапки может повысить дифференциация C17.2-NSCs в нейроны. Доказательство принципа было также проведено исследование с использован...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Хуажонге ученый программы, независимые инновационный фонд Huazhong университета науки и технологии (№ 2018KFYYXJJ071) и Фонд национального естественных наук Китая (№ 31501099 и 51707012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
CoverslipNEST801008
поли-D-лизинаBeyotimeP0128
DMEM mediumHyCloneSH30022.01Bхранится при 4 ° C
DMEM/F12 среднийHyCloneSH30023.01Bхранится при 4 ° C
N2 добавкаGibco17502048хранить при температуре -20°С; C и беречь от света
добавку В27Gibco17504044хранить при температуре -20°С; C и защитить от света
фетальную бычью сывороткуHyCloneSH30084.03хранить при -20°С; В, избегать многократного замораживания и размораживания
Донорская сыворотка для лошадейHyCloneSH30074.03поручена при -20°С; В, избегать многократного замораживания и размораживания
Пенициллин/СтрептомицинHyCloneSV30010хранить при температуре 4 °°С; C
TrypsinHyClone25300054хранить при температуре 4 °deg; C
PBS решениеHyCloneSH30256.01Bхранится при 4 ° C
4% параформальдегидаBeyotimeP0098при температуре -20°С; C
TritonX-100SigmaT8787
Нормальный козий сывороточный блокирующий растворVector LaboratoriesS-1000-20хранить при 4 ° C
анти-НестинBeyotimeAF2215хранился при -20 °°С; В, избегать повторного замораживания и размораживания
анти-&бета;-тубулин IIISigma AldrichT2200хранить при -20°С; C, избегайте повторного замораживания и размораживания
анти-O4R& D SystemsMAB1326храниться при температуре -20°С; В, избегать многократного замораживания и размораживания
анти-NF200Sigmaпри температуре -20°С; В, избегать многократного замораживания и размораживания
анти-ChATSigmaхранящейся при -20°С; В, избегать многократного замораживания и размораживания
анти- LHX3Sigmaпри хранении при -20 °°С; В, не допускать многократного замораживания и размораживания
анти-ГАМКСигмахранящейся при -20°С; C, избегайте повторного замораживания и размораживания
анти-серотонинаAbcam, Cambridge, MAпри температуре -20 °°; C, избегайте повторного замораживания и размораживания
анти-THAbcam, Cambridge, MAпри хранении при -20 °°; C, избегайте повторного замораживания и размораживания
Immunol Staining Primary Antibody Dilution BufferBeyotimeP0103хранящийся при температуре 4° C
Cy3 меченый козий антикролик IgGBeyotimeA0516хранится при температуре -20 °°; C и защищать от света
Alexa Fluor 488- Меченый козийBeyotimeA0428хранить при температуре -20 °°; C и защитить от света
Anti-Mouse IgG 
12-луночная пластинаcorning3512
25 см2 колбаcorning 430639
Hoechst 33258BeyotimeC1018хранится при -20 ° C и защитить от света
Монтажный носительBeyotimeP0128хранится при температуре -20°°; C и защита от света
Световой микроскопНанкин Цзяннань Новая оптика КомпанияXD-202
Флуоресцентная микроскопияNikon80i
Усилитель мощности высокого напряженияНаправленная энергияPVX-4110
Источник питания постоянного токаSpellmanSL1200
Генератор функцийAligent 33521A
ОсциллографTektronixDPO3034
Высоковольтный пробникTektronixP6015A
, , ,

Ссылки

  1. Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414 (6859), 112-117 (2001).
  2. Rossi, F., Cattaneo, E. Neural stem cell therapy for neurological diseases: dreams and reality. Nature Reviews Neuroscience. 3 (5), 401-409 (2002).
  3. Graves, D. B. The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology. Journal of Physics D: Applied Physics. 45 (26), 263001(2012).
  4. Weltmann, K. D., von Woedtke, T. Plasma medicine-current state of research and medical application. Plasma Physics and Controlled Fusion. 59 (1), 014031(2017).
  5. Lloyd, G., et al. Gas Plasma: Medical Uses and Developments in Wound Care. Plasma Processes and Polymers. 7 (3-4), 194-211 (2010).
  6. Yousfi, M., Merbahi, N., Pathak, A., Eichwald, O. Low-temperature plasmas at atmospheric pressure: toward new pharmaceutical treatments in medicine. Fundamental & Clinical Pharmacology. 28 (2), 123-135 (2014).
  7. Xiong, Z., Roe, J., Grammer, T. C., Graves, D. B. Plasma Treatment of Onychomycosis. Plasma Processes and Polymers. 13 (6), 588-597 (2016).
  8. Xiong, Z., et al. Selective neuronal differentiation of neural stem cells induced by nanosecond microplasma agitation. Stem Cell Research. 12 (2), 387-399 (2014).
  9. Xie, Z., Zheng, Q., Guo, X., Yi, C., Wu, Y. Isolation, Culture and Identification of Neural Stem Cells in New-born Rats. Journal of Huazhong University of Science and Technology. [Med Sci]. 23 (2), 75-78 (2003).
  10. Ryder, E. F., Snyder, E. Y., Cepko, C. L. Establishment and characterization of multipotent neural cell lines using retrovirus vector-mediated oncogene transfer. Journal of Neurobiology. 21 (2), 356-375 (1990).
  11. Snyder, E. Y., Taylor, R. M., Wolfe, J. H. Neural progenitor cell engraftment corrects lysosomal storage throughout the MRS VII mouse brain. Nature. 374 (6520), 367-370 (1995).
  12. Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (21), 11663-11668 (1997).
  13. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell Fixatives for Immunostaining. Methods in Molecular Biology. 588, 55-61 (2010).
  14. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of Cell Membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Нейральные стволовые клеткииммунофлуоресцентное окрашиваниефлуоресцентная микроскопияустройство плазменного струйного разрядабета-тубулин IIIэкспрессия нестинахолинергические нейронымоторные нейроны
Дифференциация стволовых клеток нерва по одношаговый атмосферной плазмы лечение в пробирке
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.